Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Karaktermultiscale Mekaniske egenskaper av hjernevev Bruke Atomic Force Microscopy, Impact Skår, og Rheometry

doi: 10.3791/54201 Published: September 6, 2016

Abstract

Å designe og ingeniør materialer inspirert av egenskapene i hjernen, enten for mekaniske simulants eller for vev gjenfødelse studier, må hjernevevet selv være godt preget på ulike lengde og tidsskalaer. Som mange andre biologisk vev, oppviser hjernevev et kompleks, hierarkisk struktur. Men i motsetning til de fleste andre vev, er hjerne av meget lave mekaniske stivhet, med Youngs elastisitetsmoduler E i størrelsesorden av 100s av Pa. Denne lave stivhet kan by på utfordringer til eksperimentell karakterisering av viktige mekaniske egenskaper. Her viser vi flere mekaniske karakterisering teknikker som er tilpasset for å måle de elastiske og viskoelastiske egenskaper hydrert, kompatible biologiske materialer som hjernevev, på ulike lengdeskalaer og laste priser. På mikroskala, gjennomfører vi krype-compliance og kraft avslapping eksperimenter med atommikroskop-aktivert innrykk. På mesosCale, utfører vi konsekvensinnrykks eksperimenter ved hjelp av en pendel-baserte instrumentert indenter. På makro utfører vi parallell plate rheometri å kvantifisere frekvensen avhengig skjærelastisitetsmoduler. Vi diskuterer også de utfordringer og begrensninger knyttet til hver metode. Sammen disse teknikkene gjør at en grundig mekanisk karakterisering av hjernevev som kan brukes til å bedre forstå strukturen i hjernen og til ingeniør bio-inspirert materiale.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De fleste myke vev som omfatter biologiske organer er mekanisk og strukturelt komplekse, av lav stivhet i forhold til mineralisert ben eller konstruerte materialer, og oppviser ikke-lineær og tidsavhengig deformasjon. Sammenlignet med andre vev i kroppen, er hjernevev bemerkelsesverdig kompatibel med elastisitetsmoduler E på rekkefølgen av 100s av Pa en. Hjernevev viser strukturell heterogenitet med distinkt og interdigitated grå og hvit substans regioner som også skiller seg funksjonelt. Forståelse hjernevev mekanikk skal hjelpe til i utformingen av materialer og beregningsmodeller for å etterligne responsen i hjernen under skade, lette prediksjon av mekanisk skade, og muliggjøre konstruksjon av beskyttelsesstrategier. I tillegg kan slik informasjon anvendes for å vurdere konstruksjons mål for regenerering av vev, og for bedre å forstå strukturelle endringer i hjernevevet som er forbundet med sykdommer så som multippel sklerose og autisme. Here, vi beskrive og demonstrere flere eksperimentelle tilnærminger som er tilgjengelige for å karakterisere de viskoelastiske egenskapene for mekanisk kompatible vev innbefattende hjernevevet, på mikro-, meso- og makroskala.

På mikroskala, gjennomførte vi krype-compliance og tvinge avslapping eksperimenter ved hjelp av atommikroskop (AFM) -aktiverte innrykk. Vanligvis er AFM-aktivert skår som brukes til å estimere elastisitetsmodulen (eller momentant stivhet) av en prøve 2-4. Imidlertid kan det samme instrumentet også brukes til å måle mikro viskoelastisk (tids- eller hastighetsavhengig) egenskaper 5-10. Prinsippet for disse forsøkene, vist i figur 1, er å rykke inn en AFM utkraget sonde inn i hjernevevet, opprettholde en bestemt størrelse av kraft eller hakk dybde, og måle de tilsvarende endringer i innrykk dybde og styrke, henholdsvis, over tid. Ved hjelp av disse dataene, kan vi beregne krype kompliance J C og avslapning modulus G R, henholdsvis.

På mesoskala, gjennomførte vi slaginnrykks eksperimenter i væskefylte forhold som opprettholder vev struktur og hydration nivåer, ved hjelp av en pendel-baserte instrumentert nanoindenter. Det eksperimentelle oppsettet er vist i figur 2. Da det Pendelen svinger i kontakt med vevet, sonden forskyvning blir registrert som en funksjon av tiden til den oscillerende pendelen kommer til å hvile i vevet. Fra den resulterende dempet harmonisk oscillerende bevegelse av sonden, kan vi beregne den maksimale penetreringsdybden x max, energi avledningskapasitet K, og dissipasjon kvalitetsfaktor Q (som er relatert til hastigheten av energispredning) av vevet 11,12.

Ved macroscale, anvendte vi en parallell plate-reometer for å kvantifisere den frekvensavhengige skjærelastisitetsmoduler,betegnet lagringsmodul G 'og tapsmodulen G ", av vevet. I denne type rheometri, pålegges en harmonisk vinkelformet stamme (og tilsvarende skjær stamme) ved kjente amplituder og frekvenser og måle reactional moment (og tilsvarende skjærspenning) som vist i figur 3. fra den resulterende amplitude og faseforsinkelse av det målte dreiemomentet og geometriske variabler i systemet, kan vi beregne G 'og G "i det anvendte frekvenser av interesse 13,14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Etikk Uttalelse: Alle forsøksprotokoller ble godkjent av forsøksdyrutvalget Committee of Boston Children Hospital og i samsvar med National Institutes of Health Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr.

1. Mouse hjernevev Anskaffelsesprosedyrer (for AFM-aktivert innrykk og innvirkning innrykk)

  1. Forbered en ketamin / xylazin blanding for å bedøve mus. Kombiner 5 ml ketamin (500 mg / ml), 1 ml xylazin (20 mg / ml) og 7 ml 0,9% saltoppløsning.
  2. Injisere mus (Rase: TSC1; Syn-Cre; PLP-EGFP, Alder: p21; Kjønn: Mann eller Kvinne) med 7 ul pr gram kroppsvekt av ketamin / xylazin løsning.
  3. Når musen er fullt bedøvet, som demonstrert av en manglende respons på tå og hale klyper, avlive musen ved halshogging bruke store disseksjon saks.
  4. Fjern skallen ved å kutte ned på midten ved hjelp av mindre disseksjon saks. Starter på lillehjernen, remove biter av skallen bruker buede tang. Etter å ha fjernet skallen, pakke hjernen ved hjelp av en flat spatel for å løfte hjernen, som starter på lillehjernen, og plassere hjernen på en petriskål. Fjern lillehjernen fra hjernen ved hjelp av et barberblad.
  5. Hvis du bruker en hel hjerne for slaginnrykks tester på frisk vev, overføre hjernen i en rundbunnet rør med CO 2-uavhengig næringsmedium for voksen nevrale vev på is og fortsett til punkt 4. Ellers fortsett til trinn 1.6 for å ha klippet prosedyrer.
  6. Juster vibratome innstillingene til en hastighet på 0,7 mm / sek, en vibrasjonsfrekvens på 70 Hz, og en skive tykkelse på 350 mikrometer. Omgir vibratome tallerken med is. Plasser en skvett av superlim på vibratome plate og monterings hjernen slik at koronale skiver kan kuttes, med hjernen orientert til å skjære gjennom ryggsiden først.
  7. Fyll vibratome fatet med nok Dulbeccos fosfatbufret saltløsning (DPBS) til bare senke hjernen. Hevparabolen på vibratome slik at bladet er bare nedsenket i DPBS.
  8. Trykk på start for å begynne å ha klippet koronale hjernen seksjoner 350 mikrometer tykt.
  9. Ved hjelp av pensler for å unngå skade på vev, overføre hjernesnitt fra vibratome DPBS badet og inn i en rundbunnet rør med CO 2-uavhengig næringsmedium for voksen nervevev på is og utføre målinger på friskt vev i løpet av 48 timer. Til å begynne AFM-aktivert skår eksperimenter, fortsett til punkt 3.

2. Pig hjernevev Anskaffelsesprosedyrer (for reologi)

  1. Skaff en sagittally skiver svin halv hjerne innenfor ~ 1 time på offer fra en lokal slakter. Plasser den halve hjernen i CO 2-uavhengig næringsmedium for voksen nevrale vev, og lagre på is.
  2. Bruk et barberblad eller skalpell til å lage en ~ 5 mm tykk koronale hjernen skive og lagre CO 2-uavhengig næringsmedium for voksen nevrale vev. Sørg for at stykket surface er så flat som mulig. Bruk forsiktig sideveis bevegelser med barberhøvel / skalpell under snitting.
  3. Oppbevares gris hjernevev i CO 2-uavhengig næringsmedium for voksen nevrale vev på is og utføre rheometri målinger (§ 5) på fersk vev innenfor 48 timer.

3. Atomic Force Microscope-aktivert Skår

  1. Forbered 60 mm diameter Petri (P60) retter med en musling-avledet bioadhesive i henhold til produsentens instruksjoner.
    1. Fremstille et lager av nøytral bufferoppløsning bestående av 0,1 M natriumbikarbonat i sterilt vann med en optimal pH på 8,0. Filter-sterilisere (0,2 mikron) natrium bikarbonat buffer og oppbevares ved 4 ° C.
    2. I en laminær strømningshette, blande en oppløsning av 6,25% musling-avledet bio-klebemiddel og 3,125% NaOH i natrium bikarbonatbuffer.
    3. Pipetter 100 ul av bio-lim løsning fra 3.1.2 til en 60 mm diameter Petri (P60) tallerken og bruk pipette til å spre solution inn en 3-5 cm diameter sirkel.
    4. La P60 retter avdekket i laminær hette og la løsningen tørke (~ 30 min). Vask-1x med PBS og 2 ganger med sterilt vann. La retter lufttørke i laminær hette og oppbevar i en forseglet plastpose ved 4 ° C i opptil en måned.
  2. Kalibrer AFM og oppsett hjerneprøve i AFM.
    MERK: Følg AFM kalibreringsinstruksjoner som per produsent.
    1. laste nøye en AFM sonde med en nominell våren konstant på 0,03 N / m og en 20 mikrometer diameter borosilicate perle i sonden holderen.
    2. Kalibrere fjærkonstanten og inverse optisk spak følsomhet (InvOLS) av AFM cantilever hjelp av termisk tune metoden 15,16.
      MERK: Etter at fjærkonstant for en AFM sonde beregnes, bør den forbli konstant med gjentatt bruk. Imidlertid vil de utkragende InvOLS må kalibreres på nytt hver gang laseren er realigned med utkragingen. I tillegg kalibreringskal utføres mot et substrat flere størrelsesorden stivere enn den konsoll, slik som polystyren.
    3. Slå på scenen montert varmeapparat og sette temperaturen til 37 ° C.
    4. Monter hjernen skive på P60 retter tilberedt i avsnitt 3.1.
      1. Forsiktig helle en 350 um tykk skive hjernen, så vel som CO 2-uavhengig medium fra rundkolben inn i en P60 tallerken belagt med den musling-avledet bioadhesiv.
      2. Ved å forsiktig vippe P60 fatet, plasserer hjernen skive i midten av fatet. Om nødvendig, sakte pipette medium fra en manuell pipetter å brette en hjerne skive som har kastet over på seg selv eller bedre posisjon hjernen skive i midten av fatet.
      3. fjerne overflødig media forsiktig med en P1000 pipetter (ikke bruk vakuum).
      4. Plasser dekslet på P60 fatet og la hjernen skive holder seg i 20 min.
    5. Ta av AFM hodet, plasserer hjernen skive montert i P60oppvask på AFM scenen, og legge til ~ 2 ml forvarmet CO 2-uavhengig medium.
    6. legge til omhyggelig en dråpe av mediet til AFM sonden for å beskytte det fra å bryte på grunn av overflatespenningen når det senkes inn i mediet som omgir hjernen skive.
    7. Flytt AFM hodet på scenen, og begynne å senke hodet til den er neddykket i media.
    8. Bruke topp-view CCD-kamera, flytte laseren på cantilever.
      MERK: justeringen av laseren på cantilever vil ha forandret noe på grunn av forskjellen i brytningsindeksen for luft og medium.
    9. Vent 5 min for cantilever å venne seg til å bli nedsenket i en varm væske, tilbakestiller speil justering til en gratis nedbøyning fra 0 V.
    10. Kjør en termisk spektrum på AFM sonde i henhold til produsentens instruksjoner 16. Bruk tilpasning av den første termiske topp å beregne en AFM sondens InvOLS i media.
    11. Bruke den optiske mikroskop,bevege prøvetrinnet slik at hjernen området av interesse under AFM sonden.
      MERK: corpus callosum vises mørkt som det er mer dekkende enn den omkringliggende grå materie. Den cortex er overlegen corpus callosum.
    12. Tilbake speilet justering til en gratis nedbøyning fra 0 V.
    13. På Sum og avbøyning Meter i AFM programvaren, klikk på "Engage" å engasjere AFM hodet.
    14. Bruke posisjon skiven på AFM hodet, senke hodet til kontakt mellom cantilever og prøven er gjort.
  3. (Valgfritt) Hvis du vil, måle elastisk modulus av prøven, som beskrevet tidligere 4,17,18.
  4. Gjennomføre kryp overholdelse eksperimenter.
    1. Konstruer en anvendt kraft funksjon i programvaren funksjon redaktør. Den kraft som funksjon består av en 0,1 sek rampe til et innstillingspunkt på 5 Nn og hold den der i 20 sekunder, etterfulgt av en 1 sek rampe ned til en påført kraft fra 0 Nn.
      1. På Innrykk Master PAnel, under innrykk metode, velg "Load" for Indenter Mode; "N" for enheter; og "Function redaktør" for Indenter funksjon.
      2. I funksjonen redaktør, på Segment Parms Panel, skape en anvendt kraft funksjon segment som starter på 0 Nn, ender på 5 Nn, med en tid på 0,1 sekunder. Klikk "Sett inn ->".
      3. For neste segment, satt begynne å 5 Nn, ende til 5 Nn, og tid til 20 sek. Klikk "Sett inn ->".
      4. For det siste segmentet, satt begynne å 5 Nn, ende til 0 Nn, og tid til 1 sek. Klikk "Tegn" og lukke Funksjon Editor vinduet.
    2. På Force Tab av Master Panel, sjekk "indenter ramp etter trigger" og sette den påførte kraften funksjon for å utløse etter å ha nådd et triggerpunkt på 0,1 V.
    3. Klikk "Single Force" på bunnen av Force Tab av Master Panel, som vil utløse den konstruerte-påførte kraften funksjon for creep etterlevelse.
    4. Etterenkelt kraft innrykk er ferdig, heve AFM hodet slik at den er ute av kontakt med prøven og deretter re-engasjere hodet og re-null fri nedbøyning.
    5. Flytt prøven scenen for å finne et nytt område av interesse, og senk AFM hodet til å ta kontakt. MERK: AFM hode må trekkes tilbake fra prøveoverflaten når prøven scenen flyttes. Unnlatelse av å gjøre dette kan føre til skade på den skjøre AFM cantilever.
    6. Gjenta trinn 3.4.3-3.4.5 inntil ønsket mengde data har blitt samlet inn.
  5. Gjennomføre kraft avslapping eksperimenter.
    1. Konstruer en anvendt innrykk funksjon i programvaren funksjon redaktør. Innrykket funksjon består av en 0,1 sek rampe til et innstillingspunkt på 3 um og hold den der i 20 sekunder, etterfulgt av en 1 sek rampe ned til en dybde av fordypningen 0 um.
      1. På Innrykk Master Panel, under innrykk metode, velg "Innrykk" for Indenter Mode; "M" for enheter; og "; Funksjon redaktør "for Indenter funksjon.
      2. I funksjonen redaktør, på Segment Parms Panel, skape en anvendt kraft funksjon segment som starter på 0 mikrometer, ender på tre mikrometer, med en tid på 0,1 sekunder. Klikk "Sett inn ->".
      3. For neste segment, satt begynner å tre mikrometer, slutt på tre mikrometer, og tid til 20 sek. Klikk "Sett inn ->".
      4. For det siste segmentet, setter begynner å tre mikrometer, ende til 0 nm, og tid til 1 sek. Klikk "Tegn" og lukke Funksjon Editor vinduet.
    2. På Force Tab av Master Panel, sjekk "indenter ramp etter trigger" og sette den påførte kraften funksjon for å utløse etter å ha nådd et triggerpunkt på 0,1 V.
    3. Klikk "Single Force" på bunnen av Force Tab av Master Panel, som vil utløse den konstruerte-anvendt innrykk funksjon for kraft avslapning.
    4. Etter at den eneste kraft innrykk er ferdig, hever AFM hodet slik at den erut av kontakt med prøven og deretter på nytt i inngrep med hodet og re-null avbøyning.
    5. Flytt scenen for å finne et nytt område av interesse, og senke hodet for å ta kontakt.
    6. Gjenta trinn 5,3-5,5 inntil ønsket mengde data er samlet inn.
  6. Avslutt eksperimenter og opprydding.
    1. Etter avsluttende eksperimenter, heve AFM hodet og fjerne det fra utvalget.
    2. Bruk en lab vev for å fjerne overflødig væske forsiktig uten å berøre cantilever.
    3. rengjøre AFM cantilever holderen forsiktig med en liten mengde etanol. Ikke utsett delikat elektronikk på cantilever holder til etanol. Fjern AFM cantilever og plasser i en lagringsbeholder.
    4. Kast hjernen vevsprøve ved å følge egnede biologisk protokoller.
  7. Ved hjelp av MATLAB, beregne krype etterlevelse og tvinge avslapping moduler ved hjelp av indenter geometri, ifølge løsningen avledet av Lee og Radok, 1960 19.
    1. Beregn kraften F og innrykk dybde ligning 1 fra data på cantilever posisjon z, deflection d og fjærkonstanten, k c

      ligning 1 og ligning 1 .
    2. Finn kontaktpunkt langs innrykk kurve ved hjelp av algoritmen beskrevet i Lin et al. 20.
    3. Definer et vindu av interesse for dataanalyse. Vinduet av interesse er den regionen hvor enten kraft (for creep compliance) eller innrykk dybde (for kraft avslapping) holdes på et punktverdi (dvs. Region 3 som vist i figur 1C, D).
    4. For krype samsvar eksperimenter, beregne den eksperimentelle krype samsvar modulus, J c (t), som reaksjon på et trinn belastningn 1 "src =" / files / ftp_upload / 54201 / 54201eq4.jpg "/>:
      ligning 1 ,
      hvor H (t) er den Heavyside trinnfunksjon, og R er radien av den kuleformede sonden.
    5. For avslapnings kraft eksperimenter, beregne den eksperimentelle kraft avslapping modul, G R (t), som reaksjon på et trinn innrykk dybde ligning 1 :
      ligning 1 .

4. Impact Innrykk

  1. Kalibrer instrumentert nanoindenter og justere standardinnstillingene for å aktivere de dynamiske slag eksperimenter på hydrerte hjernevev i henhold til produsentens instruksjoner.
    1. Monter en sfærisk probe ved å skyve den på pendelen bruker pinsett.
    2. Lim et smeltet kvarts prøve på prøven innlegget, som er skrudd inn i translasjonellescene.
    3. Gå til kalibreringsmenyen og velg "Liquid Cell." Følg programvarens instruksjoner for å få kontakt med smeltet kvarts prøven.
    4. Velg "Normal" for Indenter Type og bruker standardverdien på 0,05 mN for Indenter Load. Klikk "Fortsett" for å utføre kalibreringen for normal indenter konfigurasjon.
    5. Bevege prøvetrinnet tilbake av minst 5 mm. Montere vektarmen, som tillater sonden å bli senket ned i den flytende cellen, og gjenta den flytende celle kalibrering i den nye konfigurasjonen ved å velge "Liquid Cell" for Indenter type. Klikk "Fortsett" for å få den flytende Cell kalibreringsfaktor.
    6. Aktiver Flytende Cell programvarealternativ ved å gå til Experiment-menyen og velge "Spesialalternativer." Bruk den nyeste kalibreringsverdien.
    7. Øke kondensatoren platen avstanden da dette vil føre til en større maksimal målbar dybde, noe som er nødvendig ved testing highly kompatible materialer.
      1. Under System-menyen, velg "Non Beskyttede Innstillinger" og "Maskinparameters" for å endre pendelen prøvelasten rente, null belastning rente, og standby rampe utlignet til 0,5 mN / sek, 0,1 mN / sek, og 3 V, henholdsvis.
      2. Med en skiftenøkkel, slår de tre nøtter som styrer kondensatoren plate avstanden klokken i små trinn.
      3. Etter hver komplett med klokken igjen, velg "Bridge Box Adjustment" under menyen Vedlikehold og få en god pendel test, noe som vil kreve flytting av motvekt vekt bort fra pendelen.
      4. Gjenta trinn 4.1.7.2-4.1.7.3 til den omtrentlige dybden kalibrerings leser en verdi av 70 000 nm / V eller høyere.
    8. Plasser en ny grense stopp på bunnen av pendelen som kan slås av og på via en strømforsyning. Trekk den opprinnelige anslaget sitter bak pendelen til å fjerne en potensiell hindring av pendelbevegelse og gir mulighet for høyereanslagshastigheter samt høyere penetrasjonsdybder til kompatible prøver.
    9. La skapet for å nå termisk likevekt (tar ca 1 time).
    10. Mens skapet likevekt, gå tilbake til System-menyen og velg "Non Beskyttede Innstillinger" og "maskinparametre." Angi dybden kalibrering (dcal) kontakt hastigheten til en mikrometer / sek, primær innrykk kontakt hastighet til tre mikrometer / sek, og ultra lav belastning kontakt hastighet til en mikrometer / sek.
    11. Under Kalibrerings menyen, utføre en standard dybde kalibrering i denne nye konfigurasjonen.
    12. Slå på strømforsyningen for magnet og sett den til 10 V. Gå til Experiment menyen og velg "Impact" og "Juster Impulse Displacement." Følg bruksanvisningen for programvaren (automatiske ledetekster) for å kalibrere swing avstand av pendelen.
  2. Monter musehjernevevet i væsken cellen.
    1. Etter høsting hele hjernen fra step 1,5, lagre den umiddelbart i CO 2-uavhengig næringsmedium for voksen nervevev media på is.
    2. Når virkningen innrykk oppsettet er helt komplett, overføre nøye hjernen i en petriskål sammen med CO 2-uavhengig medium. Skjær hjernen til 6 mm tykke seksjoner med flate overflater på hver side.
    3. Følge skiver vev til aluminiums prøven stolpe med et tynt lag av cyanoacrylate lim.
    4. Skyv den flytende celle over andre O-ring på prøven innlegget, og fylle den flytende celle med 5 ml av CO 2-uavhengig medium å fordype vevet. Denne prøven innlegget er så nøye montert på translasjonsforskning scenen inne i instrument nanoindenter.
  3. Måle effekten responsen i hjernevev.
    1. Hvis det er nødvendig, fjerne den sfæriske sonden og erstatte den med sonden av interesse uten å fjerne hevarmen.
    2. Under System menyen, velg "Non BeskyttetInnstillinger "og" maskinparametre. "Endre den primære effekten kontakthastighet til 5 mikrometer / sek.
    3. Med prøven bad lav (-z-retningen) og langt borte fra pendelen (+ x-retningen), bevege seg i den retning -x til spissen på hevarmen er riktig plassert over badet. Bevege seg i + z-retningen inntil spissen er helt nedsenket i badet og i front av prøven.
    4. Bruke scenen kontrollvinduet prøven, ta kontakt nøye og deretter tilbake på scenen bort fra prøven overflaten med ca 30 mikrometer.
    5. Under forsøket menyen, klikk på "Impact" for å sette opp en innvirkning eksperiment. Velg et bestemt impuls belastning som vil forholde seg direkte til den resulterende innvirkning hastigheten basert på swing avstand kalibrering. Kjør den planlagte forsøket.
    6. Når pendelen svinger tilbake og prøven overflaten fortsetter å flytte til målingen flyet, slår bunn anslag avslåing.
    7. Observer som pendelen svinger forward å påvirke prøven. Forskyvningen av sonden som en funksjon av tiden vil bli registrert av programvaren.
    8. Når xyz scenen vises, slår anslaget bryter.
    9. Gjenta trinn 3,4-3,8 å teste så mange ulike belastninger og steder etter behov.
  4. Analyser ervervet forskyvning mot tid respons av pendelen ved hjelp av tilpassede MATLAB skript for å bestemme den maksimale inntrengningsdybde x max, energi avledningskapasitet K, og utskeielser kvalitetsfaktor Q. 11
    1. Gå til analyse menyen og eksportere data i en tekstfil.
    2. Ta den tidsderiverte av forskyvningen profil for å oppnå hastighet som en funksjon av tid. Sett null forskyvning som kontaktpunkt x o1.
      MERK: Impact hastighet v i er den maksimale hastighet umiddelbart før kontakt x max tilsvarer deformasjonen ved hvilken sonden.hastighet først avtar til null. x o2, som er ekvivalent med x r, er den stilling som kreves for å gjenoppta kontakt med den deformerte prøven i den neste syklus. Rebound hastigheten v ut er hastigheten på forskyvning x r.
    3. Definere K (dimensjonsløs) som den energi som forbrukes av prøven normalisert med summen av de gjenvunnede og oppløste prøve energi i løpet av den første slagsyklusen. Beregn K basert på de iboende egenskapene til pendelen 21 (slik som rotasjonsstivheten og dempningskoeffisient), x o1, x max, x r, v i, og v ut.
      MERK: For mer informasjon, kan man ta kontakt med arbeidet til Kalcioglu et al, 2011..
    4. Siden forskyvning kan beskrives som en dempet harmonisk oscillerende bevegelse, passer en eksponensiell funksjon til maksima av displassering vs. tidskurven.
    5. Beregn Q (dimensjonsløs) som π multiplisert med antall cykler som kreves for svingning amplitude reduseres med en faktor på f.eks. En høyere Q verdi betyr et lavere energispredning rate.

5. Reologi

  1. Oppsett og kalibrere reometer i henhold til produsentens anvisninger.
    1. Initialisere rheometer ved å åpne enheten / kontrollpanelet. I kategorien kontrollpanelet, klikk på "initialisere".
    2. Monter 25 mm diameter-måleplaten (PP25) og det termiske systemet.
    3. (Valgfritt) For å redusere slip mellom rheometer plater og vevet, kuttet ut selvklebende sandpapir skiver som samsvarer med formen på topp rheometer plate og holder sandpapir til toppen og bunnplaten.
    4. Ta kontakt mellom topp og bunnplaten ved å klikke på "set null gap" på kontrollpanelet.
    5. Null normalkraften Giver clicking "reset normal kraft."
    6. Gjennomføre en treghet test ved å åpne fanen tjeneste på kontrollpanelet, klikke på "målesystem", og deretter klikke på "treghet test". Spill den gamle og nye treghet. Kontroller at treghet er innenfor den tillatte grensen for sonden, som er oppført av produsenten.
  2. Load prøven i rheometer.
    1. Etter høsting vev og ha klippet en koronale delen av gris hjernen til ~ 5 mm tykkelse, lagre den på is i CO 2-uavhengig medium.
    2. Plasser hjernen mellom de to platene. Fjerne store vanndråper fra den øvre og nedre overflate av prøven for å forhindre glidning, men ikke tørke ut prøven.
    3. Senk måleplaten inntil platen er i full kontakt med den øvre overflate av vevet, og den målte normalkraften er konsistent 0.01 mN etter en 5-10 min avkobling periode.
      1. I kontrollpanelet angir en lavere høyder in måleposisjon boksen og klikk "måling posisjon" for å sakte senke måleplaten.
      2. Når i løpet av en millimeter for kontakt med vev, senke måleplaten i trinn på 0.1 mm inntil platen er helt i kontakt med den øvre overflate av vevet. Pass på at den målte normalkraften er jevnt 0.01 mN etter en 5-10 min avslapping periode.
      3. Spill initial målt normal kraft. Gjentatte målinger bør tas på samme trykkspenninger / stammer.
    4. Trimme prøven med et plastblad hvis prøven overskrider diameteren av platen. Pipetter et lite volum (~ 1-2 ml) av media på kantene av prøven for å hydratisere vev.
    5. (Valgfritt) Senk varmevifte. På kontrollpanelet, sett temperaturen til 37 ° C, og klikk "set".
  3. Utføre en amplitude feie for å etablere den lineærviskoelastiske utvalg av materialet (dvs. skjær-stammer hvor G 'og G' 'er konstante) ved frekvenser av interesse (for eksempel 1 rad / sek).
    1. Velg "file / new". Under fanen gel velg "Amplitude sweep: LVE-serien." Velg vinduet og klikk "Measurement. 1: Amplitude sweep" Dobbeltklikk på pendling boksen. Skriv inn første og siste belastning (for eksempel 0,01 til 105), frekvens (f.eks en rad / sek) og antall poeng per tiår (f.eks 6 poeng / desember). Velg "OK" og klikk start. "
    2. Gjenta denne fremgangsmåten for flere stykker med gjentatte forsøk for å sikre konsistens av den lineære elastiske område. Den aksiale kompresjon av prøven bør forbli konstant mellom prøvene.
  4. Gjennomfører et frekvenssveip av vevet ved en belastning i den lineære viskoelastiske området av vev (f.eks, 1% belastning) 22, og med en frekvens som er av interesse (for eksempel 0,1 til 100 rad / sek).
    1. Klikk "File / nye" og under fanen gel velg "Frequency sweep". Klikk vindu / Måling 1: Frekvens feie. Dobbeltklikk på pendling boksen. Skriv inn frekvensområdet (f.eks 0,1 til 100 rad / sek), belastningen (f.eks 1% belastning) og antall poeng per tiår (f.eks 6 poeng / desember). Velg "OK" og klikk "start" for å starte frekvenssveip.
  5. Gjenta frekvens sweep (trinn 5.4) i duplikater eller tre paralleller.
  6. Gjennomgå data som blir automatisk beregnet og eksporteres av rheometer: G 'og G "som en funksjon av frekvens (frekvens sweep) eller skjær stamme (amplitude sweep). MERK: G' og G '' er beregnet ut fra prøvens (maks ) reactional dreiemoment amplitude T '0, og rotasjons forskyvning vinkel (eller deflection vinkel) ligning 1 Og faseforsinkelseLigning 1 "src =" / files / ftp_upload / 54201 / 54201eq9.jpg "/>, av prøven reaksjon på den anvendte svingnings stamme (figur 3):
    ligning 1
    ligning 1
    der R og h er radien og høyden av prøven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figur 4 viser representative innrykk og kraft vs. gang svar (figur 4B, E) for creep etterlevelse og tvinge avslapping eksperimenter, gitt en anvendt kraft eller innrykk dybde (figur 4A, D), henholdsvis. Ved hjelp av disse data og geometrien i systemet, kan krype samsvar J c (t) og tvinge avslapping moduler G R (t) beregnes for forskjellige regioner av hjernen (figur 4C, F). Mens tidligere studier har vist en forskjell mellom elastisitetsmodulene forskjellige områder av hjernen 23, de viskoelastiske egenskaper målt på denne måten for mus hjernen vevssnitt viser ikke interregional variasjon innenfor et gitt vev skive.

Impact innrykk måler de mekaniske egenskapene til vev ved høy forekomst av romlig og tidsmessig konsented lasting. Resultatene av disse forsøk gir informasjon om hvordan vev forsvinner energi i respons til traumatiske skader eller tilsiktet deformasjon i forbindelse med kirurgi. Den dempet svingebevegelse av slag innrykk sonden (figur 2B) tilveiebringer informasjon for å beregne den maksimale inntrengningsdybden x max (figur 5A), energi avledningskapasitet K (figur 5B) og energiavgivelse hastigheten Q (figur 5C) i vevet. Inntrengningsdybde måler deformasjon motstand, som sterkt korrelerer med vevets elastisitetsmodul: stivere vev utviser mindre penetreringsdybde for en gitt effekt hastighet og anslagsenergi. Energi avledningskapasitet er en dimensjonsløs mål på i hvilken grad det vev forsvinner slagenergi i løpet av den første slagsyklusen. Spredning kvalitetsfaktor måler hvor mange sykluser skje før svingningene fra jegMpact dempes betraktelig - dette er relatert direkte til frekvensen av energi utskeielser, selv om dette ikke er uttrykt i tidsenheter. Disse tre støtresponsparametre kan kvantifiseres ved ulike anslagshastigheter, noe som gir et middel til å studere den hastighetsavhengige egenskaper av vev.

Figur 6 viser makro G 'og G "for frekvenser fra 0,1 rad / sek til 50 rad / sek. Lagringsmodulen er nesten en størrelsesorden større enn tapsmodulen ved lave frekvenser. Imidlertid er forholdet mellom lagrings- og tapsmoduler avtar når frekvensen øker. Dette tyder på at elastiske egenskaper dominere oppførselen av hjernevev, ettersom lagringsmodulen beskriver elastiske egenskaper og tapsmodulen beskriver viskøse tap av materiale. Ved et tilstrekkelig høyt innhold frekvens, vil lagrings- og tapsmoduler likestille, indikerer det punkt ved hvilketmaterialet begynner å flyte (dvs. viskøse egenskaper dominerer oppførsel av prøven). For tilfelle av hjernevev målt som illustrert her, har fysiske begrensninger av instrumenteringen ikke tillate oss å måle materialegenskaper ved høyere frekvenser.

Figur 1
Figur 1. Illustrasjon av AFM-aktivert krype compliance og tvinger avslapping eksperimenter. (A) AFM-aktivert innrykk er utført ved en fleksibel cantilever med en sfærisk perle av nano- til mikro radius festet til den frie ende. (B) Under hakk, blir cantilever nedbøyning måles ved hjelp av en laser som reflekteres av enden av braket og inn på en fotodiode. (C) Force avslapping eksperimentene er utført av innrykk cantilever til en konstant anvendt dybde, mens kraften forfall med respector til tid måles. (D) Creep overholdelse tiltak skiftende innrykk dybden av cantilever med en konstant påført kraft. (C) og (D) er delt inn i fem regioner (grønn tekst): (1) Approach av AFM sonde til prøveoverflaten, (2) Kontakt med prøven og rampe opp til en nominell verdi innrykk / kraft, (3) vedlikehold av nominell verdi innrykk / kraft, (4) rampe ned og (5) tilbaketrekking av AFM sonde fra prøven overflaten. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Illustrasjon av konsekvens innrykk eksperimenter. (A) Skjematisk av påvirkning innrykk, illustrerer evnen til å utføre eksperimenter i fullt hydrert forhold. (B) Repres entative sonde forskyvning profil som en funksjon av tid oppsamlet fra et musehjerne skive og den tilsvarende hastighetsprofil. Key målte forskyvning og beregnede hastighet parametre som brukes for å kvantifisere energitapet er angitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Illustrasjon av parallelle plate reometer eksperimenter. (A) Skjematisk fremstilling av parallell plate rheometer eksperiment og definisjoner relatert til anvendt oscillerende skjær belastning. (B) Representative påført belastning og resulterende spenning som en funksjon av tid. Skjærlagringsmodul G 'og skjærtapsmodulen G "er beregnet via tøyningsamplitude54201 / 54201eq12.jpg "/>, dreiemoment amplitude T '0, faseforskyvning ligning 1 , Sonde og prøve radius R, og prøve høyde h. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Representative data fra krype etterlevelse og tvinger avslapping eksperimenter. (A, B) Fra rådata i figur 1, er en region av interesse definert for krype compliance som tiden hvor påførte kraften er konstant (A) mens innrykk dybde måles (B). Det innfelte i (A), viser data fra en mislykket eksperiment der AFM piezo var ute av standfor å opprettholde den påtrykte kraft, og det innfelte i (B) viser den tilsvarende skår respons, som er kvalitativt lik dataene på en vellykket eksperiment er vist i (B). (C) Med data fra den påførte kraft, målt hakk, og kunnskap om geometrien til sonden, er kryp samsvar J c (t) beregnet. (D, E) I kraft avslapning ligger skår dybde holdes konstant (D), mens kraft mot tid måles (E). (F) Ved hjelp av disse data, kan kraft avslapping modul G R (t) blir beregnet. Kryping compliance og tvinger avspennings eksperimenter kan bli gjennomført på anatomisk forskjellige regioner av hjernen, slik som corpus callosum (rød) og cortex (blå). Data i (C, F) er et gjennomsnitt av målingene fra n = 5 mus. Vennligst klikkk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Representative data fra innvirkning innrykk eksperimenter. Maksimal inntrengningsdybde x max, energi avledningskapasitet K, og utskeielser kvalitetsfaktor Q muse hjernevev beregnes fra rå fortrengning profiler oppnås ved forskjellige anslagshastigheter. Data er representert som gjennomsnitt ± standardavvik (n = 18 replikatmålinger per punkt). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. Representative data fra rheometri eksperimenter. Lagring G 'ogtap G '' moduler av fra koronale skiver av svin hjerner. Mengden tanδ beregnes som forholdet mellom tap for lagringsmodulen. Data er representert som gjennomsnitt ± standardavvik (n = 4 replikatmålinger per punkt). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hver teknikk presentert i denne artikkelen måler forskjellige fasetter av hjernevev mekaniske egenskaper. Creep compliance og stress avslapping modulene er et mål på tidsavhengige mekaniske egenskaper. Lagring og tap moduli representerer renteavhengige mekaniske egenskaper. Impact innrykk måler også hastighet avhengige mekaniske egenskaper, men i sammenheng med energispredning. Når karakterisere vev mekaniske egenskaper, både AFM-aktivert innrykk og reologi brukte metoder. AFM-aktiverte skår er spesielt nyttig fordi i tillegg til å gi tidsavhengige materialegenskaper, kan forskjellige eksperimentelle parametere brukes til å måle celle- og vev elastisitetsmodul 4 og til og med frekvensavhengige egenskaper 24, som beskrevet tidligere. Men nøyaktig tolkning av data og design av eksperimenter være utfordrende for kompatible hydrerte vev. Mens rheometri tiltak bulk riktigbånd av vevet, sonder AFM-aktivert innrykk mikroskala volumer som er relevante for cellenes mikromiljø. Virkning innrykk tilveiebringer et middel for å kvantifisere spesielt hvordan et materiale som deformeres i sammenheng med en konsentrert, dynamisk støtbelastninger, som er nyttig i anvendelser som studere traumatisk hjerneskade forårsaket av fokal effekt. Mens resultatene fra hver teknikk er ikke direkte sammenlignbare, energi ødsling egenskaper målt via innvirkning innrykk følge de samme trendene som skjærtapsmodulen målt via reologi, som beskrevet nedenfor.

I AFM-aktiverte innrykk av hjernevev illustrert her, målte vi viskoelastiske egenskaper ved hjelp krype etterlevelse og tvinge avslapping. På grunn av den lille målestokk av AFM sonden, kan denne teknikken måle mekaniske egenskaper for anatomisk forskjellige områder av hjernen, slik som de hvite og grå substans regioner av corpus callosum og cortex, henholdsvis (fig. 4

Vi fant at den viskoelastiske oppførsel av hjernevev målt på denne måte er kvalitativt lik tidligere rapporterte resultater ved Jones & Morrison 26. Mens omfanget av de målte verdiene for avslapning modulus ikke enig, dette er trolig på grunn av forskjellen i eksperimentelle forhold. Elkin & Morrison bruke en 250 mikrometer diameter flat punch, sammenlignet med vår 20 mikrometer diameter sfære. I tillegg Elkin & Morrison utføre målinger på hjernevev fra rotter, mens vi gjennomførte målinger på hjernevev hentet fra mus. Til tross for disse forskjellene, både teknikker Measfigurert heterogene mekaniske egenskaper innen hjernevevet, eller mer spesifikt, at hvit substans av corpus callosum viser en lavere avslapping modulus enn den grå materie av hjernebarken i den koronale flyet.

Det er viktig å merke seg at mens vi beregnet krype compliance og tvinge avspenningsmoduler som reaksjon på et anmodet trinn belastning eller trinn hakk, henholdsvis den eksperimentelt påført belastning og fordypningen er ikke ideelle (øyeblikkelige) trinnfunksjoner. Laster og fordypninger brukes over korte tidsskalaer (<1 sek), og disse laste historie kan påvirke den målte krype og avslapping svar 7,25. Nærmere bestemt, forutsatt en anvendt trinn innrykks resultatene i liten undervurdering av avslapning modulus, mens forutsatt en anvendt trinn last resulterer i svak overestimering av kryp compliance modulus. De avvik mellom faktiske og beregnede elastiske modulene vil avta etter hvert som rampe priserav de anvendte belastninger og innrykk økning.

Et viktig skritt i å gjennomføre last avslapping er å velge riktig størrelse på opprettholdt kraft (dvs. nominell verdi som tilsvarer fotodioden spenning som relaterer seg direkte til den påførte kraft). Børverdien kraft for kryping samsvar må velges slik at: (1) responsen er stor nok til å fremstille lett målbare forandringer i innrykk dybde; og (2) små nok til at fordypningen dybde som kreves for å opprettholde settpunktet kraften ikke blir så store at drive utenfor området av AFM piezoelektriske aktuator som modulerer den vertikale posisjonen til AFM cantilever basen. I presenterte protokollen, har vi foreslått en nominell verdi kraft av 5 Nn, som fungerte bra for vår eksperimentelle oppsett. Men hvis AFM piezo er ute av stand til å opprettholde den kraft på grunn av sin begrensede bevegelsesområdet (se fig. 4A, innfelt), denne verdien kan senkes. Dette eksperimentell problemet er ikke får eket med kraft avslapping eksperimenter som opprettholder en konstant, beregnet innrykk dybde gjennom en feedback loop.

I motsetning til den kvasi-statiske AFM-aktivert innrykk på nanoNewton (NN) skalere styrker og mikrometer-skala dybder, gjelder virkningen innrykk en konsentrert dynamisk belastning av Mn-skala styrker og måler prøven sin deformasjon svar på dybder som nærmer seg millimeter-skalaen. Vi har tidligere brukt innvirkning innrykk for å kvantifisere atferden til hjerte og lever 9,11,12, og observert en lignende avhengighet av energitapet respons på lasterate for vev fra disse organene.

Impact innrykk kan romme probe radier som spenner fra mikrometer til mm. I tillegg kan støtinnrykks eksperimenter gjennomføres i fullt nedsenket miljøer, som gjør det mulig for den mekaniske karakterisering av hydrerte vev 21. Ved testing svært kompatible prøver som hjernevev, important hensyn må tas i betraktning. Først, er den maksimale målbar dybde inn i materialet er omtrent 1 mm, en begrensning satt av lengdeskala på selve instrumentet; ytterligere pendel forskyvning vil bli fysisk stanset av kollisjonen mellom den elektromagnetiske spole plassert på toppen av pendelen og den stasjonære magnetplate. For hjernevev, begrenser dette den høyeste anslagshastigheten som med hell kan anvendes på ca. 5 mm / sek. Legg merke til at mens anslagshastigheter av størrelsesorden mm / s, de tilsvarende belastning energitettheten er av størrelsesorden kJ / m3, noe som nærmer seg ballistiske forhold, på grunn av de små dimensjoner av radien sonden 11. Sekund, kan det potensielt bli vanskelig for instrumentet å detektere kontakt mellom sonden og overflaten vev. Som prøvetrinnet reiser mot sonden, blir kontakt detektert når pendelen er skjøvet tilbake av den bevegelige prøven. Men for svært compt prøver, kan pendelen ikke bli avbøyet detekterbart mens sonden trenger inn i prøven.

For å løse dette problemet, kan vi øke hastigheten som prøven scenen beveger seg slik at det vil være et større momentum i kontakt for å kjøre pendelen tilbake. Prøven bør også være så flat som mulig, for ytterligere å minimalisere eventuelle feil i deteksjon av korrekt kontaktpunkt. Endelig oppmerksom på at støtbelastning er ikke en ekte impuls belastning, ved at den elektromagnetiske strøm ved pendelen toppen fortsetter å levere en pådriver for penetrasjon etter den første effekten hendelsen. Som et resultat av dette kan det oppstå siging spesielt ved de høyere belastningsforhold, noe som kompliserer analyse av energi ødsling egenskaper. Videre arbeid med denne teknikken kan involvere frakobling krype responsen fra virkningen responsen, å innføre en temperaturkontroll for å muliggjøre studier ved kroppstemperatur, og med visualisering av vevsprøve overflaten via et mikroskope kompatibelt med væsken cellen.

Rheometri måler frekvensavhengige mekaniske egenskaper av viskoelastiske faststoffer på makronivå. Skjær modul- komponenter, lagring G 'og taps G ", kan måles i frekvensområder vanligvis spenner 0,001-0,1 rad / sek til 10-100 rad / sek, avhengig av instrument, probe geometri, og prøve 13. For nøyaktig måling , en amplitude feie bør utføres før et frekvenssveip for å bestemme den lineære elastiske område av materialet, og dette er det området av stammen som G 'og G' 'er konstante 14,27 skjær~~POS=TRUNC belastning som velges for frekvensen. feie bør være så høyt som mulig innenfor det lineære viskoelastiske grense~~POS=HEADCOMP (typisk 1-2% skjærtøyningen), slik at tilstrekkelig moment er oppnådd i løpet av målingen. Dreiemomentet momentet~~POS=HEADCOMP under målingene bør alltid være i det tillatte området gitt av produsenten for å sikre såufficient signal til støyforhold.

I tillegg er det rheometri sonde som benyttes bør være så stor som mulig for å maksimere dreiemomentet, men må overlappe med prøven fullstendig 13. Ved fremstilling av prøve, bør vev oppdeles i skiver så flat som mulig for å minimalisere stress-gradienter ved kontakt opprettes mellom platene. Når kontakten er gjort med prøven, skal vevet ikke har noen vanndråper på den for å minimere slip på det grensesnittet. Imidlertid vevet også må ikke tørket ut før eller under målingen, da dette vil forringe vevet struktur 13. Vevet bør være fullt hydrert med media etter kontakt mellom begge platene. Lim, vanntett sandpapir kan også være knyttet til platene for å minimere slip 28. I tillegg har aksial kompresjon vist seg å endre størrelsen av G 'av hjernevev 29. Siden reologi prøver er vanligvis tynne (~ 5 mm), små endringer i høyden (~ 500um) kan produsere store kompresjons stammer (for eksempel, ~ 10%), og derfor betydelige endringer i skjærmodulen. Videre, ettersom prøven er viskoelastisk, vil materialet gjennomgå spenningsrelaksasjon på grunn av aksial kompresjon 28, noe som kan påvirke målingene. Således bør gjentatte målinger utføres på lignende drifts aksiale belastninger, og prøven bør få lov til å slappe av (for eksempel, 5-10 min) før måling. Feil i forbindelse med disse fenomenene er en begrensning av teknikken. Andre begrensninger rheometri inkluderer antagelsen om at materialet er homogent og isotropt, som ofte ikke er sant i vevsprøver 13. I tillegg, bør temperaturen holdes ved fysiologiske betingelser som det vil påvirke G 'og G "22. I hjernevev bestemt er høyere temperatur er vist å redusere både G' og G '' beskjedent uten å endre power law Behavior med frekvens, og dermed følgende tid-temperaturlagring hoved 22,30. Våre data er i god overensstemmelse med tidligere studier 22,27 i porcine hjernen, som observert tilsvarende størrelser av G 'og G' ', i tillegg til en svak power law frekvensavhengighet i både G' og G ".

Den kalkulerte forholdet tanδ = G "/ G '(Fig. 6) gir en grunnlag for sammenligning mellom rheometri og innvirkning innrykk. I innvirkning innrykk, fant vi at hjernevev energi avledningskapasitet økte med økt laste priser. Bruke rheometri, fant vi at som frekvens økes, økes også tanδ. med andre ord, materialet var mer spredende ved høyere frekvenser. i tillegg, mens virkningen innrykks målingene ikke kvantifisere en elastisitetsmodul direkte, det penetreringsdybde x max reduseres direkte med increasing elastisk modulus.

Sammen metodene beskrevet i dette dokumentet muliggjøre mekanisk karakterisering av hjernevev på mikro-, meso- og makrolengdeskalaer, og ved forskjellige belastningsgrader. Metodene som er presentert heri, kan brukes på en rekke kompatible materialer, inkludert både biologisk vev og konstruert hydrogeler. Med en grundig forståelse av Multiscale viskoelastiske egenskaper hjernevev, kan vi bedre design materialer konstruert for å etterligne den mekaniske responsen i hjernen. Disse vev simulant materialer kan lette prediksjon av mekaniske skader og prosjektering av beskyttelsesstrategier. I tillegg kan materialegenskapene hjerne benyttes til å konstruere bioinspired materialer for in vitro og in vivo studier for å få en bedre forståelse vekst og tilkobling av celler i sentralnervesystemet, spesielt i lys av nevrologiske sykdommer som autisme og multippel sklerose.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xylazine Lloyd Laboratoried perscription drug
Ketamine AnaSed Injections perscription drug
Vibratome (Vibrating blade microtome) Leica VT1200
Hibernate-A Medium Gibco A1247501 CO2-independent neural medium for adult tissue
Atomic Force Microscope, MFP-3D-BIO Asylum Research -
Petri Dish Heater Asylum Research -
AFM Probe, 0.03 N/m, 10 µm radius borosilicate sphere Novascan PT.GS
Cell-Tak Corning 354240 mussel-derived bioadhesive
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 alternate suppliers can be used
Sodium Hydroxide, 1 N Sigma-Aldrich 59223C alternate suppliers can be used
Instrumented Indenter, NanoTest Vantage Micro Materials Ltd. - probe tip needs to be machined (steel flat punch, 1 mm diameter, 4-5 mm length)
NanoTest Liquid Cell Micro Materials Ltd. -
Parallel Plate Rheometer MCR501 Anton-Parr -
PP25  Anton-Parr - 25 mm diameter flat measurement plate
Adhesive Sandpaper McMaster-Carr 4184A48 alternate suppliers can be used
Loctite 4013 Instant Adhesive Henkel 20268 alternate suppliers can be used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Dommelen, J. A. W., Hrapko, M., Peters, G. W. M. Mechanical Properties of Brain Tissue: Characterisation and Constitutive Modelling. Mechanosensitivity of the Nervous System. 249-281 (2009).
  2. Liu, F., Tschumperlin, D. J. Micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (54), e2911 (2011).
  3. Peaucelle, A. AFM-based mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments. (89), e51317 (2014).
  4. Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497 (2013).
  5. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Vivanco, M. dM., Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components. Nanotechnology. 21, 445101 (2010).
  6. Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. Creep function of a single living cell. Biophysical Journal. 88, (3), 2224-2233 (2005).
  7. Lu, H., Wang, B., Ma, J., Huang, G., Viswanathan, H. Measurement of creep compliance of solid polymers by nanoindentation. Mechanics Time-Dependent Materials. 7, (3/4), 189-207 (2003).
  8. Cheng, L., Xia, X., Scriven, L. E., Gerberich, W. W. Spherical-tip indentation of viscoelastic material. Mechanics of Materials. 37, 213-226 (2005).
  9. Kalcioglu, Z., Qu, M., Van Vliet, Multiscale characterization of relaxation times of tissue surrogate gels and soft tissues. 7th Army Science Conference Proceedings. (2010).
  10. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Vivanco, M. D., Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation microscopy: Imaging local stress in cells. Journal of Biomechanics. 43, (2), 349-354 (2010).
  11. Kalcioglu, Z. I., Qu, M., et al. Dynamic impact indentation of hydrated biological tissues and tissue surrogate gels. Philosophical Magazine. 91, (7-9), 1339-1355 (2011).
  12. Kalcioglu, Z. I., Ra Mrozek, R. a, Mahmoodian, R., VanLandingham, M. R., Lenhart, J. L., Van Vliet, K. J. Tunable mechanical behavior of synthetic organogels as biofidelic tissue simulants. Journal of Biomechanics. 46, (9), 1583-1591 (2013).
  13. Janmey, P. A., Georges, P. C., Hvidt, S. Basic rheology for biologists. Methods in Cell Biology. 83, 3-27 (2007).
  14. Miller, K., Kurtcuoglu, V. Biomechanics of the Brain. Springer Science & Business Media. (2011).
  15. Lévy, R., Maaloum, M. Measuring the spring constant of atomic force microscope cantilevers: thermal fluctuations and other methods. Nanotechnology. 13, (1), 33-37 (2002).
  16. Fuierer, R. Basic Operation Procedures for the Asylum Research MFP-3D Atomic Force Microscope. MFP-3D Procedureal Operation "Manualette". Asylum Research. (2006).
  17. Elkin, B. S., Ilankovan, A., Morrison, B. Age-dependent regional mechanical properties of the rat hippocampus and cortex. Journal of Biomechanical Engineering. 132, 011010 (2010).
  18. Elkin, B. S., Azeloglu, E. U., Costa, K. D., Morrison, B. Mechanical heterogeneity of the rat hippocampus measured by atomic force microscope indentation. Journal of Neurotrauma. 24, (5), 812-822 (2007).
  19. Lee, E. H., Radok, J. R. M. The Contact Problem for Visooelastic Bodies. Journal of Applied Mechanics. 27, (3), 438-444 (1960).
  20. Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129, (3), 430-440 (2007).
  21. Constantinides, G., Kalcioglu, Z. I., McFarland, M., Smith, J. F., Van Vliet, K. J. Probing mechanical properties of fully hydrated gels and biological tissues. Journal of Biomechanics. 41, (15), 3285-3289 (2008).
  22. Shen, F., Tay, T. E., et al. Modified Bilston Nonlinear Viscoelastic Model for Finite Element Head Injury Studies. Journal of Biomechanical Engineering -- Transactions of the ASME. 128, (5), 797-801 (2006).
  23. van Dommelen, J. aW., vander Sande, T. P. J., Hrapko, M., Peters, G. W. M. Mechanical properties of brain tissue by indentation: Interregional variation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 3, (2), 158-166 (2010).
  24. Rother, J., Nöding, H., Mey, I., Janshoff, A. Atomic force microscopy-based microrheology reveals significant differences in the viscoelastic response between malign and benign cell lines. Open biology. 4, (5), 140046 (2014).
  25. Du, P., Lu, H., Zhang, X. Measuring the Young's Relaxation Modulus of PDMS Using Stress Relaxation Nanoindentation. Symposium DD - Microelectromechanical Systems - Materials and Devices III. 1222, (c), (2009).
  26. Elkin, B. S., Morrison, B. Viscoelastic properties of the P17 and adult rat brain from indentation in the coronal plane. Journal of Biomechanical Engineering. 135, 114507 (2013).
  27. Brands, D. W., Bovendeerd, P. H., Peters, G. W., Wismans, J. S., Paas, M. H., van Bree, J. L. Comparison of the dynamic behavior of brain tissue and two model materials. 43rd Stapp Car Crash Conference Proceedings. 313-320 (1999).
  28. Hrapko, M., van Dommelen, J. A. W., Peters, G. W. M., Wismans, J. S. H. M. Characterisation of the mechanical behaviour of brain tissue in compression and shear. Biorheology. 45, (6), 663-676 (2008).
  29. Pogoda, K., Chin, L., et al. Compression stiffening of brain and its effect on mechanosensing by glioma cells. New Journal of Physics. 16, (7), 075002 (2014).
  30. Peters, G. W. M., Meulman, J. H., Sauren, A. A. H. J. The applicability of the time/temperature superposition principle to brain tissue. Biorheology. 34, (2), 127-138 (1997).
Karaktermultiscale Mekaniske egenskaper av hjernevev Bruke Atomic Force Microscopy, Impact Skår, og Rheometry
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Canovic, E. P., Qing, B., Mijailovic, A. S., Jagielska, A., Whitfield, M. J., Kelly, E., Turner, D., Sahin, M., Van Vliet, K. J. Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry. J. Vis. Exp. (115), e54201, doi:10.3791/54201 (2016).More

Canovic, E. P., Qing, B., Mijailovic, A. S., Jagielska, A., Whitfield, M. J., Kelly, E., Turner, D., Sahin, M., Van Vliet, K. J. Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry. J. Vis. Exp. (115), e54201, doi:10.3791/54201 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter