Introduction
Mesenchymale stromaceller (MSC) er av relevant klinisk verdi for deres multilineær differensiering kapasitet og deres evne til å støtte hemopoiese, for å utskille vekstfaktorer / cytokiner, så vel som å spille en rolle i immunregulering 1. I definisjonen av MSC-baserte terapier celle produksjon og anvendelse har vært gjenstand for omfattende klinisk og preklinisk forskning 2, med særlig vekt på spesifikke internasjonale reguleringer for sikkerhet og effekt av cellebasert legemiddel (CBMP) behandlinger 3. Menneskelige MSC er i stor utstrekning dyrket i media inneholdende bilag og reagenser av animalsk opprinnelse, slik som føtalt bovint serum (FBS) og bovin trypsin. Derfor, sammen med smittsomme risiko forbundet med celle manipulasjon, pasienter også overfor prion eksponering samt immunologiske risiko knyttet til proteiner, peptider eller andre biomolekyler av animalsk opprinnelse som kan vedvare etter celle høsting og Transtering 4.
For å omgå problemet, dyrket vi menneskelig benmarg (HBM) avledede MSC i dyrefritt medium, erstatte FBS med sammenslåtte menneskelig AB typen serum (Phab). Under disse betingelser, sammen med økende MSC vi identifisert en ny cellepopulasjon. Disse cellene var morfologisk og fenotypisk forskjellig fra MSC og viste en særegen genekspresjon profil samt karakteristiske voksende / vedheft egenskaper. De beholdt både mesengenic og angiogene potensial og derfor ble kalt mesodermal stamceller (MPCS) 5. Deretter var vi i stand til å definere selektive og reproduserbare dyrkningsbetingelser for å generere MPCS ved høy grad av renhet 6.
Vi videre undersøkt de morfologiske og biologiske egenskaper MPCS. MPCS viste å være nestin-positive, treg i sykling, Ki-67-negative, og med kromosomer preget av lange telomerer 5. De uttrykte pluripotency assosierte transkripsjonsfaktorer oktober-4 og Nanog heller enn MSC mester regulatorer Runx2 og Sox9 7. Fenotypisk uttrykk MPCS endoglin (CD105) på lavere nivå enn MSC mens mangler mesenchymale markører CD73, CD90, CD166. MPCS viste også et karakteristisk mønster av adhesjonsmolekyler er kjennetegnet ved konsistent ekspresjon av PECAM (CD31), integriner αL (CD11), αM (CD11b), αX (CD11c) samt integrin β2 (CD18) som spesifikt opprett podosome-lignende strukturer 8 . I standard MSC utvidelse media, MPCS raskt differensiert i MSC gjennom et mellomstadium med aktivering av Wnt5 / calmodulin cellesignale 9. MPCS også beholdt angiogene egenskaper, som demonstrert av deres evne til å spire fra kuler i murine ekstracellulære matriks (ECM) protein 3D kulturer. Den angiogenic potensialet ble raskt tapt etter MPC differensiering langs mesengenic avstamning.
Her presenterer vi protokoler optimalisert for å isolere og karakterisere høyt rensede MPCS fra HBM blodprøver. Reproduserbare protokoller for MPC mesengenic og angiogene differensiering er også beskrevet.
Protocol
MERK: Etter skriftlig samtykke, ble HBM prøver innhentet under ortopedisk kirurgi for hofteoperasjon. Umiddelbart etter lårhalsen osteotomi og før femoral opprømming en 20 ml sprøyte inneholdende 500 UI av heparin, ble anvendt til å suge frisk BM. Protokollen er å betrakte som gjelder for en hvilken som helst kilde BM.
1. Isolering av human benmarg mononukleære celler (HBM-MNCs)
- Fortynn 5 - 10 ml friskt BM til 50 ml, påføring av Dulbeccos fosfat-bufret saltoppløsning (D-PBS) og bland ved å snu opp. Like fordele 25 ml i to nye 50 ml koniske rør, tilsett 25 ml D-PBS til hvert rør og bland ved å snu opp.
- Tillat rørene for å stå i 10 minutter ved romtemperatur, for separasjon av mineralbeinrester og fett fra oppløsning.
- Fjern forsiktig flytende fett med en steril Pasteur-pipette og filtercellesuspensjonen gjennom 70 um filtre uten å forstyrre mineral benfragmentet pellet. <li> Sett fire 50 ml rør med 15 ml medium for diskontinuerlige tettshetsgradient sentrifugering (1,077 g / ml). Pass på at dette mediet er ved romtemperatur.
- Forsiktig lå 20 - 25 ml fortynnet BM på toppen av densitetsgradienten medium. Utføre denne operasjonen nøye, slik at cellesuspensjon piple på rørveggene å hindre miksing lag.
- Utføre tetthetsgradient sentrifugering ved 400 xg i 30 min ved værelsestemperatur med brems er deaktivert.
- Samle hvitaktig ring av celler som ligger mellom de to faser ved hjelp av en steril Pasteur-pipette og overføre den til en frisk 50 ml tube.
- Vask cellene med friskt kulturmedium: fenol rød-fri, lav glukose (1000 mg / l) Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM), 10% (v / v), sammenslått humant AB-typen serum (Phab), 2 mM L-glutamin og antibiotika (DMEM / 10% Phab). Sentrifuger ved 400 xg i 5 min.
- Aspirer supernatanten og re-suspendere pellet i 5-10 ml friskt DMEM / 10% Phab.
- Fortsett til legemer.Bestem antall hvite blodceller ved 1: 1 fortynning i trypan. Bruk denne til hemocytometer, og observere under et fasekontrastmikroskop. Ekskluder små og perfekt avrundede erytrocytter og blå-farget døde celler fra celletall.
MERK: Det anbefales sterkt å screene Phab grupper for deres prestasjoner i MPC utvinning. Phab fra USA kilder har gitt best resultater, mens de fleste sera av ulik opprinnelse resulterte i MPC kulturer med høyere prosenter av MSC-lignende celler.
2. Isolering av MPCS fra HBM-MNCs
- Set hydrofobe T-75 kolber med 15 ml frisk DMEM / 10% Phab og la pH og temperatur i likevekt ved pre-inkubering ved 37 ° C i 5% CO2 i 30 minutter.
- Seed 4-6 x 10 7 HBM-MNCs per kolbe og inkuberes ved 37 ° C i 5% CO 2 i 48 timer.
- Aspirer og kast mellom og ikke-heftende celler fra kolber. Tilsett 15 ml frisk DMEM / 10% Phab og inkuber ved 37 ° Ci 5% CO 2. Opprettholde kulturer for 6 - 8 dager, endre medium hver 48 time.
VALGFRITT: For å øke utbyttet MPC, ikke-adherente celler fra 2,3 kan være re-belagt i en ny kulturflaske og holdt som beskrevet for den primære kulturer. - Aspirer og kast medium fra kolber, vask med frisk DMEM og tilsett 2 ml av animalsk gratis protease løsne løsning. Inkuber ved 37 ° C i 5 - 15 min (unngå langvarig inkubasjon).
- Tilsett 10 ml frisk DMEM / 10% Phab, Aspirer cellesuspensjonen og sentrifuger ved 400 xg i 5 min
- Aspirer og kast supernatanten og re-suspendere pellet i 1 - 2 ml friskt DMEM / 10% Phab. Fortsett til legemer som beskrevet i trinn 1.10.
MERK: Ikke bruk trypsin / EDTA som løsne reagens. MPCS er trypsinresistent. Morfologisk screening av kulturene, før høsting celle, er sterkt anbefalt for å evaluere nærværet av spindel-formede MSC-lignende celler. I tilfelle betydelig mengde av MSC-liknende celler fra detected, øke renheten av cellen produktet ved selektiv fjerning av de kontaminerte celler. For å gjøre dette, kan trypsin fordøyelsen utføres før MPC høsting, ved å tilsette 2 ml trypsin / EDTA 0,05% for 2 min. Vask kulturer to ganger med 5 ml DMEM / 10% Phab, deretter fortsette å proteasebehandling som ovenfor.
3. Cell Karakterisering
- flowcytometri
- Sett opp duplikatprøver av 10 5 ferskt frigjorte celler i vaskeoppløsning: D-PBS supplert med 0,5% (v / v) bovint serumalbumin (BSA) og 0,02% (vekt / volum) natriumazid. Sentrifuger ved 400 xg i 5 min.
FORSIKTIG: Natriumazid er giftig. - Re-suspendere pellets i 200 ul vaskeløsning og legge til anti-CD90, anti-CD45, anti-CD73 og anti-CD31 antistoff konjugert med fluorescerende fargestoffer ( "test"); parallelt satt opp isotype kontroller ( "Ctrl").
MERK: Mengder av flekker antistoffer bør bestemmes ved titrering eller According til produsentens instruksjoner. - Inkuber prøver ved 4 ° C i 30 minutter.
- Sentrifuger ved 400 xg i 5 min. Re-suspendere celler i 500 mL av vaskeløsning og skaffe minst 5 x 10 4 aktiviteter flerfarget flowcytometer 7 9 10.
- Analyser resultatene etter dot-plott og bruke "Ctrl" registrerte hendelser for å sette kvadranter.
MERK: For å definere kultur som MPC kultur prosentandelen av CD73 neg CD90 neg CD45 + CD31 + celler bør være over 95%. For noen spesielle anvendelser, dvs. genekspresjonsanalyser, har oppsamlings cut-off økes til 97-98%.
- Sett opp duplikatprøver av 10 5 ferskt frigjorte celler i vaskeoppløsning: D-PBS supplert med 0,5% (v / v) bovint serumalbumin (BSA) og 0,02% (vekt / volum) natriumazid. Sentrifuger ved 400 xg i 5 min.
- Nestin deteksjon og F-aktin organisasjonsanalyse
- Plate nylig isolerte MPCS på kultur kammer lysbilder (20000 / cm 2). Tillat celler til å følge med over natten inkubasjon ved 37 ° C i 5% CO 2.
- Vask cellene i vaskeløsning og fix i 4% (vekt / volum) para-formaldehyd ved romtemperatur i 15 min. For å fjerne fiksativ legge vaskeløsning, inkuberes i 2 min og hell.
- Gjenta vask to ganger.
- Permeabilisere cellene i D-PBS supplert med 0,05% (v / v) Triton X-100 i 15 min ved RT.
- Stoppe reaksjonen ved proteinfritt signal forsterker (30 minutter ved romtemperatur) eller standard blokkeringsløsning (D-PBS supplert med 3% (vekt / volum) BSA).
- Fjern signalforsterker / blokkering løsning.
- Legg 7 ug / ml (vekt / volum) av anti-humant nestin primært antistoff og inkuberes ved 4 ° C over natten i et fuktet kammer. Parallelt bruke isotypiske kontrollantistoffer for å evaluere ikke spesifikke fluorescenssignaler.
- Vask lysbilder ved å legge til D-PBS, la stå i 2 minutter og hell. Gjenta to ganger.
- Tilsett 2 ug / ml (vekt / volum) av fluorescerende fargestoff konjugert sekundært antistoff og inkuberes ved 4 ° C i 1 time i mørke.
- Vask glir som ovenfor.
- Legg fluorescerende Phalloidin (5 UI / ml), la ved RT i 30 mi i mørket og vaskes 3 ganger i D-PBS.
- Fjerne kammerveggene og montere glir i vandig monterings medium supplert med antifade reagens og 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) for kjerner deteksjon. Fortsett til bildebehandling 7 9 10.
4. Mesengenic Differensiering av MPCS
- Plate 2 x 10 4 / cm 2 nylig isolerte MPCS i TC-behandlet T75 kulturflasker og la cellene holder seg over natten i DMEM / 10% Phab ved 37 ° C i 5% CO 2.
- Bytt DMEM / 10% Phab med standard redusert serum medium, ca 200 ul / cm 2, som er designet for mesenchymale stromal celle ekspansjon (MSC-RS medium). Grow cellene til konfluens (P1-MSC), vanligvis fra 7 til 10 dager fra induksjon. Oppdater medium hver 2 dager.
- Aspirer og kast medium fra kolber, vask med frisk MSC-RS medium og tilsett 2 ml av animalsk gratis protease løsne løsning. Inkuber ved 3776 C i 5 - 15 min (unngå langvarig inkubasjon).
- Tilsett 10 ml friskt MSC-RS medium, Aspirer cellesuspensjonen og sentrifuger ved 400 xg i 5 min
- Aspirer supernatanten og re-suspendere pellet i 1 - 2 ml fersk MSC-RS medium. Fortsett til legemer som beskrevet i trinn 1.10
- Fortsett til sub-kulturen dem ved såing 3-5 x 10 3 celler / cm 2. Grow cellene til konfluens (P2-MSC).
- Harvests celler ved protease fordøyelsen som er beskrevet fra trinn 4,3 til trinn 4,5 og fortsett til karakterisering som beskrevet i kapittel 3.
MERK: En prosentandel av CD73 + CD90 + CD45 neg CD31 neg celler lavere enn 95% skulle tilsi bare delvis differensiering og krever en ytterligere kultur passasje. - Plate P2-MSC på 2 x 10 4 / cm 2 i seks godt TC-behandlet plater og vokse til konfluens i MSC-RS medium.
- Mark to brønner som "No Diff" og oppdatere MSC-RS medium.
- Mark to godts som "Osteo" og erstatte medium med 200 ul / cm 2 av standard osteogent medium, spesielt designet for MSC differensiering.
- Mark to brønner som "Adipo" og erstatte medium med 200 ul / cm 2 av standard adipogenic medium, spesielt designet for MSC differensiering.
- Oppretthold kulturer ved 37 ° C i 5% CO 2 ved å endre hele media hver 48 time.
MERK: Det anbefales sterkt å bruke standard kommersielt tilgjengelige differensierende media for test reproduserbarhet. Etter 2/3 uker under differensierende forhold, kalkavleiringer vises i osteogene indusert kulturer, mens intracellulære lipid dråper akkumulering er tydelig i adipogenic indusert celler. - Aspirer og kast kultur media vask deretter med D-PBS.
- Fix kulturene ved tilsetning av 1 ml 4% (w / v) para-formaldehyd i 15 minutter ved romtemperatur.
- For å fjerne fiksativ legge D-PBS, inkuber i 2 minutter og hell. Gjenta vaskingto ganger.
- Flekk en "No Diff" sammen med de to "osteo" merket brønner i hydroksyapatitt spesifikke fluorescerende løsning og en "No Diff" sammen med de to "Adipo" merket brønner i 200 nM Nile Red løsning. Inkuber i 30 minutter ved værelsestemperatur 11,12.
- Fjern flekker løsninger og vask i D-PBS to ganger.
- Fjern D-PBS, tilsett D-PBS supplert med 50% (v / v) glycerol og fortsett til avbildning 7 9 10.
5. MPC spheroid Sprouting analysen
- For å produsere 3D sfæroider, lå 20 ul dråper av nylig isolerte MPC suspensjonen (1,5 x 10 4 celler / dråpe) på den indre overflate av en petriskål lokk.
MERK: Som håndtering dråper kan føre til deres brudd, er det meget tilrådelig å legge dem i overkant. - bruke nøye lokket til oppsummering en petriskål som inneholder D-PBS for å hindre hengende dråper fordampning. Inkuber ved 37 ° C i 5% CO2over natten slik at cellene til å samle inn 3D-kuler.
- Sett en tykk gel av murine ekstracellulære matriks (ECM) proteiner ved tilsetning av 300 pl prøver av standard ECM-proteiner i en på forhånd nedkjølt 24-brønners dyrkingsplate, og inkuber ved 37 ° C i 30 minutter.
- Nøye velte petriskål lokket og forsiktig plukke opp kulene med en steril Pasteur pipette.
- Lå kuler på ECM-proteinet gelen, tilsett 700 ul aliquoter av standard VEGF-rik endotelial cellevekstmedium og inkuber ved 37 ° C i 5% CO2.
- Etter 24 timer og 7 dager med kultur, ta bilder av 3D-kulturer ved 4X forstørrelse makt. Vurdere spirende fra kuler som gjelder bildeanalyse programvare ved å måle den radiale avstanden mellom siste invaderende celle og spheroid kanten. Gjenta tiltak langs minst 20 forskjellige retninger. Gjennomsnittlig avstand anses som positivt når 50 mikrometer eller over.
Representative Results
De selektive kultur forholdene beskrevet her har tillatt isolering av en roman tilhenger og nesten monomorfe cellepopulasjon som 1,0% av HBM-MNCs (0,5 - 2,0 x 10 6 HBM-MNCs fra 5 - 10 ml fersk BM prøver) 5,6 . Vi identifiserte disse store (40 - 60 mikrometer i diameter), avrundet, hvilende, Ki-67-negative celler som MPCS 5. Morfologisk, de er preget av en særegen stekt egg-form med en tykk kjerneområde omgitt av en flat tynn periferien viser masse filopodia ved høyere forstørrelse makt (hvite piler i figur 1 A.1). Polar forlengelse av den ytre cellegrensen er ofte observert (sorte piler i figur 1 A.1). En slik morfologi er tydelig forskjellig fra den typiske spindel-formet mesenchymale stromal celle utseende rapporteres i standard MSC kulturer. Flow viste cytometri over 95% av nylig isolerte MPCS å uttrykke CD31 og CD45 mens mesenchymal assosiert markører CD90 og CD73 13 var umulig å oppdage (figur 1 A.2). Vi anser dette begrenset sett med fire antigener som veiledende for MPCS. Ytterligere særtrekk ved MPCS er strødd F-aktin fordeling avslører en rekke podosome-lignende strukturer (rød i figur 1 A.3) og intens ekspresjon av nestin (grønn i figur 1 A.3), som ikke er påvist i cellene farget med isotypisk kontroll antistoff (data ikke vist).
Dyrking MPCS i standard RS medium designet for MSC ekspansjons resulterer i rask differensiering i eksponentielt voksende MSC-lignende celler (figur 1 B.1). Etter to passasjer celler endelig bytte sin fenotype fra CD73 neg CD90 neg CD45 + CD31 + til CD73 + CD90 + CD45 neg CD31 neg (figur 1 B.2). I prosessen MPCS re-organize F-aktin i stress-fibre mens nestin uttrykk blir begrenset til noen sjeldne celler (figur 1 B.3). MPC mesengenic differensiering i en bestemt MSC-lignende fenotype skjer gjennom to forskjellige trinn avslørt av ulike celle morfologi. Etter en uke i MSC RS medium en gjenværende populasjon av MPC-lignende celler kan også påvises innenfor et konfluent lag av flate, polygonale flerforgrenede celler (P1-MSC i figur 2 A). En ytterligere passasje er nødvendig for å oppnå en nesten monomorf kultur av spindel-formet MSC-lignende celler (P2-MSC i figur 2 A). Disse eksponentielt voksende celler kan lett differensiere til osteoblaster eller adipocytter da overført til selektive medier i minst 2 uker, noe som bekrefter deres MSC natur. I osteogene indusert kulturer, kan kalkavleiringer påvises ved enten kolo Alizarin-S beis eller spesifikke fluorescerende fargestoffer (grønne i figur 2 B). Etter adipogenic induksjon cellerviser lipid dråpe akkumulasjon som avslørt av enten kolo Oil Red eller fluorescerende Nilen rød flekk (rødt i figur 2 B).
MPC typing ble bekreftet av spirende angiogenese analysen. MPCS viste deres evne til å invadere (over 50 um) murint ECM-protein-gel fra 3D-kuler etter 24 timer VEGF-stimulus (figur 2C). Etter en uke invaderende celler ble påvist ved 300-600 um avstand. Motsatt invasjonen kapasiteten ble tapt i P2-MSC etter mesengenic differensiering (figur 2 D).
Figur 1. nylig isolerte MPCS har særpreg. Dyrking HBM-MNCs i DMEM / 10% Phab i syv dager gir opphav til en befolkning på hvil MPCS (A) lett skjelnes fra MSC (B) klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. MPCS differensieres til Standard MSC og Show Sprouting Angiogenese in vitro. Utskifting av DMEM / Phab med kommersielt tilgjengelige RS medium utformet for MSC utvidelse utløser mesengenic induksjon av MPCS. Etter en uke i kultur noen rest MPCS som fremdeles påvisbar (P1-MSC), mens en ytterligere passasje i MSC-RS medium fører til en populasjon av sammenflytende MSC-lignende celler (P2-MSC, A-skala barer = 100 pm). P2-MSC terminalt differensiere i osteocytter eller adipocytter under riktige stimuli som avslørt av kalsium deponering (grønn i B) og lipid dråpe akkumulasjon (rød i B, skala barer = 200 nm), henholdsvis. MPCS viser konsekvent spirende fra kuler i murine ECM protein gel (C) ved en forskjell med P2-MSC (D, skala barer = 1,0 mm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker spesielt å takke Dr. Paolo Parchi, avdeling for kirurgisk, medisinsk og molekylær patologi og Critical Care Medicine, University of Pisa, for å gi beinmargsprøver og hans ekspertise i menneskelige osteo-stamfedre
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Bioscience (San Jose, CA-USA) | 354230 | Murine ECM proteins Stock Concentration: 100% (9 - 12 mg/ml) Final Concentration: 100% |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) | Sigma (St. Louis, MO, USA) | D8537 | |
| 70 μm Filters | Miltenyi Biotec (BergischGladbach, Germany) | 130-095-823 | |
| Ficoll-Paque PREMIUM | GE Healthcare (Uppsala, Sweden) | 17-5442-03 | medium for discontinuos density gradient centrifugation |
| Pooled human AB type serum (PhABS) | LONZA (Walkersville MD-USA) | 14-490E | Final Concentration: 10% |
| Glutamax-I | ThermoFisher (Waltham, MA USA) | 35050-038 | Stabilized L-Glutamine Stock Concentration: 100x Final Concentration: 2 mM |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma (St. Louis, MO, USA) | A8412 | Stock Concentration: 7.5% Final Concentration: 0.5% |
| Sodium Azide | Sigma (St. Louis, MO, USA) | S8032 | Final Concentration: 0.02% |
| Penicillin/Streptomycin (Pen Strep) | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | Antibiotics Stock Concentration: 5,000 UI/ml penicillin, 5,000 μg/ml Streptomycin Final Concentration: 50 UI/ml penicillin, 50 μg/ml Streptomycin |
| T-75 culture flask for suspension cultures | Greiner Bio-one (Frickenhausen, Germany) | 658 190 | |
| T-75 culture flask TC treated | Greiner Bio-one (Frickenhausen, Germany) | 658170 | |
| TrypLE Select | ThermoFisher (Waltham, MA USA) | 12563-011 | Animal-free proteases detaching solution Stock Concentration: 1x Final Concentration: 1x |
| Trypsin/EDTA | ThermoFisher (Waltham, MA USA) | 15400-054 | Phenol red free Stock Concentration: 0.5% Final Concentration: 0.25% |
| anti-CD90 APC antibody (CD90) | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-095-402 | Final Concentration: 1:40 |
| anti-CD45 APC-Vio770 antibody (CD45) | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-096-609 | Final Concentration: 1:40 |
| anti-CD73 PE antibody (CD73) | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-095-182 | Final Concentration: 1:40 |
| anti-CD31 PE Vio-770 antibody (CD31) | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-105-260 | Final Concentration: 1:40 |
| Mouse IgG1 APC antibody | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-098-846 | Final Concentration: 1:40 |
| Mouse IgG2a APC Vio770 antibody | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-096-637 | Final Concentration: 1:40 |
| Mouse IgG1 PE antibody | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-098-845 | Final Concentration: 1:40 |
| Mouse IgG1 PE Vio-770 antibody | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-098-563 | Final Concentration: 1:40 |
| Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher (Waltham, MA USA) | 13-1331-82 | Phenol red-free minimal essential medium Stock Concentration: 1,000 mg/L glucose |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher (Waltham, MA USA) | 10500 | Stock Concentration:0.2 mg/ml Final Concentration: 2 μg/ml |
| Prolong Gold antifade reagent with 4’,6-diamidino-2-phenylindole | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | P-36931 | Aqueous mounting medium + DAPI Final Concentration: 1x |
| Paraformaldehyde | Sigma (St. Louis, MO, USA) | P6148 | Fixative Final Concentration: 4% |
| LAB-TEK two-well chamber slides | Sigma (St. Louis, MO, USA) | C6682 | |
| Anti-Nestin antibody [clone 10C2] | Abcam (Cambridge, UK) | ab2035 | Stock Concentration: 1 mg/ml Final Concentration: 7 μg/ml |
| Alexa Fluor 555 Phalloidin | ThermoFisher (Waltham, MA USA) | A34055 | Stock Concentration: 200 UI/ml Final Concentration: 5 UI/ml |
| Triton X-100 | Euroclone (Milan, Italy) | EMR237500 | Final Concentration: 0.05% |
| MesenPRO RS Medium (MSC-RS medium) | ThermoFisher (Waltham, MA USA) | 12746-012 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse SFX kit | ThermoFisher (Waltham, MA USA) | A31619 | Goat anti-mouse secondary antibody + Signal enhancer Stock Concentration: 2 mg/ml Final Concentration: 2 μg/ml |
| Pasteur Pipette | Kartell Labware (Noviglio (MI), ITALY ) | 329 | |
| StemMACS AdipoDiff Media | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-091-679 | |
| StemMACS OsteoDiff Media | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-091-678 | |
| Osteoimage Bone mineralization Assay | LONZA (Walkersville MD-USA) | PA-1503 | Hydroxyapatite specific fluorescent staining solution |
| 50 ml Polystyrene conical tube | Greiner bio-one (Kremsmünster Austria) |
227261 | |
| Nile Red | ThermoFisher (Waltham, MA USA) | N1142 | Fluorescent staining solution for lipids Stock Concentration: 100 mM Final Concentration: 200 Nm |
| Glycerin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | G2289 | Final Concentration: 50% |
| Polistirene Petri dishes | Sigma (St. Louis, MO, USA) | P5606 | |
| 24-well plates TC-treated | Greiner Bio-one GmbH (Frickenhausen, Germany) | 662160 | |
| Endothelial Growth Medium, EGM-2 BulletKit (EGM-2) | LONZA (Walkersville MD-USA) | CC-3162 | VEGF-rich endothelial cell growth medium |
| Leica Qwin Image Analisys Software | Leica (Wetzlar, Germany) | Image analysis software |
References
- Stoltz, J. F., et al. Stem Cells and Regenerative Medicine: Myth or Reality of the 21th Century. Stem Cells Int. 2015, 734731 (2015).
- Pacini, S. Deterministic and stochastic approaches in the clinical application of mesenchymal stromal cells (MSCs). Front Cell Dev Biol. 2, 50 (2014).
- Galvez, P., Clares, B., Hmadcha, A., Ruiz, A., Soria, B. Development of a cell-based medicinal product: regulatory structures in the European Union. Br Med Bull. 105, 85-105 (2013).
- Herberts, C. A., Kwa, M. S., Hermsen, H. P. Risk factors in the development of stem cell therapy. J Transl Med. 9, 29 (2011).
- Petrini, M., et al. Identification and purification of mesodermal progenitor cells from human adult bone marrow. Stem Cells Dev. 18 (6), 857-866 (2009).
- Trombi, L., et al. Selective culture of mesodermal progenitor cells. Stem Cells Dev. 18 (8), 1227-1234 (2009).
- Pacini, S., et al. Constitutive expression of pluripotency-associated genes in mesodermal progenitor cells (MPCs). PLoS One. 5 (3), 9861 (2010).
- Pacini, S., et al. Specific integrin expression is associated with podosome-like structures on mesodermal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (12), 1830-1838 (2013).
- Fazzi, R., et al. Mesodermal progenitor cells (MPCs) differentiate into mesenchymal stromal cells (MSCs) by activation of Wnt5/calmodulin signalling pathway. PLoS One. 6 (9), 25600 (2011).
- Tormin, A., et al. CD146 expression on primary nonhematopoietic bone marrow stem cells is correlated with in situ localization. Blood. 117 (19), 5067-5077 (2011).
- Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
- Wang, Y. H., Liu, Y., Maye, P., Rowe, D. W. Examination of mineralized nodule formation in living osteoblastic cultures using fluorescent dyes. Biotechnol Prog. 22 (6), 1697-1701 (2006).
- Horwitz, E. M., et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 7 (5), 393-395 (2005).
- Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19 (2012).
- Si, Y. L., Zhao, Y. L., Hao, H. J., Fu, X. B., Han, W. D. MSCs: Biological characteristics, clinical applications and their outstanding concerns. Ageing Res Rev. 10 (1), 93-103 (2011).
- Le Blanc, K., Tammik, C., Rosendahl, K., Zetterberg, E., Ringden, O. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells. Exp Hematol. 31 (10), 890-896 (2003).
- Phinney, D. G. Biochemical heterogeneity of mesenchymal stem cell populations: clues to their therapeutic efficacy. Cell Cycle. 6 (23), 2884-2889 (2007).
- Phinney, D. G. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: implications for cell therapy. J Cell Biochem. 113 (9), 2806-2812 (2012).
- Tolar, J., Le Blanc, K., Keating, A., Blazar, B. R. Concise review: hitting the right spot with mesenchymal stromal cells. Stem Cells. 28 (8), 1446-1455 (2010).
- Corselli, M., et al. The tunica adventitia of human arteries and veins as a source of mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 21 (8), 1299-1308 (2012).
- Bieback, K., et al. Human alternatives to fetal bovine serum for the expansion of mesenchymal stromal cells from bone marrow. Stem Cells. 27 (9), 2331-2341 (2009).
- Watson, L., Elliman, S. J., Coleman, C. M. From isolation to implantation: a concise review of mesenchymal stem cell therapy in bone fracture repair. Stem Cell Res Ther. 5 (2), 51 (2014).
- Pacini, S., Petrini, I. Are MSCs angiogenic cells? New insights on human nestin-positive bone marrow-derived multipotent cells. Front Cell Dev Biol. 2, 20 (2014).
