Teknikker til Udviklingen Robust pentose-gæring Gær til Biokonversion af lignocellulose til ethanol
Summary
Adaptive evolution og isolation teknikker er beskrevet og demonstreret at give derivater af Scheffersomyces stipitis stammen NRRL Y-7124, der er i stand til hurtigt at forbruge hexose og pentose blandede sukker i enzym forsukret undetoxified hydrolysater og at akkumulere over 40 g / l ethanol.
Abstract
Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme saccharification processes release sugars that can be fermented by yeast. Traditional industrial yeasts do not ferment xylose (comprising up to 40% of plant sugars) and are not able to function in concentrated hydrolyzates. Concentrated hydrolyzates are needed to support economical ethanol recovery, but they are laden with toxic byproducts generated during pretreatment. While detoxification methods can render hydrolyzates fermentable, they are costly and generate waste disposal liabilities. Here, adaptive evolution and isolation techniques are described and demonstrated to yield derivatives of the native Scheffersomyces stipitis strain NRRL Y-7124 that are able to efficiently convert hydrolyzates to economically recoverable ethanol despite adverse culture conditions. Improved individuals are enriched in an evolving population using multiple selection pressures reliant on natural genetic diversity of the S. stipitis population and mutations induced by exposures to two diverse hydrolyzates, ethanol or UV radiation. Final evolution cultures are dilution plated to harvest predominant isolates, while intermediate populations, frozen in glycerol at various stages of evolution, are enriched on selective media using appropriate stress gradients to recover most promising isolates through dilution plating. Isolates are screened on various hydrolyzate types and ranked using a novel procedure involving dimensionless relative performance index (RPI) transformations of the xylose uptake rate and ethanol yield data. Using the RPI statistical parameter, an overall relative performance average is calculated to rank isolates based on multiple factors, including culture conditions (varying in nutrients and inhibitors) and kinetic characteristics. Through application of these techniques, derivatives of the parent strain had the following improved features in enzyme saccharified hydrolyzates at pH 5-6: reduced initial lag phase preceding growth, reduced diauxic lag during glucose-xylose transition, significantly enhanced fermentation rates, improved ethanol tolerance and accumulation to 40 g/L.
Introduction
En anslået årlig 1,3 milliarder tørre tonsvis af lignocellulose biomasse kunne støtte ethanolproduktion og tillade USA at reducere sit forbrug råolie med 30%. 1 Selv plantebiomasse hydrolyse udbytter sukkerblandinger rige på glucose og xylose, er fermentering hæmmere genereret af kemisk forbehandling nødvendig at nedbryde hemicellulose og eksponere cellulose til enzymatisk angreb. Eddikesyre, furfural, og hydroxymethylfurfural (HMF) menes at være centrale komponenter blandt mange inhibitorer, der dannes under forbehandling. For at flytte lignincellulosematerialet ethanol industrien frem, til forskning og procedurer tillader udviklingen af gærstammer, der kan overleve og effektivt fungerende at bruge både hexose og pentosesukkere i tilstedeværelsen af sådanne hæmmende forbindelser er nødvendige. En væsentlig yderligere svaghed ved de traditionelle industrielle gærstammer, såsom Saccharomyces cerevisiae, er den manglende evne til effektivt at ferment den xylose rådighed i hydrolysater af vegetabilsk biomasse.
Pichia stipitis-stamme NRRL Y-7124 (CBS 5773), for nylig omdøbt Scheffersomyces stipitis, er en nativ pentose gærende gær, der er velkendt at fermentere xylose til ethanol. 2,3 Udviklingen af stamme NRRL Y-7124 blev forfulgt her, fordi det er dokumenteret, at har det største potentiale af indfødte gærstammer at akkumulere økonomisk genindvindingsværdi ethanol over 40 g / l med lidt xylitol biprodukt. 4,5,6 i optimal medier, S. stipitis-stamme NRRL Y-7124 producerer 70 g / l ethanol i 40 timer (1,75 g / liter / time) i et udbytte på 0,41 ± 0,06 g / g i høj celledensitet kulturer (6 g / L celler). 7,8 Resistance til gæring hæmmere ethanol, furfural, og HMF er også rapporteret, 9 og S. stipitis er blevet rangeret blandt de mest lovende indfødte pentose-gærende gær til rådighed for kommerciel skala ethanol production fra lignocellulose. 10. Vores mål var at anvende diverse undetoxified lignocellulose hydrolysater og udvælgelse ethanol pres for at tvinge udviklingen mod en mere robust derivat af stammen NRRL Y-7124 velegnet til industrielle applikationer. Key blandt forbedrede funktioner søgte var hurtigere sukker uptake satser i koncentrerede hydrolysater, reduceret diauxy for mere effektiv blandet udnyttelse sukker og højere tolerancer ethanol og inhibitorer. Anvendelsen af S. stipitis til undetoxified hydrolysater var et centralt fokus for forskning for at fjerne den ekstra driftsudgift forbundet med hydrolysat afgiftning processer, såsom overliming.
To industrielt lovende hydrolysater blev anvendt til at tvinge evolution:. Enzym forsukrede ammoniak fiber ekspansion-forbehandlet majshalm hydrolysat (AFEX CSH) og fortyndet syre-forbehandlet præriegræs hydrolysatvæsken (PSGHL) 11,12 AFEX forbehandling teknologi udvikles tilminimere produktionen af fermenteringsprodukter inhibitorer, mens forbehandling med fortyndet syre repræsenterer den aktuelle laveste omkostninger teknologi oftest praktiseres at blotlægge cellulosebaseret biomasse til enzymatisk forsukring. PSGHL kan adskilles fra cellulose som bliver tilbage efter forbehandling og er karakteristisk rig på xylose fra den hydrolyserede hemicellulose, men lav i glucose. AFEX CSH og PSGHL kompositioner adskiller sig fra hinanden i vigtige aspekter, som blev udnyttet til at styre udviklingen processen. AFEX CSH er lavere i furan aldehyder og eddikesyre inhibitorer men højere i aminosyrer og ammoniak nitrogenkilder forhold til PSGHL (tabel 1). PSGHL præsenterer den yderligere udfordring af xylose er den fremherskende sukker rådighed. PSGHL er således hensigtsmæssigt at specifikt berige forbedret xylose udnyttelse i hydrolysater, en svaghed forhindrer kommerciel brug af tilgængelige gær. Selv blandt indfødte pentose fermenting gær, afhængigheden af det suboptimale sukker xylose til at understøtte cellevækst og reparation bliver endnu mere udfordrende i hydrolysater på grund af en række årsager:. mangel på næringsstoffer, hæmmere forårsager omfattende skader til celle strukturel integritet, og forstyrrelse af stofskiftet på grund af redox ubalancer 9 Kvælstof tilskud, især i form af aminosyrer, kan udgøre en betydelig omkostning for fermenteringer drift. Virkningen af kvælstof tilskud på isolat screening og rangordning blev udforsket med præriegræs hydrolysater.
Forbedret personer blev beriget med et udviklende population ved hjælp af flere udvalg pres afhængige af naturlige genetiske mangfoldighed af S. stipitis befolkning og mutationer induceret af engagementer med to forskellige hydrolysater, ethanol eller UV-stråling. Tryk Selection blev anvendt parallelt og i serie til at udforske udviklingen fremskridt S. stipitis mod ønskede derivater stand til at vokse og gære effektivt i hydrolysater(Figur 1). Den gentagne dyrkning af funktionelle befolkninger i stigende grad udfordrende hydrolysater blev udført i mikroplader ansætte en fortyndingsrække af enten 12% glucan AFEX CSH ellers PGSHL forberedt på 20% tørstof belastning. Anvendelsen af ethanol-udfordrede vækst på xylose i kontinuerlig kultur yderligere forbedret AFEX CSH tilpasset befolkninger ved berigende for fænotyper demonstrerer mindre følsomhed over for ethanol undertrykkelse af xylose udnyttelse. Den sidstnævnte træk blev for nylig vist problematisk at pentose udnyttelse af stammen NRRL Y-7124 efter glucose fermentering. 8 berigelse PSGHL blev dernæst undersøgt for at udvide hydrolysat funktionalitet.
Formodede forbedrede derivater af S. stipitis NRRL Y-7124 blev isoleret fra hver fase af udviklingen processen ved hjælp målrettet berigelse under stress betingelser og fortyndingsudstrygning at plukke kolonier fra de mest udbredte befolkninger. dimensionsløs slægtningydeevneværdierne (RPIs) blev brugt til at rangere stammer baseret på den samlede præstation, hvor kinetisk opførsel blev vurderet på de forskellige hydrolysat typer og næringsstoffer kosttilskud anvendt. Selv succeser forskellige tilpasningsstrategier procedurer for at forbedre funktionaliteten af S. stipitis i lignocelluloseholdige hydrolysater er tidligere blevet dokumenteret, stammer demonstrerer økonomisk ethanolproduktion på undetoxified hydrolysater er ikke tidligere blevet rapporteret. 13-17 Under anvendelse af evolution procedurer, der skal visualiseres mere detaljeret her, Slininger et al. 18 udviklede stammer, som er forbedret betydeligt i den forælder stammen NRRL Y-7124 og er i stand til at producere> 40 g / l ethanol i AFEX CSH og enzym forsukrede præriegræs hydrolysat (SGH) behørigt suppleret med kvælstof kilder. Disse nye stammer er af fremtidig interesse for udviklingslandene lignocellulose til ethanol industrien og som emner af yderligere genomforskning undersøgelser bygningpå de tidligere sekventeret stamme NRRL Y-11545. 19 En genomics undersøgelse af top stammer produceret under forskellige faser af evolution et diagram i figur 1 vil belyse historien om genetiske ændringer, der skete under udvikling som en optakt til yderligere belastning forbedring forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flere trin var afgørende for succes af udviklingen processen. Først er det vigtigt at vælge passende selektionstryk at drive befolkningen udvikling mod de ønskede fænotyper, der er nødvendige for vellykket anvendelse. Følgende selektive spændinger blev valgt for S. stipitis udvikling og anvendes på passende tidspunkter at guide berigelse for de ønskede fænotyper: stigende styrker af 12% glucan AFEX CSH (som tvinger vækst og fermentering af forskellige sukkere i nærværelse af eddikesyre og lave niv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to express our sincere appreciation to Drs. Kenneth Vogel, Robert Mitchell and Gautam Sarath, Grain, Forage, and Bioenergy Research Unit, Agricultural Research Service, Lincoln, NE for their kind supply of switchgrass for this project. We also thank U.S. Department of Energy for funding to VB through the DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (GLBRC) Grant DE-FC02-07ER64494.
Materials
| Cellic Ctec, Contains Xylanase (endo-1,4-) | Novozymes | No product number | www.novozymes.com, 1-919-494-3000 |
| Cellic Htec, Contains Cellulase and Xyalanase | Novozymes | No product number | www.novozymes.com, 1-919-494-3000 |
| Toasted Nutrisoy Flour | Archer Daniels Midland Co. (ADM) | 63160 | ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL 1800-37-5843 |
| Pluronic F-68 (Surfactant) | Sigma-Aldrich | P1300 | Sigma-Aldrich |
| Difco Vitamin Assay Casamino Acids | Becton Dickinson and Company | 228830 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| D,L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T3300 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, Sigma-Aldrich |
| Bacto Agar | Becton Dickinson and Company | 214010 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Bacto Malt Extract | Becton Dickinson and Company | 218630 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Bacto Yeast Extract | Becton Dickinson and Company | 212750 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Peptone Type IV from soybean | Fluka | P0521-500g | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Adenine, > 99% powder | Sigma-Aldrich | A8626 | CAS 73-24-5, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Cytosine, > 99% | Sigma-Aldrich | C3506 | CAS 71-30-7, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Guanine, SigmaUltra | Sigma-Aldrich | G6779 | CAS 73-40-5, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Thymine, 99% | Sigma-Aldrich | T0376 | CAS 65-71-4, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Uracil, 99% | Sigma-Aldrich | U0750 | CAS 66-22-8, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous, Certified ACS | Fisher Chemical | D16-500 | CAS 50-99-7, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich |
| D-Xylose, assay > 99% | Sigma-Aldrich | X1500 | CAS 58-86-6, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich |
| 96-well, flat bottom plates | Becton Dickinson Falcon | 351172 | multiple suppliers: e.g. Thermo-Fisher, VWR, Daigger |
| Wypall L40 Wiper | Kimberly-Clark | towel in microplate boxes to absorb water for humidification; multiple suppliers: e.g. Thermo-Fisher, uline, Daigger | |
| Corning graduated pyrex flask, 125-mL, narrow opening (stopper #5) | Corning Life Science Glass | 4980-125 | multiple suppliers: e.g. Thermo-Fisher, VWR, Daigger |
| Innova 42R shaker/incubator, 2.5 cm (1") rotation | New Brunswick Scientific (1-800-631-5417) | M1335-0016 | multiple suppliers: e.g. Eppendorf, Thermo-Fisher. Other shaker/incubators with a 2.5 cm (1") throw could be used. |
| Duetz Cover clamp for 4 deepwell MTP plates | Applikon Biotechnology | Z365001700 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Duetz System sandwich cover for 96 deepwell plates | Applikon Biotechnology | Z365001296 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Duetz System silicone seal (0.8mm black low evap) for 96 deep well plate cover | Applikon Biotechnology | V0W1040027 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Blue microfiber layer for Duetz system sandwich cover | Applikon Biotechnology | V0W1040001 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| 96 well, 2 mL square well pyramid bottom plates, natural popypropylene | Applikon Biotechnology | ZC3DXP0240 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Bellco 32mm silicon sponge plug closures, pk of 25 for 125-mL flasks | Bellco | 1924-00032 | Thomas Scientific, their Catalog number is 1203K27 |
| Bellco Spinner Flask, 1968-Glass Dome, Sealable Flange Type, 100-mL working volume. This design no longer manufactured. | Bellco | 1968-00100 (original Cat. No.) | Jacketed vessels have lower inlet & upper outlet ports for temp. control with circulating water bath. Vessels are 75mm in outer diam and 200mm in height. There are four side ports at ~45o angles and one top port. Port openings appropriate size for size 0 neoprene stoppers (21-22mm inner diameters on ports). |
| Mathis Labomat IR Dryer Oven | MathisAg | Typ-Nbr BFA12 215307 | Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157 |
| Dual Channel Biochemistry Analyzer | YSI Life Sciences | 2900D-UP | www.ysi.com, robotic system for rapid sugars assay in 96-well microplate format |
| PowerWave XS Microplate Spectrophotometer | Bio-Tek Instruments, Inc | MQX200R | www.biotek.com |
References
- Perlack, R. D., Stokes, B. J. . Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. , (2011).
- Prior, B. A., Kilian, S. G., duPreez, J. C. Fermentation of D-xylose by the yeasts Candida shehatae and Pichia stipitis. Process Biochem. 24 (1), 21-32 (1989).
- Kurtzman, C. P., Suzuki, M. Phylogenetic analysis of ascomycete yeasts that form coenzyme Q-9 and the proposal of the new genera Babjeviella, Meyerozyma, Millerozyma, Priceomyces and Scheffersomyces. Mcoscience. 51 (1), 2-14 (2010).
- Slininger, P. J., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. Comparative evaluation of ethanol production by xylose-fermenting yeasts presented high xylose concentrations. Biotechnol. Lett. 7 (6), 431-436 (1985).
- Slininger, P. J., Bothast, R. J., Ladisch, M. R., Okos, M. R. Optimum pH and temperature conditions for xylose fermentation by Pichia stipitis. Biotechnol. Bioeng. 35 (7), 727-731 (1990).
- Slininger, P. J., et al. Stoichiometry and kinetics of xylose fermentation by Pichia stipitis. Annals NY Acad. Sci. 589, 25-40 (1990).
- Slininger, P. J., Dien, B. S., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. Nitrogen source and mineral optimization enhance D-xylose conversion to ethanol by the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (6), 1285-1296 (2006).
- Slininger, P. J., Thompson, S. R., Weber, S., Liu, Z. L. Repression of xylose-specific enzymes by ethanol in Scheffersomyces (Pichia) stipitis and utility of repitching xylose-grown populations to eliminat diauxic lag. Biotechnol. Bioeng. 108 (8), 1801-1815 (2011).
- Slininger, P. J., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. Culture nutrition and physiology impact inhibitor tolerance of the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124. Biotechnol. Bioeng. 102 (3), 778-790 (2009).
- Agbogbo, F. K., Coward-Kelly, G. Cellulosic ethanol production using the naturally occurring xylose-fermenting yeast, Pichia stipitis. Biotechnol. Lett. 30 (9), 1515-1524 (2008).
- Balan, V., Bals, B., Chundawat, S., Marshall, D., Dale, B. E. Lignocellulosic pretreatment using AFEX. Biofuels: Methods and protocols, Methods in Molecular Biology. 581, 61-77 (2009).
- Jin, M., Gunawan, C., Uppugundla, N., Balan, V., Dale, B. E. A novel integrated biological process for cellulosic ethanol production featuring high ethanol productivity, enzyme recycling, and yeast cells reuse. Energ. Environ. Sci. 5 (5), 7168-7175 (2012).
- Nigam, J. N. Development of xylose-fermenting yeast Pichia stipitis for ethanol production through adaptation on hardwood hemicellulose acid prehydrolysate. J. Appl. Microbiol. 90 (2), 208-215 (2001).
- Nigam, J. N. Ethanol production from wheat straw hemicellulose hydrolysate by Pichia stipitis. J. Biotechnol. 87 (1), 17-27 (2001).
- Hughes, S. R., et al. Random UV-C mutagenesis of Scheffersomyces (formerly Pichia) stipitis NRRL Y-7124 to improve anaerobic growth on lignocellulosic sugars. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 39 (1), 163-173 (2012).
- Bajwa, P. K., et al. Mutants of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis with improved tolerance to inhibitors in hardwood spent sulfite liquor. Biotechnol. Bioeng. 104 (5), 892-900 (2009).
- Bajwa, P. K., Pinel, D., Martin, V. J. J., Trevors, J. T., Lee, H. Strain improvement of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis by genome shuffling. J. Microbiol. Methods. 81 (2), 179-186 (2010).
- Slininger, P. J., et al. Evolved strains of Scheffersomyces stipitis achieving high ethanol productivity on acid- and base-pretreated biomass hydrolyzate at high solids loading. Biotechnol. Biofuels. 8:60, 1-27 (2015).
- Jeffries, T. W., et al. Genome sequence of the lignocellulosic-bioconverting and xylose-fermenting yeast Pichia stipitis. Nature Biotechnol. 25 (3), 319-326 (2007).
- Zabriski, D. W., Armiger, W. B., Phillips, D. H., Albano, P. A. Fermentation media formulation. Trader’s Guide to Fermentation Media Formulation. , 1-39 (1980).
- Syzbalski, W., Bryson, Y. Genetic studies on microbial cross resistance to toxic agents. I. Cross resistance of Escherichia coli to fifteen antibiotics. J. Biotechnol. 64 (4), 489-499 (1952).
- Klinke, H. B., Thomsen, A. B., Ahring, B. K. Inhibition of ethanol-producing yeast and bacteria by degradation products produced during pre-treatment of biomass. Appl. Microbiol. Biotechnol. 66, 10-26 (2004).
- Almeida, J. R. M., Bertilsson, M., Gorwa-Grauslund, M. F., Gorsich, S., Liden, G. Metabolic effects of furaldehydes and impacts on biotechnological processes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 625-638 (2009).
- Allen, S. A., et al. Furfural induces reactive oxygen species accumulation and cellular damage in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Biofuels. 3, (2010).
- Weisburger, J. H. Mutagenic, carcinogenic, and chemopreventive effects of phenols and catechols: the underlying mechanisms. ACS Symposium Series. 507, 35-47 (2009).
- Slininger, P. J., Dien, B. S., Lomont, J. M., Bothast, R. J., Ladisch, M. R. Evaluation of a kinetic model for computer simulation of growth and fermentation by Scheffersomyces (Pichia) stipitis fed D-xylose. Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1532-1540 (2014).
- Wang, X., et al. Comparative metabolic profiling revealed limitations in xylose-fermenting yeast during co-fermentation of glucose and xylose in the presence of inhibitors. Biotechnol. Bioeng. 111 (1), 152-164 (2014).
- Slininger, P. J., Branstrator, L. E., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. Growth, death, and oxygen uptake kinetics of Pichia stipitis on xylose. Biotechnol. Bioeng. 37 (10), 973-980 (1991).
