Techniques pour l'évolution de la levure robuste Pentose-fermentation pour la bioconversion de lignocellulose en éthanol
Summary
Techniques d'évolution et d' isolement adaptatifs sont décrits et démontrés pour produire des dérivés de la souche Scheffersomyces de NRRL Y-7124 qui sont en mesure de consommer rapidement hexose et les sucres mixtes pentoses en enzyme saccharifiées hydrolysats undetoxified et d'accumuler plus de 40 g / L d' éthanol.
Abstract
Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme saccharification processes release sugars that can be fermented by yeast. Traditional industrial yeasts do not ferment xylose (comprising up to 40% of plant sugars) and are not able to function in concentrated hydrolyzates. Concentrated hydrolyzates are needed to support economical ethanol recovery, but they are laden with toxic byproducts generated during pretreatment. While detoxification methods can render hydrolyzates fermentable, they are costly and generate waste disposal liabilities. Here, adaptive evolution and isolation techniques are described and demonstrated to yield derivatives of the native Scheffersomyces stipitis strain NRRL Y-7124 that are able to efficiently convert hydrolyzates to economically recoverable ethanol despite adverse culture conditions. Improved individuals are enriched in an evolving population using multiple selection pressures reliant on natural genetic diversity of the S. stipitis population and mutations induced by exposures to two diverse hydrolyzates, ethanol or UV radiation. Final evolution cultures are dilution plated to harvest predominant isolates, while intermediate populations, frozen in glycerol at various stages of evolution, are enriched on selective media using appropriate stress gradients to recover most promising isolates through dilution plating. Isolates are screened on various hydrolyzate types and ranked using a novel procedure involving dimensionless relative performance index (RPI) transformations of the xylose uptake rate and ethanol yield data. Using the RPI statistical parameter, an overall relative performance average is calculated to rank isolates based on multiple factors, including culture conditions (varying in nutrients and inhibitors) and kinetic characteristics. Through application of these techniques, derivatives of the parent strain had the following improved features in enzyme saccharified hydrolyzates at pH 5-6: reduced initial lag phase preceding growth, reduced diauxic lag during glucose-xylose transition, significantly enhanced fermentation rates, improved ethanol tolerance and accumulation to 40 g/L.
Introduction
On estime à 1,3 milliards de tonnes sèches annuelles de la biomasse lignocellulosique pourraient soutenir la production d'éthanol et de permettre aux États – Unis de réduire sa consommation de pétrole de 30%. 1 Bien que la biomasse végétale mélanges rendements d'hydrolyse de sucre riches en glucose et xylose, des inhibiteurs de fermentation sont générés par le prétraitement chimique nécessaire pour briser l'hémicellulose et d'exposer la cellulose pour l'attaque enzymatique. L'acide acétique, furfural et hydroxyméthylfurfural (HMF) sont considérés comme des éléments clés parmi beaucoup d'inhibiteurs qui se forment pendant le prétraitement. Afin de déplacer l'industrie de l'éthanol lignocellulosique avant, la recherche et les procédures pour permettre l'évolution des souches de levures capables de survivre et efficacement fonctionner à utiliser à la fois hexose et les sucres pentoses en présence de ces composés inhibiteurs sont nécessaires. Une faiblesse supplémentaire significative des souches de levures industrielles traditionnelles, telles que Saccharomyces cerevisiae, est l'incapacité de Fermen efficacementt le xylose disponible en hydrolysats de la biomasse végétale.
La souche de type de Pichia NRRL Y-7124 (CBS 5773), récemment rebaptisé stipitis Scheffersomyces, est une levure de fermentation des pentoses native qui est bien connu pour fermenter le xylose en éthanol. 2,3 L'évolution de la souche NRRL Y-7124 a été poursuivi ici parce qu'il a été documenté pour ont le plus grand potentiel de souches de levures indigènes d'accumuler l' éthanol économiquement récupérables supérieure à 40 g / l avec peu de sous – produits de xylitol. 4,5,6 Dans les médias optimal, S. souche stipitis NRRL Y-7124 produit 70 g / L d' éthanol dans 40 heures (1,75 g / l / h) à un rendement de 0,41 ± 0,06 g / g dans des cultures de haute densité cellulaire (cellules 6 g / L). 7,8 Résistance à des inhibiteurs de fermentation de l' éthanol, le furfural, et HMF a également été rapportée, 9 et S. stipitis a été classé parmi les levures pentoses fermentant indigènes les plus prometteurs disponibles pour productio d'éthanol à l'échelle commercialen à partir de lignocellulose. 10 Notre objectif était d'appliquer divers hydrolysats lignocellulosiques undetoxified et des pressions de sélection de l' éthanol pour forcer l' évolution vers un dérivé plus robuste de la souche NRRL Y-7124 adapté aux applications industrielles. Key parmi les fonctionnalités améliorées recherchées étaient plus rapides taux de sucre d'absorption dans les hydrolysats concentrés, réduite diauxy pour une utilisation plus efficace mixte de sucre, et des tolérances plus élevées d'éthanol et d'inhibiteurs. L'application de S. stipitis à hydrolysats undetoxified était un élément clé de la recherche pour éliminer les charges d'exploitation ajoutée associés aux processus de désintoxication hydrolysats, tels que surchaulage.
Deux hydrolysats industriellement prometteuses ont été appliquées pour forcer l' évolution:. Enzyme saccharifié fibres d'ammoniac tiges de maïs hydrolysat d'expansion prétraité (AFEX CSH) et diluer l' acide prétraité panic hydrolysat liqueur (PSGHL) 11,12 technologie de prétraitement AFEX est développé àminimiser la production d'inhibiteurs de fermentation, alors que le prétraitement de l'acide dilué représente la technologie actuelle la plus économique la plus couramment pratiquée pour exposer la biomasse cellulosique pour la saccharification enzymatique. PSGHL peut être séparée de la cellulose restant après le prétraitement, et est typiquement riche en xylose à partir de l'hémicellulose hydrolysée, mais pauvre en glucose. AFEX CSH et compositions PSGHL diffèrent les unes des autres aspects clés qui ont été exploitées pour gérer le processus d'évolution. AFEX HCS est plus faible dans les aldéhydes furaniques et des inhibiteurs de l' acide acétique , mais plus élevé en acides aminés et des sources d'azote ammoniacal par rapport PSGHL (tableau 1). PSGHL présente le défi supplémentaire de xylose étant le sucre prédominant disponible. Ainsi PSGHL convient d'enrichir spécifiquement pour une meilleure utilisation de xylose dans hydrolysats, une faiblesse empêchant l'utilisation commerciale de la disposition de la levure. Même parmi les levures de fermentation de pentoses indigènes, le recours à la xylo du sucre suboptimalese pour soutenir la croissance cellulaire et la réparation devient encore plus difficile dans les hydrolysats en raison d'une variété de raisons:. carences en éléments nutritifs, les inhibiteurs causant des dommages étendus à la cellule intégrité structurelle, et la perturbation du métabolisme en raison de déséquilibres redox 9 azote supplémentation, en particulier sous la forme de les acides aminés, peuvent représenter un coût d'exploitation important pour fermentations. L'impact de la supplémentation en azote sur le dépistage isolat et le classement a été exploré avec hydrolysats panic.
Individus améliorés ont été enrichies dans une population en évolution en utilisant de multiples pressions de sélection dépendent de la diversité génétique naturelle du S. la population et des mutations induites par une exposition stipitis deux divers hydrolysats, l' éthanol ou le rayonnement UV. Des pressions de sélection sont appliqués en parallèle et en série pour étudier la progression de l' évolution de S. stipitis vers les dérivés souhaités capables de croître et de fermenter efficacement des hydrolysats(Figure 1). La mise en culture des populations répétitives fonctionnelles dans les hydrolysats de plus en plus difficiles a été réalisée en microplaques en utilisant une série de dilutions de 12%, soit glucane HCS AFEX ou bien PGSHL préparé à 20% de solides chargement. L'application de la croissance de l'éthanol-contestée sur xylose en culture continue d'améliorer encore les populations de CSH adaptée AFEX en enrichissant des phénotypes démontrant moins de sensibilité à l'éthanol répression de l'utilisation de xylose. Cette dernière caractéristique a été récemment montré problématique à l' utilisation des pentoses par la souche NRRL Y-7124 après la fermentation du glucose. 8 Enrichissement sur PSGHL a ensuite été explorée pour élargir la fonctionnalité hydrolysat.
Des dérivés améliorés putatifs de S. stipitis NRRL Y-7124 ont été isolés à partir de chaque phase du processus d'évolution en utilisant l' enrichissement ciblé dans des conditions de stress et dilution placage pour prélever des colonies de populations les plus répandues. Dimensionless par rapportindices de performance (RPI) ont été utilisés pour classer les souches en fonction de la performance globale, où le comportement cinétique a été évaluée sur les différents types d'hydrolysat et suppléments nutritifs appliqués. Bien que les succès de diverses procédures d'adaptation pour améliorer la fonctionnalité de S. stipitis dans hydrolysats lignocellulosiques ont déjà été documentés, les souches démontrant la production d'éthanol économique sur hydrolysats undetoxified ont pas été signalés précédemment. 13-17 En utilisant les procédures d'évolution à visualiser plus en détail ici, Slininger et al. 18 souches qui sont significativement améliorées par rapport élaboré la souche mère NRRL Y-7124 et sont en mesure de produire> 40 g / l d'éthanol dans AFEX CSH et hydrolysat enzymatique de panic saccharifié (SGH) complété de manière appropriée avec des sources d'azote. Ces nouvelles souches sont des intérêts futurs à la lignocellulose en développement à l'industrie de l'éthanol et en tant que sujets de la génomique supplémentaires d'études bâtimentsur ceux de souche séquencées précédemment NRRL Y-11545. 19 Une étude de la génomique des meilleures souches produites au cours des différentes phases de l' évolution schématisé à la figure 1 serait d' élucider l'historique des modifications génétiques qui ont eu lieu au cours du développement en tant que prélude à d' autres recherches sur l'amélioration de la souche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Plusieurs étapes ont été essentiels à la réussite du processus d'évolution. Tout d'abord, il est essentiel de choisir des pressions de sélection appropriés pour entraîner l'évolution de la population vers les phénotypes souhaités qui sont nécessaires pour une application réussie. Les contraintes sélectives suivantes ont été choisies pour S. stipitis développement et appliqué à des moments appropriés pour guider l' enrichissement pour les phénotypes souhaités: les forces cr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to express our sincere appreciation to Drs. Kenneth Vogel, Robert Mitchell and Gautam Sarath, Grain, Forage, and Bioenergy Research Unit, Agricultural Research Service, Lincoln, NE for their kind supply of switchgrass for this project. We also thank U.S. Department of Energy for funding to VB through the DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (GLBRC) Grant DE-FC02-07ER64494.
Materials
| Cellic Ctec, Contains Xylanase (endo-1,4-) | Novozymes | No product number | www.novozymes.com, 1-919-494-3000 |
| Cellic Htec, Contains Cellulase and Xyalanase | Novozymes | No product number | www.novozymes.com, 1-919-494-3000 |
| Toasted Nutrisoy Flour | Archer Daniels Midland Co. (ADM) | 63160 | ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL 1800-37-5843 |
| Pluronic F-68 (Surfactant) | Sigma-Aldrich | P1300 | Sigma-Aldrich |
| Difco Vitamin Assay Casamino Acids | Becton Dickinson and Company | 228830 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| D,L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T3300 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, Sigma-Aldrich |
| Bacto Agar | Becton Dickinson and Company | 214010 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Bacto Malt Extract | Becton Dickinson and Company | 218630 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Bacto Yeast Extract | Becton Dickinson and Company | 212750 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Peptone Type IV from soybean | Fluka | P0521-500g | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Adenine, > 99% powder | Sigma-Aldrich | A8626 | CAS 73-24-5, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Cytosine, > 99% | Sigma-Aldrich | C3506 | CAS 71-30-7, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Guanine, SigmaUltra | Sigma-Aldrich | G6779 | CAS 73-40-5, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Thymine, 99% | Sigma-Aldrich | T0376 | CAS 65-71-4, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Uracil, 99% | Sigma-Aldrich | U0750 | CAS 66-22-8, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous, Certified ACS | Fisher Chemical | D16-500 | CAS 50-99-7, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich |
| D-Xylose, assay > 99% | Sigma-Aldrich | X1500 | CAS 58-86-6, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich |
| 96-well, flat bottom plates | Becton Dickinson Falcon | 351172 | multiple suppliers: e.g. Thermo-Fisher, VWR, Daigger |
| Wypall L40 Wiper | Kimberly-Clark | towel in microplate boxes to absorb water for humidification; multiple suppliers: e.g. Thermo-Fisher, uline, Daigger | |
| Corning graduated pyrex flask, 125-mL, narrow opening (stopper #5) | Corning Life Science Glass | 4980-125 | multiple suppliers: e.g. Thermo-Fisher, VWR, Daigger |
| Innova 42R shaker/incubator, 2.5 cm (1") rotation | New Brunswick Scientific (1-800-631-5417) | M1335-0016 | multiple suppliers: e.g. Eppendorf, Thermo-Fisher. Other shaker/incubators with a 2.5 cm (1") throw could be used. |
| Duetz Cover clamp for 4 deepwell MTP plates | Applikon Biotechnology | Z365001700 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Duetz System sandwich cover for 96 deepwell plates | Applikon Biotechnology | Z365001296 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Duetz System silicone seal (0.8mm black low evap) for 96 deep well plate cover | Applikon Biotechnology | V0W1040027 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Blue microfiber layer for Duetz system sandwich cover | Applikon Biotechnology | V0W1040001 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| 96 well, 2 mL square well pyramid bottom plates, natural popypropylene | Applikon Biotechnology | ZC3DXP0240 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Bellco 32mm silicon sponge plug closures, pk of 25 for 125-mL flasks | Bellco | 1924-00032 | Thomas Scientific, their Catalog number is 1203K27 |
| Bellco Spinner Flask, 1968-Glass Dome, Sealable Flange Type, 100-mL working volume. This design no longer manufactured. | Bellco | 1968-00100 (original Cat. No.) | Jacketed vessels have lower inlet & upper outlet ports for temp. control with circulating water bath. Vessels are 75mm in outer diam and 200mm in height. There are four side ports at ~45o angles and one top port. Port openings appropriate size for size 0 neoprene stoppers (21-22mm inner diameters on ports). |
| Mathis Labomat IR Dryer Oven | MathisAg | Typ-Nbr BFA12 215307 | Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157 |
| Dual Channel Biochemistry Analyzer | YSI Life Sciences | 2900D-UP | www.ysi.com, robotic system for rapid sugars assay in 96-well microplate format |
| PowerWave XS Microplate Spectrophotometer | Bio-Tek Instruments, Inc | MQX200R | www.biotek.com |
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