Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

טכניקות האבולוציה של שמרי פנטוז-תוסס יציבים לשם bioconversion של lignocellulose כדי אתנול

doi: 10.3791/54227 Published: October 24, 2016

Summary

טכניקות אבולוציה והבידוד מסתגלים מתוארות והפגינו להניב נגזרות של stipitis זן Scheffersomyces NRRL Y-7124 כי הם מסוגלים לצרוך hexose במהירות וסוכרים מעורבים פנטוז ב אנזים saccharified hydrolyzates undetoxified וכדי לצבור יותר מ -40 גרם / אתנול L.

Introduction

שנתי מוערך של 1.3 מיליארד טון יבש של ביומסה lignocellulosic יכול לתמוך בייצור אתנול ולאפשר בארה"ב כדי להפחית את צריכת הנפט שלה ב -30%. 1 למרות תערובות סוכר תשואות הידרוליזה צמח ביומסה עשיר גלוקוז קסילוז, מעכבי תסיסה מופקים על ידי טיפול מקדים כימיים הדרושים לשבור hemicellulose ולחשוף תאית לתקיפה האנזימטית. חומצה אצטית, furfural, ו hydroxymethylfurfural (HMF) נחשבים מרכיבים מרכזיים בקרב מעכבים רבים יוצרות במהלך מקדים. על מנת להזיז את תעשיית האתנול lignocellulosic קדימה, מחקר ונהלים כדי לאפשר התפתחות של זני שמרים מסוגל לשרוד וביעילות מתפקד להשתמש בשתי hexose וסוכרים פנטוז בנוכחות תרכובות מעכבות כאלה נדרשים. חולשה משמעותית נוספת של זני שמרים מסורתיים תעשייתיים, כגון שמר אפייה, היא החוסר היכולת ביעילות fermenך * קסילוז זמין hydrolyzates של ביומסה במפעל.

זן סוג stipitis Pichia NRRL Y-7124 (CBS 5773), שמם לאחרונה Scheffersomyces stipitis, הוא שמרים תוסס פנטוז יליד כי היא ידועה לתסוס קסילוז כדי אתנול. 2,3 האבולוציה של זן NRRL Y-7124 נרדפה כאן כי זה תועד כדי יש את הפוטנציאל הגדול של זני שמרים יליד לצבור אתנול ההשבה כלכלית של מעל ל -40 g / L עם תוצר לוואי קסיליטול מעט. 4,5,6 בשנת מדיה אופטימלית, S. stipitis זן NRRL Y-7124 מייצרת 70 גר '/ ל אתנול 40 שע' (1.75 גר '/ ל / hr) בתשואה של 0.41 ± 0.06 g / g בתרבויות צפיפות התאים גבוהה (6 גרם / תאים L). 7,8 ההתנגדות אתנול מעכבי תסיסה, furfural, ו HMF גם דווחה, 9 וס stipitis כבר מדורג בין שמרים המבטיחים ביותר פנטוז-תוסס מקוריים זמינים עבור productio אתנול בקנה מידה מסחריתn מ lignocellulose. 10 הציב לעצמנו היעד ליישם hydrolyzates lignocellulosic undetoxified המגוון לחצי ברירת אתנול לכפות אבולוציה לקראת נגזרת חזקה יותר של זן NRRL Y-7124 מתאימים ליישומים תעשייתיים. מפתח בין תכונות משופרות בקשו היה שיעורי ספיגת סוכר מהר יותר hydrolyzates המרוכז, מופחת diauxy לניצול סוכר מעורב יעיל יותר, ואת העמידות גבוהה של אתנול ומעכבים. היישום של ס stipitis כדי hydrolyzates undetoxified היה מוקד מרכזי של מחקר כדי לחסל את ההוצאות התפעוליות הוסיף הקשורים בתהליכי ניקוי הגוף hydrolyzate, כגון overliming.

שני hydrolyzates מבטיח תעשייתי יושם לכפות אבולוציה:. אנזים אמונית סיבי saccharified-pretreated הרחבת התירס סטובר hydrolyzate (AFEX CSH) לדלל לייקר hydrolyzate וקליפות-pretreated חומצה (PSGHL) 11,12 הטכנולוגיה מקדימה AFEX מפותחת כדילמזער את הייצור של מעכבי תסיסה, תוך טיפול מקדים חומצה לדלל מייצג את הטכנולוגיה בעלות הנמוכה ביותר הנוכחית הנפוץ ביותר מתורגל לחשוף ביומסה מתאית עבור saccharification האנזימטית. PSGHL ניתן להפרדה מן התאית הנותרת לאחר טיפול מקדים והוא אופייני עשיר קסילוז מן hemicellulose הידרוליזה, אך נמוך ב גלוקוז. CSH AFEX ויצירות PSGHL נבדלים זה מזה בהיבטים מרכזיים אשר נוצלו כדי לנהל את תהליך האבולוציה. AFEX CSH נמוך ב אלדהידים furan ומעכבי חומצה אצטית אך גבוה ב חומצות אמינו מקורות חנקן אמוניה לעומת PSGHL (טבלה 1). PSGHL מציג את האתגר הנוסף של קסילוז להיות סוכר השולט זמין. לפיכך PSGHL ראוי להעשיר במיוחד עבור ניצול קסילוז השתפר hydrolyzates, חולשה מניעת שימוש מסחרי שמרים זמין. גם בקרב שמרים תוססים פנטוז ילידים, ההסתמכות על Xylo הסוכר לא הטובse לתמוך צמיחת תאים ותיקון הופך להיות אפילו יותר מאתגר hydrolyzates בגלל מגוון סיבות:. חסרים תזונתיים, מעכבי גרימת נזק נרחב לתא השלמות המבנית, ושיבוש חילוף החומרים בשל חוסר איזון חיזור 9 תוספת חנקן, בעיקר בצורה של חומצות אמינו, יכולות לייצג עלות תפעולית משמעותית עבור fermentations. ההשפעה של תוספת חנקן על הקרנה לבודדת ודירוג שנחקרה עם hydrolyzates וקליפות.

אנשים משופרים הועשרו בתוך אוכלוסייה מתפתחת באמצעות לחצי בחירה מרובים סומך על מגוון גנטי הטבעי של ס האוכלוסייה ומוטציות stipitis המושרה על ידי חשיפות שני hydrolyzates מגוונים, אתנול או קרינת UV. לחצי ברירה יושמו במקביל ובסדרות לחקור את התקדמות האבולוציה של ס stipitis כלפי נגזרים רצויים מסוגלים לגדול להתסיס ביעילות hydrolyzates(איור 1). Culturing החוזרת של אוכלוסיות תפקודיות hydrolyzates המאתגר יותר ויותר הושגה microplates העסקת סדרת דילול של אחד CSH 12% גלוקן AFEX או אחר הכינו PGSHL ב טעינה מוצקה 20%. היישום של צמיחה תיגר-אתנול על קסילוז בתרבות רציפה שיפור נוסף אוכלוסיות AFEX CSH מותאם על ידי העשרת עבור פנוטיפים הוכחת פחות רגישות אתנול דיכוי וניצול קסילוז. התכונה האחרונה הוצגה בעייתית לאחרונה לניצול pentose ידי זן NRRL Y-7124 בעקבות תסיסת גלוקוז. 8 עשרה על PSGHL שנחקרו ליד להרחיב פונקציונליות hydrolyzate.

נגזרים השתפרו משוערים של ס stipitis NRRL Y-7124 בודדו כל שלב של תהליך האבולוציה באמצעות העשרה ממוקד בתנאי מתח ציפוי דילול לבחור מושבות מתוך האוכלוסיות הכי הנפוצות. ביחס מימדיםמדדי ביצועים (RPIs) שמשו לדרג זנים מבוססים על ביצועים הכוללים, שבו התנהגות הקינטית הוערכה על סוגי hydrolyzate שונים ותוספי מזין מיושמים. למרות ההצלחות של הליכי עיבוד שונים על מנת לשפר את הפונקציונליות של ס stipitis ב hydrolyzates lignocellulosic תועדו בעבר, זנים הוכחת ייצור אתנול חסכוני על hydrolyzates undetoxified לא דווחו בעבר. 13-17 שימוש בהליכים האבולוציה להיות דמיינו בפירוט רב יותר כאן, Slininger et al. 18 פיתחו זנים כי הם השתפרו באופן משמעותי על זן ההורה NRRL Y-7124 והם מסוגלים לייצר> אתנול 40 גר '/ ל ב CSH AFEX האנזים hydrolyzate וקליפות saccharified (SGH) השלימו כראוי עם מקורות חנקן. זני רומן אלה הם בעלי העניין עתידי lignocellulose בפיתוח לתעשיית אתנול כסובייקטים של בניין מחקרים הגנומיקה נוספותעל אלה של Y-11,545 NRRL זן רצף בעבר. 19 מחקר הגנומיקה של זנים העליונים הנוצרים במהלך שלבים שונים של התפתחות שרטט באיור 1 היה להבהיר את ההיסטוריה של שינויים גנטיים שהתרחשו במהלך ההתפתחות כהקדמה לקדם מחקר שיפור זן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. כן החל חומרים וציוד לבניית מבחנים

  1. כן hydrolyzates באמצעות 18 עד 20% ביומסה ראשונית משקל יבש התגובה המקדימה לשימוש באבולוציה, הבידוד ונהלי דירוג. ראה Slininger et al. 2015 18 עבור השיטות המפורטות להכין AFEX CSH, PSGHL, ו SGH עם תוספי חנקן N1 או N2 להשתמש באבולוציה, בידוד או דירוג. ראה טבלה מס '1 עבור הרכב כל סוג hydrolyzate.
    הערה: ביצורי חנקן של SGH יועדו SGH-N1 או SGH-N2 המוגדר כדלקמן: SGH-N1 = SGH מועשר ל -42: 1 טוחן פחמן יחס חנקן (C: N) עם מקורות חנקן כולל אמינו אוריאה, ויטמין ללא חומצות קזאין, D, L- טריפטופן, L- ציסטאין, ויטמינים ממקורות מוגדרים (כך ~ 15% של N חנקן הטוחן הוא חנקן אמינו עיקרי (PAN) ו ~ 85% של N הוא מ- האוריאה); SGH-N2 = SGH מועשר ל -37: 1 C: N עם אוריאה וקמח סויה כמו o מסחרי המקור הנמוך העלותf חומצות אמינו וויטמינים, מתן ~ 12% של N מ PAN ו -88% כמו אוריאה.
  2. רוכשת תרבות lyophilized של זן ההורה, Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 (CBS 5773) מאוסף תרבות ARS (המרכז הלאומי למחקר ניצול חקלאי, פאוריה, אילינוי), ולהכין תרבויות מלאי גליצרול על פי ההנחיות. לשמור על תרבויות מניות של שמרי ההורה ונגזרותיו גליצרול 10% ב -80 ° C.
    1. מניות גליצרול Streak כדי דקסטרוז שמרים מאלט peptone (י"מ) צלחות אגר (3 תמצית שמרים g / L, 3 גר '/ ל תמצית מאלט, 5 גר' / ל peptone, 10 גר '/ דקסטרוז L, 20 גר' / ל אגר) דגירה -48 72 שעות ב 25 מעלות צלזיוס. 8 צלחות מפותחות ניתן לאחסן עד שבוע ב 4 ° C לפני השימוש inocula נוזל טרום התרבות.
  3. כן אופטימלי מוגדר הבינוני (ODM), מדיום סינטטי תואם לנהלי ניסוח תעשייתיים 20 אשר פותח בעבר עבור המרה אופטימלית של קסילוז כדי אתנול על ידי str ההורהAin Scheffersomyces (Pichia) stipitis Y-7124 NRRL. 7 השתמש בינוני מוגדר בכל precultures ותרבויות עבור bioassays ביצועים התסיסה וגם עבור אתנול תיגר, התפתחות תרבות רציפה Fed-xylose. רכב ODM מופיע לעיון בטבלה 2.
  4. כפי שתואר קודם לכן, 18 לנתח ביומסה התא באמצעות ספקטרופוטומטר קריאה cuvette- או מיקרו-צלחת, על פי הצורך, כדי למדוד ספיגת התרבות ב 620 ננומטר (א 620). לכמת סוכרים, אתנול, furfural, hydroxymethylfurfural (HMF), וחומצה אצטית בדגימות התרבות באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC) או קביעה האנזימטית רובוטית של גלוקוז קסילוז עבור תפוקה גבוהה יותר.

2. העשר נגזרים יציבים במהלך העברה סידורית על AFEX CSH

  1. לחסן preculture של זן NRRL Y-7124. העברת תאים אגר י"מ 75 מ"ל ODM + 150 גר '/ קסילוז L לשמור על היכולת לגדול תחת oמתח smotic. דגירה precultures ב 125 מ"ל צלוחיות נסגר עם ספוג סיליקון המתחבר 24 שעות ב 25 ° C עם רועד (150 סל"ד, 1 "במסלול).
  2. aliquots קפוא להפשיר של 6-12% גלוקן CSH AFEX במים קרים לשימוש. התאם ל- pH 5 במידת הצורך ולסנן לעקר לפני הכנת סדרה דילול 96 גם microplates.
  3. מלאו microplates עם 50 μl לכל טוב ו -8 בארות לכל דילול hydrolyzate, אז לחסן עם כמה מיקרוליטר של preculture לכל טוב לאפשר ספיגה ראשונית (620 ננומטר) 620 ≥0.1. דגירה צלחות 24-48 שעות סטטי של 25 מעלות צלזיוס בקופסת פלסטיק עם מגבת נייר רטוב עבור לחות.
  4. באמצעות דילול hydrolyzate המרוכז ביותר כי בעליל גדל ל A μl 620> 1, העברת 1-5 היטב בכל סדרת דילול hydrolyzate חדשה להשיג ראשוני, 620 ≥0.1.
  5. צג תרבות צמיחה 620 microplates עם ספקטרופוטומטר. Ser סדרת דילול uninoculatedves כביקורת ואטומות. מכסים בצלחת נותרים על במהלך ניטור על מנת למנוע זיהום, ואת הקריאות בהתאם.
  6. הכן מניות גליצרול של תרבויות הסתגלות בקביעות לבידוד הבא של זנים משופרים או לשימוש reinoculating סדרת דילול hydrolyzate שתמשיך. כדי להכין מלאי, ברכה ארבע בארות (200 μl) של ריכוז hydrolyzate הגדול יישב. מערבבים 1: 1 עם 20% גליצרול סטרילי cryovials, להקפיא תאים גליצרול 10% ב -80 ° C.
  7. חזור על שלבים 2.3-2.6 עד שהצמיחה ב -12% גלוקן AFEX CSH גלוי בעקביות ב 24 שעות.

Cell 3. בודד יחיד סובלני נגזר לאחר עשיית עושר על AFEX CSH

  1. Streak שנבחר מניות גליצרול של תרבויות הסתגלות אגר י"מ, ופסי שימוש לחסן 50 μl של 3% או 6% גלוקן AFEX CSH (pH 5) בכל אחת משלוש בארות microplate (ראשוני, 620 ~ 0.1). דגירה microplates 24 שעות כמו בשלב 2.3. העתק ברכהte יישבו בארות כוח hydrolyzate הגבוהה ביותר עם צמיחה חזקה, צלחת דילול י"מ או 6% AFEX גלוקן אגר CSH. הכן את האחרון בתור 1: תערובת 1 של מסנן מעוקר 12% CSH AFEX גלוקן עם פתרון אגר autoclaved חם 30 גר '/ ל.
  2. פיק 5 מושבות אחת מן הצמיחה מראה צלחת דילול הגבוהה ביותר לאחר דגירת 24-48 שעות ב 25 ° C להקפיא כמו תרבויות מלאות גליצרול. Streak כל מושבה לצלחת י"מ. דגירה 24 שעות. עם לולאה סטרילי, להעביר פס שפותחה של תאים בנפח קטן של גליצרול 10%, לערבב להשעות תאים, ולהפיץ 2-3 cryovials להקפאה ב -80 מעלות צלזיוס.

4. בדקו את הביצועים של נגזרים סובלניים CSH AFEX לעומת הורה

  1. מבחן מבודד פשוט 6% גלוקן AFEX CSH תרבויות אצווה.
    1. העברת תאים 48 צלחות hr מפוספס ממניות גליצרול למאגר פוספט pH 7 אשלגן (0.4 מ"מ) כדי להכין השעיות תא עם שימוש 620 = 10. 1 μl שלהשעיה כל לחסן כל אחת מארבע בארות של 50 μl 3% גלוקן hydrolyzate ראשונית 620 = 0.2. דגירה microplates 24 שעות כמו בשלב 2.3. הכן את CSH AFEX 3% גלוקן ב- pH 5 על ידי דילול 12% CSH AFEX גלוקן 1: 3 עם מים סטריליים.
    2. העברת שני 24 hr בארות microplate לחסן 25 מ"ל precultures של pH 5 12% גלוקן AFEX CSH בשימוש ב -50% של כוח מלא. דגירה precultures ב 50 מ"ל צלוחיות עם סגרים ספוג סיליקון עבור 24 שעות ב 25 מעלות צלזיוס, סל"ד ~ 150 (1 "במסלול) מכינים את CSH AFEX-בעוצמה פחותה 12% גלוקן ידי דילול hydrolyzate 1:. 1 עם מים סטריליים.
    3. השתמש חצי כוח precultures hydrolyzate לחסן 25 דומה מ"ל תרבויות הצמיחה הראשונית, 620 = 0.1. דגירת תרבויות הצמיחה כנ"ל (4.1.2) ולטעום יומי (0.2 מיליליטר). הצטברויות צג של ביומסה (א 620) וריכוזים של סוכרים ומוצרי תסיסה (HPLC).
  2. לחלופין, repitch (כלומר, קציר reuse) אוכלוסיות של 6% AFEX גלוקן שמרים CSH-גדל לבדיקה 8% תרבויות אצווה hydrolyzate גלוקן, כפי שתואר לעיל. 18
  3. לחלופין, אוכלוסיות בדיקה נוספת של תרבויות CSH repitched 6% גלוקן AFEX ידי האכלה עם 12% גלוקן hydrolyzate, כפי שתואר לעיל. 18
  4. בדוק בפיגור diauxic של בידודים בתרבויות אצווה של ODM עם סוכרים מעורבים.
    1. לחסן precultures של ODM 75 מיליליטר עם קסילוז 150 גר '/ ל 125 מיליליטר צלוחיות עם סגרים ספוגים סיליקון באמצעות העברת לולאת פסי גליצרול י"מ. דגירה 24 שעות כמו בשלב 2.1.
    2. השתמש precultures לחסן 75 דומה מ"ל תרבויות מבחן עם ODM המכיל 75 גרם / L של גלוקוז 75 גרם / ליטר של קסילוז ב- pH 6.5. Shake צלוחיות של 25 מעלות צלזיוס, 150 סל"ד. בואו לטעום יומי.
    3. לחלופין, לבדוק את ההשפעה של חומצה אצטית 0-15 g / L על diauxy במהלך התסיסה של גלוקוז קסילוז באמצעות פרוטוקול דומה, למעט pH הראשוני מוגדר על 6.0 ± 0.2 בתרבויות הבדיקה לשמור pH 6-7 duלצלצל צריכת חומצה אצטית, כפי שתואר לעיל. 18

5. החל תרבות ממושכת בחר עבור ניצול Xylose מאותגרי אתנול

  1. כן ODM כמדיום להאכיל התרבות הרציף עם קסילוז 60-100 גר '/ ל, 20-50 גר' / אתנול L ב- pH 6.3 ± 0.2. בחר שילובים של קסילוז ואתנול כדי לדמות את התסיסה החלקית של קסילוז 150 גר '/ ל, בהנחת תשואה פוטנציאלית של ~ 0.5 גרם אתנול / g קסילוז, וכדי להתאים את פוטנציאל 50-70 גר' / ל אתנול להתרחש. 8
  2. כדי להכין את בידוד התרבות הרציף, להעביר נציג AFEX מושבת CSH הסובלנית (מקבילה Colony 5 בדוגמא, איור 1) על ידי לולאה מתוך צלחת 48 שעות י"מ 75 מיליליטר של ODM חינם-אתנול (100 גר '/ ל קסילוז, במקרה זה) ב 125 מ"ל צלוחיות. לדגור על 25 מעלות צלזיוס, 150 סל"ד (1 "במסלול) למשך 24 שעות. בחר את ריכוז קסילוז ODM preculture להתאים כי המנפח מחזיק התרבות הרציפה הראשוני.
  3. לחסן נפח מחזיק תרבות רציפה של ODM ב- pH 6.3 ± 0.2 100 גר '/ ל קסילוז + 20 גר' / ל שיש אתנול עם ~ 5-10 מ"ל של תרכיז preculture של לבודד AFEX CSH סובלנית (מקביל Colony 5, איור 1 ) כדי להשיג 100 מיליליטר ב ראשוניים, 620 ~ 0.5. לשמור על היקף החזקת תרבות (V R), של 25 מעלות צלזיוס בבקבוק טווה 100 מ"ל במקטורן בחש ב 200 סל"ד ו לבוש עם אלקטרודת pH sterilizable, בקר pH ואמבט מים במחזור טמפרטורה מבוקרת.
  4. בתחילה, שכן צמיחת תא תהיה איטית עקב החשיפה אתנול, להגדיר מדיום להאכיל למינון באמצעות משאבת pH-ומונע. הגדר את המשאבה להאכיל ODM pH-6.3 עם 100 גר '/ ל קסילוז ואתנול 50 גר' / ל כאשר תסיסת התרבות מפילה את ה- pH 5.4, ובכך לעצור ירידת pH נוספת. לשמור על הנפח של 100 מיליליטר עם משאבת שפכים חולפת ביעף על פני שטח התרבות ברציפות. כתוצאה מכך, ריכוז אתנול עולה עם מטבוליזם והאכלת המשך. המדוד בשפכים לצייר דוגמאות (1-2 מיליליטר) מתרבויות רציפות כל 48-72 שעות עבור ניתוח ריכוזי תא קיימא, מוצרי מצעים, כפי שתואר לעיל. 18 כדי למצוא ריכוז תאי קיימא, לעשות סדרתי דילולי 1:10 של דגימות חיץ (ראה 4.1.1) וצלחת התפשטות דילולים כדי אגר י"מ (ראה 1.2.1). בהתבסס על שיעורי גביית שפכים (Q), לחשב את שיעור הדילול (ד) (Q / V R), ו, בדוגמא של ס stipitis, זה נע בין 0 כדי 0.01 hr -1.
  5. שמור מניות גליצרול בקביעות על ידי בידוד מצלחות כדאיות של דילולים מדגמים שנאגרו להרכיב 30-100 מושבות, מייצג מתיישבים חזקים הנפוצים ביותר באותה תקופת העשרה. צלחות מבול עם ~ 5 מיליליטר של גליצרול 10% על מנת לאפשר הכנה של cryovials הכפול. לצורך תחזוקה או פוגה, לעצור את התרבות הרציפה מחדש לפי צורך באמצעות רוב נוכחי (עמיד) גליצרול מניות (ים).
  6. כדי להפעיל מחדש, פס המניה גליצרול (ים) של רובאוכלוסיות עמידות אגר י"מ ולהעביר 24-48 תאי hr ידי לולאה על-תרבות פרה של ODM אתנול ללא לאינקובטורים כנ"ל. לחסן 100 המ"ל מחזיק נפח של ODM כדי ראשוניים, 620 0.5 באמצעות תרכיז של שמרי precultured, ולאפשר התרבות לגדול תצווה חכם לשלב נייח לפני זרימת בינוני ההזנה מחדש.
  7. אם תרבויות יכולות לגדול בהתמדה ב> 0.01 hr -1 קסילוז בנוכחות> אתנול 25 גר '/ ל, להתחיל להאכיל תרבות הרציפה (ODM + 60 גר' / ל קסילוז + אתנול הנע בין 30 ל -50 g / L) בשפל שיעור הדילול ~ 0.01 hr -1 ל -100 מ"ל מחזיק נפח (בתחילה ODM + 60 גר '/ ל קסילוז + 20 גר' / ל אתנול). במשך הזמן, להעלות את אתנול בהזנה לכיוון 50 גר '/ ל. לכידת אוכלוסיות מתקדמות מניות גליצרול.
    הערה: שמירה על שיעור הדילול הנמוך מאפשרת היווצרות של ריכוז תא מספיק גבוה כדי לצמצם זמין חמצן ותסיסת תמיכה.
  8. לחלופין, ליישם אולטרה סגול (UV) irradiatיון חודשי גליצרול אוכלוסיות מניות המשמש reinoculate תרבויות רציפות.
    1. מושבות גלולות מן הפסים מלאים גליצרול ב 10 מיליליטר של ODM (כמו precultures) עם 60 גר '/ ל קסילוז, וברכה כל המניות בבקבוק סטרילי יחיד. החל את ההשעיה תא ונקווה ב ~ 5 x 10 8 מ"ל תאים / מעשית רק לכסות את חלקם התחתון של 4-5 צלחות פטרי עם 6 מ"ל / צלחת. כדי להשיג כיסוי 6 מיליליטר של צלחת פטרי הפנויה סטנדרטית, לוותר 15 מיליליטר להתגבר מתח פנים, ולאחר מכן סר 9 מיליליטר.
    2. לחשוף כל צלחת תרבות פתוחה UV ממקור האור בתוך ארון בטיחות ביולוגית. התאם את זמן החשיפה UV או המרחק להשיג שיעור להרוג הרצוי> 90%. כאן, לחשוף במשך 45 דקות ב כ -56 ס"מ מהמקור.
    3. לדלל השעיות תא צלחת לפני ואחרי ההקרנה. שיעור להרוג לאומדן המבוסס על הקמת יחידות מושבה. עבור ס stipitis למשל, שיעור החיסול היה ~ 97%.
    4. מעבירים את תרבויות חשופים UV (24-30 מ"ל) ל א-cov רדידered 50 מ"ל בבקבוק, לדגור על 25 מעלות צלזיוס, 150 סל"ד במשך 24 שעות כדי לאפשר אחוז קטן של תאים קיימא לאכלס מחדש כדי ~ 1 x 10 8 ס קיימא stipitis תאים / מ"ל. על ידי מניעת reactivations צילום, עטיפת רדיד משמרת מוטציות בעוד תרבויות מודגרת.
    5. השתמש תרבות mutagenized אוכלסה מחדש לחסן תרבויות רציפות ~ 1 x 10 7 תאי קיימא / מיליליטר. הפעל מחדש את ההזנה בינוני מועשר אתנול ODM + 60 גר '/ ל קסילוז להמשיך בתהליך הבחירה.

6. הערכת האוכלוסיות מלאות גליצרול ולזהות בעלי משופרת Xylose תסיסה בנוכחות של אתנול

  1. Streak שנבחר תרבויות מלאות גליצרול כדי אגר י"מ כצעד הראשון במסך לצמיחה הטובה ביותר ותסיסה של קסילוז בנוכחות של אתנול.
  2. העבר כל אוכלוסייה התפתחה שיוקר מן הפסים אגרו 75 precultures מיליליטר ב ODM עם 150 גר '/ ל גלוקוז, דגירה ב -125 מיליליטר צלוחיות 96 hr לפני השימוש כפי inocula עבור תרבויות מבחן. האוכלוסיות גלוקוז-ותופחים תדרושנה אינדוקציה של אנזימים לניצול קסילוז.
    1. כדי לבדוק אינדוקציה, לקצור כל תרבות, להשעות תאים 30 מ"ל, הראשונית, 620 של 40 ODM +60 גר '/ ל קסילוז + 30-45 גר' / ל אתנול, ו לדגור על 25 מעלות צלזיוס, 150 סל"ד (1 "במסלול) ב 50 מ"ל צלוחיות עם סגרים ספוג סיליקון. צייר דגימות פעמיים ביום לניטור ספיגת קסילוז ידי ניתוח HPLC.
  3. לחלופין, כמתואר Slininger et al., 18 להעריך צמיחה על קסילוז בנוכחות של אתנול, להכין precultures של כל האוכלוסייה התפתח על ידי לולאה העברת 75 מ"ל של ODM עם 150 גר '/ קסילוז L ב 125 מ"ל צלוחיות, דגירה 96 שעות ב 25 מעלות צלזיוס, 150 סל"ד (1 "במסלול). לחסן תרבויות מבחן על שפל ראשוני 620 של 0.1 ב 25 מיליליטר של ODM + 60 גר '/ ל קסילוז + 30-45 גר' / ל אתנול 125 מיליליטר צלוחיות. דגירה צלוחיות של 25 מעלות צלזיוס, 300 סל"ד, 1 "במסלול מדגם.

ילדה = "jove_title"> 7. לבודד מושבות מתא בודד מנצלות Xylose ב PSGHL כאשר אתנול האם הווה

  1. בהתבסס על תוצאות של צעד 6, בחר אוכלוסיות מלאות גליצרול מציגות יכולת מעולה לגדול עוד ועוד להתסיס קסילוז בנוכחות של אתנול. השתמש אלה צלחות פס. צלחות הפס משמשות להכנת השעיות תא צפופות, שנאגרו של A 620 = 5. ואז השעיות תא משמשות לחסן precultures צלחות 96-באר עמוק עד א 620 = 0.5. לחסן 1 מ"ל precultures על PSGHL מעורבב 1: 1 עם ODM + 50 גר '/ ל קסילוז (לא אתנול). דגירת precultures ב 96-היטב, צלחות באר עמוקות עם אידוי נמוך פרק מכסות במשך 48 שעות ב 25 מעלות צלזיוס, 400 סל"ד, 1 "במסלול. אוכלוסיות מלאות גליצרול שונות ונפרדות ידי בארות ריקות.
  2. באמצעות כל preculture, לחסן שש עשר 1 מיליליטר לשכפל תרבויות ראשוניות, 620 ~ 0.5 ב 1: 1 PSGHL: ODM + 50 גר '/ ל קסילוז עם 20, 30, או 40 גר' / ל אתנול להעשיר מתיישבים סובלניים. דגירת cultu עשרהמיל בדומה precultures.
  3. עבור כל מנית גליצרול שונה, לקצור את בארות התרבות עם ריכוז אתנול הגבוה ביותר המאפשר שימוש צמיחת קסילוז. פלייט כל קו התא כדי אגר י"מ להשיג מושבות אחת נפוצה לשמר גליצרול. פיק עשר מושבות בכל שורת תא פס כל לצלחת אגרה י"מ להכנה מלאה גליצרול.

8. נוספים להעשיר זנים התפתחו יציבים במהלך העברה סידורית על PSGHL, ובאשר AFEX CSH

  1. כן-תרבויות קדם של NRRL Y-7124 (הורה), AFEX CSH סובלני התפתח לבודד, והתרבות רציפה התפתחה אוכלוסייה עם יכולת המשופרת להשתמש קסילוז בנוכחות של אתנול. לחסן 75 מ"ל של ODM + 150 גר '/ ל קסילוז ידי לולאה פסים מלאי גליצרול כפי שתואר לעיל (שלב 2.1) עבור תהליך הסתגלות AFEX CSH hydrolyzate.
  2. לדלל PSGHL עם מים כדי לספק סדרה של ריכוזים גוברים. הכן מיקרו-צלחת 96-היטב עבור כל אחד שורות תאים שלוש באמצעות כלדילול PSGHL למלא 8 בארות עם 50 μl. השתמש preculture כדי לחסן כל 50 μl-תרבות המיקרו של סדרת הדילול כדי ראשוני, 620 ~ 0.1-0.5.
    1. המשך ההתפתחות של שמרים בהגדלת חוזק של PSGHL באותו אופן כמו הסתגלות AFEX CSH hydrolyzate שפורטה לעיל (שלב 2) עד תרבויות מסוגלות לגדול hydrolyzate עוזה ביחס ממוצע 14-ד יציב של ΔA 620 לכל Δtime כהעברה סדרתי הם המשיכו בארבעה חודשים נוספים.

9. מושבות מתא בודד בודדת על ידי מפלי PSGHL עם או בלי אתגר אתנול

  1. השג-תא בודד ומבודד ישירות צלחות הסתגלות סופיות מלא כוח PSGHL ידי ציפוי דילול כדי אגר י"מ. פיק עשרה מושבות גדולות עבור כל אחד מקווי שלושה התא פס בר צלחות י"מ להכין מניות גליצרול כפי שתואר לעיל (שלב 3.2).
  2. לחלופין, לחקור קודם לכן נקודות זמןתהליך האבולוציה על ידי בידוד ממניות גליצרול מאוחסן של שורות תאים שלוש.
    1. לחסן preculture עבור כל קו התא על ידי לולאה פסים מלאי גליצרול דגירה 24 שעות על קסילוז 30 מ"ל ODM + 50 גר '/ ל (50 מ"ל צלוחיות, 25 ° C, 150 סל"ד).
    2. תאי אתגר מן precultures לצמיחת hydrolyzate ידי ייחס 50 μl של PSGHL 50% בבארות microplate אל ראשוניים, 620 ~ 0.2 דוגרי hr 48 סטטי.
    3. מורחים 0.1 מ"ל של כל תרבות מועשר על צלחות אגר שיפוע PSGHL בטווח שבין 0 ל 50% כוח hydrolyzate (מתן ~ 300-400 תאים קיימא לכל צלחת), ולאסוף 10 מושבות אחת בכל שורה תא מאזור ריכוז hydrolyzate הגבוהה ביותר של שיפוע . 21 Streak הרי מושבות י"מ להכנה מלאה גליצרול כמו בשלב 3.2.
    4. כחלופה לשלב 9.2.3, במקום לחסן את צלחות אגר שיפוע, לחסן בארות של 96-היטב צלחות מיקרו הראשונית, 620 ~ 0.2, wheמחדש את הבארות נועדו להכיל מגוון של ריכוזי hydrolyzate בין 50 ל -100% כוח אתנול 10 עד 40 גרם / L. במקרה זה, לפתח מיקרו צלחות 72-96 שעות ואחרת כמו בשלב 2.3. לבודד עשר מושבות אחת מבארות של שילובי hydrolyzate-אתנול החריפים מראים צמיחה באמצעות ציפוי דילול, ולהכין מניות גליצרול כמו בשלב 3.2.

10. במסך ראשי, לחסל מבודדים נחות ידי השוואה ודירוג הופעות על PSGHL בבית שני תנאים מזינים

  1. החל מסך צלחת באר עמוקה גבוהה תפוקה של ביצועי PSGHL למסך חמישה סטים של שלושים מבודדים יחד עם NRRL Y-7124 הורה AFEX לבודד CSH סובלני (מקביל Colony 5 של דוגמא אבולוצית איור 1) שולט לבחור שישה זנים עליונים (20%) מן כל קבוצה כדי לעבור לשלב המיון המשני (שלב 12).
  2. לבצע את המסך צלח גם עמוק מלא 1 מיליליטר לכל היטב מכוסה wiמכסה נירוסטה ה עם חותמות אוויר נמוכות סיליקון שחור. הצמד את כל הצלחות אל מועצת המנהלים של החממה / שייקר ולהפעיל במהירות של 25 ° C ו 400 סל"ד (1 "במסלול שייקר). עיצוב כל באר עמוק צלחת מילוי תבניות לאפשר הפרדה מבודדת שונה על ידי בארות פתוחות.
  3. כדי להתחיל cultivations, לבחור חרוז של תאי פסי גליצרול שהוכנו 30 מבודד השיג כנ"ל (בשלבי 3, 7, ו -9) לשכפל בארות של ODM + 50 גר '/ ל קסילוז דגירת 48 שעות.
  4. כמדיום אתגר עבור מבודד preculturing, להכין 50% PSGHL ידי ערבוב PSGHL 1: 1 עם ODM + 10 גר '/ ל גלוקוז + 50 גר' / ל קסילוז. להקרנת 30 בידודים ושני זנים מלאים, 2 צלחות עם 2 בארות לכל אחד 16 בידודים מלאים, עוזבים בארות ריקות בין הבידודים השונים.
  5. עבור תרבויות אתגר, העברה, נפח 50 μl של תרבויות קדם ODM (א 620 ~ 10) לכל אחת משתי בארות תרבות 50% PSGHL אתגר עבור כל אחד המבודד ושולט להשיג initiאל 620 ~ 0.5 דגירה 72 שעות.
  6. השתמש בשתי מדיה במבחן העושר תזונתי שונה להקרנה מבודדת: 60% PSGHL + מזיני ODM; ו -75% PSGHL + מזין ODM + י"מ. להוסיף חומרים מזינים ODM (למעט סוכרים) ב מחצית כוח כסטנדרט עבור ODM להשתמש עם 50 גר '/ ל סוכר (שלב 1.3). כמיועדים, להוסיף חומרים מזינים י"מ (למעט סוכרים) ב מחצית הכח הסטנדרטי של תמצית שמרי 3 גר '/ ל, 3 גר' / ל תמצית מאלט, 5 גר '/ ל peptone.
  7. לחסן תרבויות בדיקה על ידי העברת 50 μl של 72 שעות 50% PSGHL אתגר מראש תרבויות לחסן 1,000 μl ראשונית 620 ~ 0.5 בחמש בארות עמוקות לכל אחת משתי מדיה בדיקה.
  8. בואו לטעום כל לבודד יומי. פיפטה את התוכן של באר לצינור צנטריפוגות microfuge (5,533 XG, 15 דק ') כדי להשיג supernate עבור אתנול, גלוקוזה קסילוז תפוקה גבוהה מנתח. מדוד ביומסה כמו 620 ב 96-גם מיקרו-צלחות (200 μl / טוב) עם ספקטרופוטומטר A.
  9. בתוך כל קבוצה של 30 היאolates נבדק (5 סטים עבור NRRL Y-7124 התפתחו זני stipitis ס), לחשב מדדי ביצועים יחסיים (RPI) כמתואר בשלב 11 להלן ולהשתמש לדרג כל זן מבוסס על תשואת אתנול (אתנול מרבי המצטבר לכל סוכר ראשוני סופק) ו שיעור ספיג קסילוז (ריכוז קסילוז הנצרך 96 שעות ראשוניות) משתי מדיה הבדיקה.

11. דרגה מבודדת במסך הראש PSGHL שימוש במדד ביצועים יחסי (RPI)

  1. בעקבות הקרנה ראשית, לחישוב מדדי ביצועים יחסיים ממדים (RPI) על מנת לדרג את 30 מבודדים כל אחד מחמשת הניסויים שונים למסך מבודדים על PSGHL עם שני ניסוחים מזינים שונים לכל ניסוי, כלומר, 60% ו -75% PSGHL PSGHL.
  2. חשבתי את F הפרמטר הסטטיסטי לשימוש בדירוג ביצועים לבודדים בתוך קבוצה של בידודים שנבדקו בניסוי נתון: F = (ממוצע XX) / s. הנה, X הוא הפרמטר הביצועי, כגון תשואה (Y)או שיעור (R), ציין עבור כל לבודד פרט, בעוד ממוצע ו- s X הוא הסטייה הממוצעת סטנדרטית, בהתאמה, של X ציין לכל מבודד בתוך בניסוי נתון. עבור התפלגויות נורמליות, -2 <F <2.
  3. עבור כל לבודד בניסוי, לחשב את הביצועים היחסיים על בסיס שיעור, RPI R = (2 + F R) × 100/4, ובדומה לחשב ביצועים יחסיים הנסמכים על תשואה, RPI Y = (2 + F Y) × 100/4 . שווי RPI נע בין ~ -0 עד 100 אחוזון (מהנמוך ביותר לגבוה ביותר). ואז לחשב ממוצעים RPI לכל לבודד בתוך ניסוי hydrolyzate נתון כדלקמן: RPI ממוצע = (RPI Y + RPI R) / 2, שבו תרומות תשואה ושיעור מקבלים שקלול שווה בבקשה זו.
    שימו לב שבדרך כלל, פרמטרי תשואה ושיעור ניתן משוקללים אם יראו לא שווה בחשיבותם.
  4. לחשב RPI כוללת בין סוגי n של hydrolyzates נבדק: RPI הכוללת i = 1, n [(RPI Y + RPI R) / 2] i / n. שקול כל לבודד סט ניסיוני של 30 בידודים ו -2 שולטת. במהלך הדירוג הראשוני של יחיד המושבה ~ 150 מבודד המותאמים קסילוז עשירי PSGHL, את RPI הכולל חושב על שיעורי התשואות על פני שני ניסוחים PSGHL שיושמו המסך, כלומר, 60% PSGHL ו -75% PSGHL, כאשר n = 2.
  5. בהתבסס על RPI הכולל בתוך כל ניסוי, לבחור את האחוז העליון של בידודים לעבור למסך המשני. בדוגמא זו, 20% העליונים של זנים נבחרים לעבור (כלומר, 30 מתוך 150 שנבדקו).

12. מסך משני, השוואת מבצעי מסך ראשי למעלה על Hydrolyzates השלם המרובה (> סוכרי 100 גר '/ ל מעורבים) כדי לחשוף זנים חזקים תפקוד גבוהים

  1. השוואת הופעותיהם PSGHL העליון ב -6% גלוקן AFEX CSH ו SGH המתוקן עם שתי רמות של חנקן, SGH-N1 ו SGH-N2 (הרכבים כמו טבלה 1) לדירוג סופי. מסך 30 הבידודים כי היו הביצועים הטובים ביותר במסך הצלחת היטב עמוק העיקרי של PSGHL (שלבים 10 ו -11) ואת שני פקדים (זן ההורה NRRL Y-7124 ו AFEX CSH סובלנית לבודד (מקביל Colony 5, איור 1 למשל ).
  2. בגין cultivations ידי בחירת חרוז של תאים פסים גליצרול לשכפל בארות עמוקות של 1 מ"ל ODM + 50 גר '/ ל קסילוז כמקודם דגירה 48 שעות במערכת צלחת באר עמוקה (שלב 10.2). ואז להעביר 50 μl של precultures ODM 50% SGH תרבויות אתגר, דגירה במערכת גם צלחת עמוקה למשך 72 שעות כדי לקבל 620 ב ~ 10). הכן את SGH 50% על ידי ערבוב SGH 1: 1 עם קסילוז ללא סוכר ODM + 50 גר '/ ל (pH 5.6).
  3. עבור כל אחת מבודד, לחסן aliquot 16 מ"ל של SGH-N1 או SGH-N2 עם תא גלולה (15 דק ', 2,711 XG) משלוש בארות התרבות אתגר להניב תרבות הבדיקה הראשונית, 620 ~ 2.0. דגירה תרבויות מבחן ב 25 & #176;. C, 180 סל"ד (1 "במסלול) ב 25 מיליליטר צלוחיות עם סגרים ספוגים סיליקון צלוחיות לדוגמא יומית ולנתח לכל מסך PSGHL.
  4. באופן דומה, המסך מבודד כמו צעדים 12.2 ו -12.3, אבל זה תחליף זמן SGH-N1 ו SGH-N2 עם 6% גלוקן AFEX CSH ב- pH 5.2 לשימוש בהכנת אתגר תרבות בינוני בינוני ולבדוק תרבות. עבור תרבויות אתגר הכוח ב- 50%, השתמש CSH 6% AFEX מדולל 1: 1 עם מים שכן הוא חנקן מספיק ללא תיקון.
  5. חזור על שלבי 12.1-12.4 לשכפל תוצאות.

13. דירוג הביצועי מבודדים במסך משתיים שימוש RPI הכולל דרג שימוש Hydrolyzates השלם המרובה

  1. חישוב מדדי ביצועים יחסיים (RPI) על מנת לדרג כל אחת 20% העליונים של בידודים (~ 30 מתוך 150) מהמסך הראשי אשר נבדק במסך המשני על אנזים saccharified ניסוחי hydrolyzate של השתנה עושר תזונתי.
  2. ציון כללבודד נבדק במסך המשנה על-פי שיעור קסילוז ספיגת התשואה אתנול ביצע בשלושה ניסוחים hydrolyzate pretreated-saccharified אנזים לרוץ בשני עותקים, כולל AFEX CSH (i = 1 ו -2), SGH-N1 (i = 3 ו -4) SGH -N2 (i = 5 ו -6).
  3. חשב את RPI הכוללת עבור כל לבודד, ולהחיל פרמטר בדירוג זו כדי להמשיך לברור את רשימת מבודד מעולה: RPI הכולל = Σ i = 1, n [(RPI Y + RPI R) / 2] i / n, כאשר n = 6 .
    הערה: להדגים קינטיקה של בידודים מעולים SGH-N2 hydrolyzates בתרבויות בקבוק על פי הנהלים ב Slininger ואח 18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Stipitis ס התפתח באמצעות שילובים של שלוש תרבויות הבחירה, שכלל AFEX CSH, PSGHL, והתרבות רציפה Fed-קסילוז תיגר-אתנול. איור 1 מציג את תרשים סכמטי של ניסויים האבולוציה ביצע יחד עם הבידודים למצוא גם לבצע בצורה היעילה ביותר הכולל, או בצורה יעילה ביותר על אחד hydrolyzates נבדק. טבלה 3 מציגה את מספרי הצטרפות NRRL של בידודים מעולים אלה ומסכם את לחצי ההסתגלות הוחלו בתהליך של השגת האוכלוסייה מועשרת שממנו כל זן היה מבודדת. מבודד חלק נראו לקבל ביצועים ביחס מעולים על סוגי hydrolyzate אחד או שניים, אבל 7 מתוך 11 מבודד בצורה טובה על כל סוגי hydrolyzate, למרות שרוב אלה נחשפו לערער על ידי סוג אחד בלבד במהלך האבולוציה. ההצלחות של האבולוציה השונה גישות שננקטו כאן הם הפגינו איורים 2 -7 ולוח 4.

איור 2 מתאר את השיפורים הברורים לראות אחרי השלב הראשון של הסתגלות שבה נגזרים חזקה של זן NRRL Y-7124 הועשרו במהלך העברת סדרתי ריכוז גדל והולך של AFEX CSH (שלב 2). בתרבויות גדלו על CSH 6% גלוקן AFEX, האוכלוסייה התפתחה מדגימה הצטברות מהירה יותר titers הסופי גבוה יותר של אתנול מאשר זן ההורה. עוד ניצול הגלוקוז מהיר גם נתפס יחד עם ספיגת קסילוז מהירה יותר מייד לאחר הדלדול של גלוקוז. בנוסף באיור 3, יציבות האוכלוסייה השתנתה תכונות מודגמת ODM הבינוני הסינטטי בתערובת של 87 גר '/ גלוקוז L ו -66 גר' / ל קסילוז. במקרה זה, הן את האוכלוסייה מועשר (איור 3B) ואת מושבות מבודדות (מושבה 1 ו Colony 5, איור 3C ו 3D, מילpectively) מסוגלים לגבור על זן ההורה באמצעות קסילוז בצורה יעילה יותר כדי להפוך אתנול מהר יותר, צמצום זמן להגיע לשיא אתנול ב -4 ימים לפחות. באופן משמעותי ריכוזי אתנול גבוה שנצברו על ידי זנים התפתחו על ODM (55-60 גר '/ ל) לעומת ההורה (40-45 גר' / ל). המוטציות, אשר הובילו פנוטיפ יציבה של diauxy המופחת במהלך מעבר גלוקוז-קסילוז ותסיסת קסילוז יעיל יותר, התעוררו האוכלוסייה שהמרה התפתחה CSH AFEX.

שיפורים נוספים כדי Colony 5 נרדפו על ידי הגשתו ברירה טבעית בתרבות הרציפה שתיזון קסילוז בנוכחות של הגדלת רמות של אתנול עד 50 גר '/ ל. תחת תנאי זה, אוכלוסיית השמרים שמרו בתרבות הרציפה חייבת להיות מסוגל לעורר אנזימים לניצול קסילוז כמקור פחמן יחיד על מנת שזה יוכל לצמוח בקצב גבוה מספיק כדי לאכלס את fermentor למרות דילול יציבציון. בזן עכברי ההורה, האינדוקציה של אנזימי קסילוז מתחילה להיות מעוכבת בריכוזי אתנול נמוך כמו 15-20 גר '/ ל. 8 נגזרים של מושבה 5 נתפסו במניות גליצרול בנקודות זמן המוקדם והמאוחר של מבצע של התרבות הרציפה, ו איור 4 מראה את השיפור המוצלח בניצולת קסילוז בנוכחות אתנול / L 40 גרם שנצפתה נגזרים התפתחו של מושבה 5 לעומת הורה NRRL Y-7124 והמושבה הראשונית 5 מחוסן לתהליך.

מבודד הנובעים כל שלבי תכנית ההסתגלות של איור 1 הוקרן PSGHL לזהות את אלה עם יכולת מעולה לתסוס קסילוז (שלב 10.1). מבודד שמוצג באיור 5 הם בין הביצועים הטובים ביותר על PSGHL מתוך ~ 150 מדורגת המסך הראשי זה בכל המסכים המשני של ביצועים כמתואר להלן. כדי להצביע על שיפור של בידודים התפתחוביחס להורה שלהם, את הביצועים של כל מבודד התבטאו כיחס בין ערכי פרמטרים הקינטית של תבדיד למתח הורה. ערכי יחס "אחד" נוצר אילו ביצועים לבודדים היו שווים ההורה. דמויות 5a ו 5 ב לסכם עליונים לבודדים הופעות על 60% ו -75% חוזק של PSGHL עם ODM או ODM + י"מ השלמות תזונתיות. ככל ריכוז קשיחות hydrolyzate הוגדלו, יחסי פגיעה בביצועים. בשנות ה PSGHL כוח 60%, חמש מתוך שבע העליון מבודד חשופים ללחץ מבחר PSGHL ביצע פעמים רבות יותר מאשר NRRL Y-7124 (לבודד 1). ארבעה מבודדים בצע טוב יותר מאשר 5 קולוני (לבודד 33), אשר התפתחו במהלך חשיפת CSH AFEX אבל לא הייתה חשיפה סלקטיבית קודמת PSGHL. עם זאת, בחוסנה 75% PSGHL, רק 3 מבודד עלתה באופן משמעותי הן את ההורה Colony 5 (לבודד 33) למרות מזינים הוסיף. מבין אלה, מעולה מבודד 15 ו -16 היו previously תיגר עם ריכוז גדל והולך של PSGHL כלחץ בחירת מנחת אבולוציה. מבודד 15, 14 ו -3 נחשפו רק PSGHL, בעוד 11, 13 ו -16 היו מספר חשיפות. מבודד 3, 11, ו -13 היו מנקודות זמן קודם לכן במהלך האבולוציה על PSGHL וכך גם הזדמנות קצת פחות לפתח סובלנות לעומת 14, 15 ו 16. אמנם זה בא לידי ביטוי איור 5 כי העברת סדרתי עוצמות גדל והולך של PSGHL שימש גם לפתח זנים חזקים כדי סביבת הדיכוי שלו, זה עולה בבירור כי חשיפה של זן ההורה NRRL Y-7124 כדי CSH AFEX לבד יש את הפוטנציאל ליצור מבודד כגון 5 המושבה (33) עם סובלנות צולבות PSGHL. לפיכך, צוין כי זנים חזקים מסוגלים לתפקד בחדר hydrolyzates רבה עלולים להימצא על ידי העשרת סובלנות hydrolyzate אחד ואחריו הקרנת הופעה אחרת. מבודד המתקבלת התרבות הרציפה הניזונים קסילוז הוקרנו גם על PSGHL 60% ו -75% עוצמים עםחומרים מזינים וגם גלוקוז הוסיף ב -75 g / L על מנת לקיים את אתגר אתנול ולבדוק בפיגור diauxic על קסילוז הבא ניצול הגלוקוז. בעוד מבודד 27, 28 ו -30 היו טובים יותר מאחרים בשלב זה של הסתגלות, הן יחסי ביצועי שיעור ספיגת תשואת קסילוז היו דומים להורה על PSGHL 75% עם הוסיפו מזיני ODM ו- י"מ, וזה לא מפתיע בהכרח שאף היה חשיפה קודמת hydrolyzate זו (ראה גם אל Slininger et. 18 עבור נתונים נוספים שלא מוצגים כאן התרבויות סיפק 75 גרם / גלוקוז L).

הזנים הטובים ביותר נבחרים מתוך המסך הראשי על PSGHL קסילוז עשיר ובהמשך הוקרנו על שלושה hydrolyzates מלא. Hydrolyzates אלה (טבלה 1) נכלל CSH AFEX והתייחסו SG pretreated לדלל חומצה עם cellulases מסחרי שיושלם בשתי רמות חנקן שונות (SGH-N1 ו SGH-N2) כדי לזהות את iso המגוונים ביותרlates ביחס לשינויים מעכבים וסביבה תזונתית. מדדי הביצועים היחסיים (RPIs) חושבו על התסיסה של כל לבודד בתוך כל hydrolyzate (איור 6 א). איור 6 מציג את מדדי הביצועים הכוללים בשילוב מחושב לכל לבודד. חמש מבודדים (3, 14, 27, 28, 33) היה RPI הכולל מעל 60, אשר מדורג אותם הכי חזק לכל הווריאציות של hydrolyzate ותנאי מזין גם יחד. סקירת טבלה 3, הן מבודדות 3 ו -14 היו התפתחו PSGHL בעוד 27, 28, ו -33 היו התפתחו CSH AFEX או AFEX CSH ותרבות רציפה מאותגרי אתנול על קסילוז. אף אחד הזנים מפגינים שימוש hydrolyzate מרובה מעולה היו התפתחו על יותר מ hydrolyzate אחד.

כמה זנים היו "מומחים" ביצועים טובים יותר על CSH או SGH-N1 / 2 או AFEX. ומנתק את הביצועים הטובים ביותר כמומחים על SGHhydrolyzates (11, 16 ו -9) התקבלו על ידי האבולוציה על PSGHL כאתגר הסופי או רק. עבור מבודד 11 ו -16, אשר הועשרו בתחילה באמצעות הגדלת אתגר CSH AFEX, את היכולת לנצל AFEX CSH ביעילות לא נבחרה באופן פעיל במהלך עשרה הסופי הארוך PSGHL, וגורמים גנטיים מפתח התומכים בשימוש שלה כנראה אבדו. לעומת זאת, מבודד 14, 25, 27, 30 ו -33 היו מבצעים מעולים על CSH AFEX, וכל פרט לבודד 14 היו התפתח על AFEX CSH עם או בלי אתגר אתנול. אז כצפוי, בבימויו אבולוציה על CSH AFEX או PSGHL נטה לבחור עבור שמרים מותאמים היטב hydrolyzate הבחירה. החריג היחיד בעניין זה היה לבודד 14. בודד 14 שמקורה PSGHL רק לאתגר והיה מבודד ציפוי דילול אגר י"מ של התרבות והעשרת PSGHL הסופית. אל Slininger et. 18 הראה לבודד הזה יש יכולת מעולה של אינדוקציה אנזים קסילוז בתאים שגודלו גלוקוז בנוכחות5-15 גרם / חומצה אצטית L והקטינו בפיגור diauxic על ODM עם 75 גר '/ ל כל אחד גלוקוז קסילוז, למרות> 30 גר' / אתנול L שהתרחשו לפני נקודת המעבר-קסילוז גלוקוז.

קינטיקה מעולה של התפתחו זנים ביחס לזן ההורה ס stipitis NRRL Y-7124 הודגמו כפי שמוצג בטבלה 4, המייצג את התוצאות של תרבויות בקבוק אוורור ברמה הנמוכה המחוסנות כדי ראשוניים, 620 8.4 ± 2.5 75 מיליליטר SGH-N2 (pH 6.2) וטופח 125 מיליליטר צלוחיות עם כובעים ספוגים סיליקון ב 25 ° C, 150 סל"ד (1 "במסלול), ו באיור 7, המייצגים תרבויות הבקבוק אוורור מתונה מחוסן כדי הראשונית, 620 0.5 ב 23 מ"ל SGH-N2 לכל 50 מ"ל בבקבוק. 18 תנאים אלה מייצגים שני סוגים שונים של הפעולה המוצעת על ידי ספרות כמו להיות פוטנציאל מבטיח מסחרית לייצור אתנול על ידי ס stipitis. 8,22 בשנת האשוחיםלמשל t של אוורור ברמה נמוכה, צפיפות התאים גבוהה מספק עבור תסיסה מהירה להתחיל מיד. ואילו במקרה השני, את צפיפות התאים הנמוכה ועופרת אוורור ברמה גבוהה לצמיחת לוגריתמי לבנות האוכלוסייה ולהאיץ מרת הסוכר הקשורים לצמיחת אתנול. נתונים אלה מראים כי הזנים התפתחו יתרונות הקינטית מהותיים על זן ההורה: שיעור ספיגת הגלוקוז מהירה יותר (לוח 4), שיעור ספיג קסילוז ספציפי מהיר יותר (לוח 4), הפרודוקטיביות אתנול מהירות יותר משני גלוקוז קסילוז הכוללת (לוח 4), בפיגור קצר שקדמו צמיחה (איור 7), וגלוקוז diauxic קצר כדי קסילוז בפיגור המעבר. שיפורים אלה מותר אתנול לצבור מעל 40 גר '/ ל ו שיא ימים קודם לכן (איור 7) מאשר נתפס על-7124 Y הורה NRRL. הפרודוקטיביות אתנול הכוללות גבוהות (טבלה 4) הושגו ב -1.5 כדי 5 זמןזה כל כך של זן ההורה (לוח 4), בהתאם זן מפותח.

איור 1
איור 1:. תרשים זרימת הסתגלות stipitis Scheffersomyces התרשים המוצג מציין את סדר המדגיש מיושם במהלך תהליך ההסתגלות ואת נקודות התאוששות של בידודים מעולים (מספרים בסוגריים). ראה גם מפתח לבודד טבלה 3 כהפניה עבור זהויות זן. כדי לספק מכוונות זמן, המספרים באדום לציין את מספר הימים בכל שלב של הסתגלות. עבור שלבי העברת סדרתי CSH AFEX ו PSGHL עשיר קסילוז, בכל יום של הסתגלות מייצג כ 2-4 דורות. עבור שלב התרבות הרציף (205 ימים בסך הכל), שיעור הדילול D היה משתנה ב ~ 0-0.1 שעות -1 במהלך 125 ד פעולה עם האכלת pH-ומונע. בבאמבצע 80 ימים, היו זרימה רציפה עם D ב 0.012 hr -1, מתן זמן דור (ln 2) / (D) של 58 שעות, או 1 דור לכל 2.4 ד על מצב יציב. בא מדגם של האוכלוסייה המותאמת מהתרבות הרציפה 205 הימים היה mutagenized עם אור האולטרה הסגול מחוסן לתרבות רציפה פעולה עם D ב 0.012 hr -1. (לשכפל מ Slininger et al. 18) נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2:. התסיסה אצווה משופר של 6% גלוקן CSH AFEX Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 תסיסה הורה זן של 6% גלוקן AFEX CSH (A) לעומת מותאם Colony 5 תסיסה של 6% גלוקן h Stover תירס AFEX-pretreatedydrolyzate (B). סמלים לייעד ביומסה (ריבוע אדום), גלוקוז (עיגול שחור עם קו מקווקו), קסילוז (עיגול כחול עם קו מוצק), אתנול (משולש ירוק), קסיליטול (יהלום סגול). (לשכפל מ Slininger et al. 18) נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: צמצום פיגור diauxic במדיום מוגדר עם סוכרים מעורבים הופעות תסיסה מושוות ODM עם 66 גר '/ גלוקוז L ו -87 גר' / ל קסילוז עבור הורה זן ס. stipitis NRRL Y-7124 (א '), CSH AFEX מותאם לאוכלוסייה נגזרת Y-7124 (B), מושבת תא בודדת 1 מבודד ס המותאם אוכלוסיית stipitis (C), תא בודד קולורדוNY 5 מבודד האוכלוסייה המותאמת (D). סמלים לייעד ביומסה (ריבוע אדום), גלוקוז (עיגול שחור עם קו מקווקו), קסילוז (עיגול כחול עם קו מוצק), אתנול (משולש ירוק), קסיליטול (יהלום סגול), ו adonitol (יהלום זהב עם קצה שחור). (לשכפל מ Slininger et al. 18) נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: אתנול נגזר עמידה של מושבה סובלנית המושבה 5. hydrolyzate 5 פותח עוד יותר על ידי סל תרבות רציף על ODM המכיל קסילוז כמקור פחמן יחיד ורמות גבוהות של אתנול. שתי אוכלוסיות מלאות גליצרול נגזרות המתקבלות בשלב המוקדם של תהליך הבחירה (2A.1.53R, המשולש כתום קו מקווקו) וכןחרי UV הקרנה של inocula תרבות רציפה (2A.1.30R.2, מעגל סגול קו מקווקו) מוצגים בהשוואה לזן ההורה NRRL Y-7124 (עיגול ירוק עם קו מוצק) AFEX CSH סובלנית Colony 5 (משולש שחור עם קו אחיד). ספיגת Xylose ידי אוכלוסיות צפופות של שמרי גלוקוז מבוגר (א 620 = 50) ב ODM עם 40 גר '/ ל אתנול עולה כי כל הזנים המותאמים עלו הורה unadapted ביכולת לגרום מטבוליזם קסילוז. (לשכפל מ Slininger et al. 18) נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5:. יחס של שיפור ביצועים של תבדיד סובלנית לעומת ההורה הביצועי מבודדים סובלני מעולה מסוכם ביחסזן האם השליטה NRRL Y-7124 עבור כל ניסוח של PSGHL (A, B). הופעות הוערכו במונחים של שיעור קסילוז ספיג (סורגים כחולים המייצג יחסיים של תבדיד להורה) ואת התשואה אתנול לכל סוכר המסופק (פסים ירוקים המייצג יחסיים של תבדיד להורה). (לשכפל מ Slininger et al. 18) נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6: לבודד הדירוג מבוסס על RPI. מדד הביצועים היחסיים (RPI) הרעיון היה מוחל על תוצאות ביצועים של המסך המשני כדי לדרג 33 מבודד בתוך כל סוג hydrolyzate על בסיס שיעור קסילוז ספיגת התשואה אתנול לכל סוכר מסופק. (א) רן ביחסמלך כל לבודד נתון תלוי בסוג hydrolyzate (P <0.001): SGH-N1 (סורגים כחולים), SGH-N2 (מוטות אדומות) AFEX CSH (פסים ירוקים). (ב) RPI הכולל מחושב על פני כל סוגי hydrolyzate (המוטות תכלת) הצביע זנים מעולים עם רוב ביצועים חזקים על פני תנאי hydrolyzate שונים. (לשכפל מ Slininger et al. 18) נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7
איור 7: fermentations SGH ההשוואתי של בידודים מותאמים מעולים של ס stipitis. Superior מותאם מבודד ומתח ההורה שלהם NRRL Y-7124 מושווים תוסס hydrolyzates האנזימטית של וקליפות pretreated-חומצה לדלל (20% טעינת מוצקים) של 25 מעלות צלזיוס ו הראשונית pH 6.2 בשעה ראשונית נמוכה צפיפות התאים. קורסי זמן של ביומסה (ריבועים אדומים), גלוקוז (עיגולים שחורים קו מקווקו), קסילוז (עיגולים כחולים קו מוצק), ואתנול (משולשים ירוק) מוצגים. ברי שגיאה מייצגים את הטווח על הערך הממוצע בסימן סימנים. (לשכפל מ Slininger et al. 18) נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

טבלה 1:. יצירות של hydrolyzates המשמשים cultivations (. לשכפל מ Slininger ואח 18) אנא לחץ כאן להורדת בטבלה זו.

טבלה 2: בינוני מוגדר אופטימלי עבור Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 7TPS: //www.jove.com/files/ftp_upload/54227/54227table2.xlsx "> אנא לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה.

טבלה 3:. סיכום של stipitis זני Scheffersomyces הסובלנית המעולה עבור תסיסה של hydrolyzates של ביומסה במפעל (. לשכפל מ Slininger ואח 18) אנא לחץ כאן להורדה בטבלה זו.

לוח 4: קינטיקה ההשוואתי של בידודים על וקליפות hydrolyzate SGH-N2 מחוסן כדי ראשוני, 620 = 8.4 ± 2.5 מחירים הם מחירים מנורמלים לכל ספיגה יחידה במהלך גלוקוז או צריכת קסילוז.. (לשכפל מ ואח Slininger. 18) נא ללחוץ כאן להורדת ta זהble.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

צעדים אחדים היו חיוניים להצלחת תהליך האבולוציה. ראשית, הוא מפתח לבחור לחצי בחירה מתאימים לנהוג אבולוצית האוכלוסייה כלפי פנוטיפים הרצוי דרושים ליישום מוצלח. מדגיש סלקטיבית הבא נבחר ס stipitis פיתוח ויישומים בזמנים המתאימים להנחות והעשרת פנוטיפים הרצויים: חוזק גדל והולך של 12% גלוקן AFEX CSH (מה שמאלץ צמיחה ותסיסה של סוכרים מגוונים בנוכחות חומצה אצטית ורמות הנמוכות של אלדהידים furan ומעכבי אחרים); קסילוז נמאס תרבויות רציפות ככל שעלה ריכוז אתנול (מה שמאלץ אינדוקצית אנזים קסילוז להפחית בפיגור diauxic); והגדלת החוזק של 20% מוצקים טעינת PSGHL (מה שמאלץ צמיחה ותסיסה של קסילוז בנוכחות חומצה אצטית גבוהה, פורנים, ומעכבי אחרים). שנית, חשוב לשמר את האוכלוסיות שמרות מתפתחות על ידי הקפאת גליצרול sנקישות להד של דגימות אוכלוסייה בתהליך ההעשרה מתקדמת. תמונות כאלה של האוכלוסייה ניתן לאחסן לבדיקה תפקודית תקופתית לתעד התקדמות אבולוציה ולאפשר בידודים הבאים לפי צורך, או להפעיל מחדש תהליכי אבולוציה לאחר הפסקה. צעד מרכזי שלישי בתהליך האבולוציה היה לחלץ מבודדי חריגים ע"י העשרת אוכלוסיות תרבות בחירה או אוכלוסיות מצוידות גליצרול על תקשורת סלקטיבית נוחה (כגון צלחות מייקרו אגר או מכילות שיפוע לחץ מציג סדרת hydrolyzate ו / או ריכוזי אתנול) . ואז מושבות ששרדו גדלו בתנאי המלחיץ ביותר ניתן לאסוף לשמר לאפיון מאוחר יותר. שלבים בסיסיים אלה שלושה ניתן לחזור יש לעקוב אחרי כל לחץ בחירה הפנוטיפ רצוי נוסף, או, לחלופין, לחצים מרובים במחזור אחד אם מתאים. כאשר האוכלוסייה שמרימה הורה יליד חשופת הלחצים השונים, מגוון גנטי צפוי להתעורר ה מוטציות טבעיות או מושרה מחוספסים, וחשיפה המשיכה תאפשרנה ברירה טבעית להעשיר עבור אנשים עם המוטציות המועילות ביותר לתמוך הישרדות תחרותית. צפוי כי הפנוטיפ שנבחר יתרחש כתוצאה ממוטציות גנטיות מרובות. בפרוטוקול לעיל, מוטציות עשויות להיגרם במהלך טיפול UV או פוטנציאלי במהלך החשיפה של שמרים כדי hydrolyzates. Hydrolyzates ידועים מכילים שלושה סוגי תרכובות מזיק מיקרואורגניזמים:. חומצות קרבוקסיליות, אלדהידים ו phenolics 22 אלדהידים תגובתי, כגון furfural ו -5 hydroxymethylfurfural, יכול לגרום נזק לתאים ולגרום בגובה של מינים חמצן תגובתי (ROS), שנוצר בדרך כלל המיטוכונדריה. ROS ידוע לגרום מוטציות DNA בתאים איקריוטיים. 23,24 phenolics הנוכח hydrolyzates, למרות שלא היה ידוע בעבר להיות genotoxic, יכול לקדם synergize את ההשפעות מוטגנים של אלדהידים ו מוטגנים ROS. 25

jove_content "> האסטרטגיה בשלבים של בסביבות מאתגרות בהדרגה צפויה לבנות זנים התפתחו עם שורה של שיפורים פנוטיפ, הן ממוקדות וגם הלא ממוקדות. יתכן כי פנוטיפים שאינם ממוקדים מסוימים עלולים להתעורר כי אינם רצויים או לא יציבים. על מנת כדי ללכוד את הזנים מתפקדים ויציב הגבוה ביותר, צעד מרכזי נוסף שיש לנקוט הוא להעריך ולהשוות מבודדים שנבחר עבור תכונות רלוונטיות מסחרי והגיע לשני פנוטיפים ממוקדים הלא ממוקדים. כדי לעשות זאת, לבודד יש להשוות הופעות מגוון רחב של מצבי מתח מוכווני יישומים, כגון hydrolyzates עם אתגרים מעכבים שונים ניסוחים מזינים, המאפשרים מבחר הזנים הכוללת הטובים ביותר כי הם יציבים וחזקים כדי וריאצית מצע lignocellulosic תעשייתית רחבה. בנוסף, אתגר יציבות מתח ניתן שולב מסך כפי שנעשה בדוגמה ידי הכללת צעדים preculturing involving צמיחת שמרים ראשוני על השנייה בתקשורת לא סלקטיבי, אגרת י"מ במשך כמה דורות ואחריו ODM הסינטטי עם קסילוז 50 גר '/ ל עבור 6-7 דורות נוספים, הזדמנות לתת עבור יציבות של תכונות תרבות רצויות לפני חשיפת האתגר של ביצועים hydrolyzate. בהתבסס על תכונות ביצועים משמעותיות, כגון תשואה אתנול וקצב ספיג קסילוז, מבודדים מדורגים אז בכל מצב מתח שונה, כגון כל סביבת hydrolyzate נבדקה, אשר עשוי להיות שונה מן מדיום תרבות ההעשרה של לבודד. RPI הממדים יכול לשמש כדי לחשב את התפקוד יחסי כולל הממוצע בדרגה מבודדת מושווים. גורם ממדים מתאים כדי לשקף את ביצועים יחסיים בסוגים שונים של hydrolyzates ובהתבסס על הערכות ביצועים שונות, כגון תשואות לעומת שיעורים. הליך זה לדירוג מזהה זנים המבצעות בעקבי היטב על פני וריאציות רחבות בתנאי צמיחת hydrolyzates ו נוטה להיות גם איתן ויציבים גנטי.

חזרות ושינויים שונים של שלבים בסיסיים אלה ייתכן שיהיה צורך להתאים את האבולוציה של כל זן חיידקים המסוגלים תכונות אכיפה או ייחודי על hydrolyzates lignocellulosic או מצעים אחרים בעלי עניין. ב ס stipitis למשל, חשוב לציין תוספת של חומרים מזינים, כוללים מקורות מסחריים בעלות נמוכה, כדי hydrolyzates שהוכנה טעינת מוצקים גבוהים היה מפתח לשליטה על הטווח הדינמי של הופעות לבודדות להפרדה סטטיסטית השתפרה במהלך הקרנה. חשיבותה של חומרים מזינים תסיסה מוצלחת של hydrolyzates מעכבות המרוכזת גם דווחה בעבר נחשב בשל צורך גבוה של חומצות אמינו וחומרים מזינים אחרים הנדרשים לצורך תחזוקת תא, איזון חיזור, ותיקון כתוצאה בתנאי עקה כגון, במיוחד במהלך ניצול קסילוז. 9,26,27בנוסף, אם מזין מדי דלילים או מדי פזרניים, הבדלים בהופעות לבודדות עשויים להיות קשים לזהות סטטיסטי בשל כל הבידודים עושים מאוד גרוע, או כל עושים מאוד טוב, בהתאמה. מבודד מסוגלים לבצע גם בתנאים מגוונים צפויים להיות אמין, או חזק לשינויים בתנאים תעשייתיים.

המגבלה העיקרית של פרוטוקול זה היא שאבולוצית אדפטיבית הקרנה היא מאוד מילול תוצאה, כי "אחד תקבל מה אחד מעשיר ומסך עבור". לפיכך, תנאי עשרת מסך צריכים להיות מתוכננים להגביר ולזהות אנשים, בהתאמה, עם השינויים הרצויים פנוטיפים תוך שמירת תכונות קיימים רצויות. אבולוציה עשויה להשפיע שלא נבחרה עבור תכונות כי הם קריטיים עבור ביצועים מתועשים (לדוגמא, דרישות גורם גדילה). מסיבה זו, התקדמות העשרת אוכלוסיית תכונה אחת צריך לפקח באופן תקופתיאד עבור תכונות אחרות כשיטה התקלות עבור שינויים רצויים. לדוגמא, אחת התכונות הייחודיות של ס stipitis הוא היכולת המקורית שלו לגדול עוד ועוד להתסיס קסילוז. כל מצעי עשרת מיון כלל קסילוז כמקור פחמן תורם בלעדי או מפתח בנוכחות מעכבים. כתוצאה מכך, תכונה משותפת של כל תרבויות ההעשרה בדוגמא זו הייתה שהם נבחרים ישירות על זני ניצול קסילוז מהירים יותר, שאוכלוסיותיהן הפכו יותר ויותר מועשר culturing סדר או מתמשך בגלל שהם היו מתחרים טובים יותר. כתוצאה ישירה המיועד, זנים משופרים היו כל מסוגל ספיגת קסילוז מהירה יותר, אבל שיפורים התשואה אתנול היו הרבה פחות דרמטי מאשר שיפורים שיעור ספיגת קסילוז. המגמה האחרונה באה על סביר מאז התשואה אתנול על ידי הזן ההורי גבוהה יחסית בסביבות 0.3 g / g, או 60% של תיאורטי (0.51 גר '/ g), כמו צמיחת תאים הפכה נייחת hydrolyzates, משאיר פחות מקוםהַשׁבָּחָה. בתרבויות, תשואות אתנול גבוהות יכולות להיות ואולי שנבחרו נגד כי אתנול הוא מעכב צמיחה, אשר מצריכה השגחת ביצועים של האוכלוסייה התפתחה תכונה זו. ריכוזי אתנול שמר מתחת לרמה עבור עיכוב צמיחה יטו לנטרל זו כגורם בחירה. עבור ס stipitis NRRL Y-7124, 40 גר '/ ל חצי אתנול שיעור צמיחה ספציפי תוך 64 גר' / ל מונע צמיחה לחלוטין. 28 באתנול תיגר תרבויות רציפות נמאסות קסילוז, אורור הוחזק נמוך ושיעורי דילול גם נשמרו נמוכים מספיק עם קסילוז בשפע נוכחי תסיסת אומנה ולא נשימה של אתנול ולמנוע והעשרת נכס שימוש באתנול רצוי. בנוסף, השלמות תזונתיות אל hydrolyzates המשמש מסכי ביצועים נועדו מהורהר כדי למנוע בחירת זני צורך אספקת מזין עשירה יקרה, כגון תמצית שמרים. תוספים תמיד כללו ממקורות מסחריים הנמוכה עלות availablדואר, כגון קמח סויה אוריאה, אם כי רכיבים עשירים כגון י"מ יושמו בתרבויות טנדם לבדיקה השוואתית, כגון בפורמולציות של 60% ו -75% PSGHL אשר ימוצו של חנקן בדרך כלל. המדיום הסינטטי ODM, המשמש מסכי preculture וביצועי תרבות, תוכנן במקור עבור ביצועים מיטביים של זן ההורה ס stipitis NRRL Y-7124 7 בהתאם שגרת אופטימיזציה בינוני התרבות המתוארת על ידי חלבון סוחרים 20 ממליצת מרכיבים מוגדרים, כוללים ויטמינים, מינרלים, purines ו פירימידין, ומקורות חומצת אמינו לספק חומרים מזינים תואמים מדרוג כלפי מעלה תעשייתית חסכוני באמצעות ממקורות מסחריים. המלצה סופית בעיצוב זנים רלוונטיים, היא לשמור על העיצוב של תנאי העשרה מסך רלוונטיים ככל האפשר לתנאי התהליך תעשייתי הצפויים.

בעלות תחרותית אתנול מתחדשת כבר זמן רב רדף כדי rלְהַסִיק התלות בדלקים מאובנים. כדי לשפר את היכולת של ס stipitis NRRL Y-7124 לסבול, לגדול להתסיס hydrolyzates המעכבת של lignocellulose, מספר החוקרים השתמשו culturing החוזרים המשקאות קסילוז עשיר הנובע-טיפול מקדים חומצה מדוללת של ביומסה lignocellulosic. 13,14,16,17 Over-לסיד לטהר מעכבים עדיין היה צורך לאפשר מידה סבירה של ביצועים של זנים מותאמים מוקדם על משקאות מקדים פרקט וחיטת קש. 13,14 סיבובים חוזרים מרובים של mutagenesis UV ו דשדוש הגנום יושמו לפתח נגזרות של ס stipitis NRRL Y-7124 עם סובלנות מעכב שיפור וצמיחה הפרקט בילה ליקר סולפיט (HWSSL). 16,17 עם זאת, ריכוזי אתנול המיוצר על ידי זנים אלה HWSSL היו מתחת לגיל 10 גר '/ ל לאחר 6 עד 7 ימים. בעזרת הטכניקות באיור המתוארות כאן, הזנים התפתחו חדשים של ס stipitis NRRL Y-7124 פותח כדי לענות phenotyמטרות PE צורכות לשימוש מסחרי חסכוני: תסיסה של hydrolyzates ב- pH 5-6 ללא אמצעים לסילוק רעלים קודמים, כגון יתר לסייד, מה שמוביל סילוק פסולת יקר; מופחת הצמיחה באופן משמעותי פיגורים diauxic; הצטברויות אתנול מספיק גבוהה לזיקוק מסחרי (> 40 גר '/ ל אתנול); צמיחה מהירה יותר ופרודוקטיביות אתנול מכפי שדווח קודם לכן עבור זני שמרים יליד התוססים hydrolyzates undetoxified; וביצועי hydrolyzates מגוון על טעינת מוצקים גבוהה, כולל SGH-בתוספת חנקן סויה כראוי (וזה אחרת חנקן עני) ו CSH AFEX unsupplemented. זני השיפור הפותחים באמצעות הרומן גישות אגרסיביות לאבולוציה מגולמת השלבים העיקריים סכמו לעיל, צפויים להניב הטבות הכלכלה של הפקת אתנול מביומסה החקלאית על ידי הפחתת עלויות תפעול, עלויות הון, ותשומות אנרגיה ומים. זוהי תכנית ההתפתחות זן דיווח לראשונה להניב זנים המותאמים של ס stipitהוא הוכחת ייצור אתנול ההשבה כלכלית על hydrolyzates undetoxified.

זני הרומן של ס stipitis הנובעים בכל שלב של תהליך האבולוציה (איור 1) הם מועמדים למחקרים עתידיים כדי לקבוע את השינויים הגנטיים קשורים לחצי ברירה מסוימים היו תקפים ואת מנגנוני תכונות מפתח בסיסיות של תסיסת hydrolyzate משופרת, כגון סובלנות מעכבת בפיגור diauxic מופחת. כזה ידע חדש בעל ערך יסייע ההנדסה של biocatalysts שמרים הדור הבא ותהליכים להסבת lignocellulose דלק ביולוגי ומוצרים אחרים. כמו זנים חדשים נגזרים, זה יהיה מועיל עשוי שוב להעביר את האוכלוסייה נגזרת באמצעות פרוטוקול אבולוצית זן דומה לזה שתואר כאן כדי לבחור את transformants השימושי ביותר לשימוש מסחרי hydrolyzates. באופן דומה, כמו זנים של חיידקים חדשים מתגלים עם הפוטנציאל לחולל שליריאד של מוצרים חדשים שימושיים מביומסה מתחדשת, בתהליך האבולוציה יכול להיות מיושם נוסף כדי לשפר את חוסן זן ופריון hydrolyzates, פוטנציאל המאפשר תהליכים ביו-קטליטי רומן ומוצרים שיועמדו לרשות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cellic Ctec, Contains Xylanase (endo-1,4-) Novozymes No product number www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Cellic Htec, Contains Cellulase and Xyalanase Novozymes No product number www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Toasted Nutrisoy Flour Archer Daniels Midland Co. (ADM) 63160 ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL  1800-37-5843
Pluronic F-68 (Surfactant) Sigma-Aldrich P1300 Sigma-Aldrich
Difco Vitamin Assay Casamino Acids Becton Dickinson and Company 228830 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
D,L-tryptophan  Sigma-Aldrich T3300 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
L-cysteine  Sigma-Aldrich C7352 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, Sigma-Aldrich
Bacto Agar Becton Dickinson and Company 214010 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Malt Extract Becton Dickinson and Company 218630 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Yeast Extract Becton Dickinson and Company 212750 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Peptone Type IV from soybean Fluka P0521-500g multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Adenine, >99% powder Sigma-Aldrich A8626 CAS 73-24-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Cytosine, >99% Sigma-Aldrich C3506 CAS 71-30-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Guanine, SigmaUltra Sigma-Aldrich G6779 CAS 73-40-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Thymine, 99% Sigma-Aldrich T0376 CAS 65-71-4. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Uracil, 99% Sigma-Aldrich U0750 CAS 66-22-8. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous, Certified ACS Fisher Chemical D16-500 CAS 50-99-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
D-Xylose, assay >99% Sigma-Aldrich X1500 CAS 58-86-6. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
96-well, flat bottom plates Becton Dickinson Falcon 351172 multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Wypall L40 Wiper Kimberly-Clark towel in microplate boxes to absorb water for humidification; multiple suppliers e.g., Thermo-Fisher, uline, Daigger
Corning graduated pyrex flask, 125 ml, narrow opening (stopper #5) Corning Life Science Glass 4980-125 multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Innova 42R shaker/incubator, 2.5 cm (1") rotation New Brunswick Scientific (1-800-631-5417) M1335-0016 multiple suppliers: e.g., Eppendorf, Thermo-Fisher. Other shaker/incubators with a 2.5 cm (1") throw could be used.
Duetz Cover clamp for 4 deep well MTP plates Applikon Biotechnology Z365001700 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System sandwich cover for 96 deep well plates Applikon Biotechnology Z365001296 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System silicone seal (0.8 mm black low evap) for 96 deep well plate cover Applikon Biotechnology V0W1040027 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Blue microfiber layer for Duetz system sandwich cover Applikon Biotechnology V0W1040001 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
96 well, 2 ml square well pyramid bottom plates, natural popypropylene Applikon Biotechnology ZC3DXP0240 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Bellco 32 mm silicon sponge plug closures, pk of 25 for 125 ml flasks Bellco 1924-00032 Thomas Scientific, their Catalog number is 1203K27
Bellco Spinner Flask, 1968-Glass Dome, Sealable Flange Type, 100 ml working volume. This design no longer manufactured. Bellco 1968-00100 (original Cat. No.) Jacketed vessels have lower inlet & upper outlet ports for temp. control with circulating water bath. Vessels are 75 mm in outer diam and 200 mm in height. There are four side ports at ~45° angles and one top port. Port openings appropriate size for size 0 neoprene stoppers (21-22 mm inner diameters on ports).
Mathis Labomat IR Dryer Oven MathisAg Typ-Nbr BFA12 215307 Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157
Dual Channel Biochemistry Analyzer YSI Life Sciences 2900D-UP www.ysi.com, robotic system for rapid sugars assay in 96-well microplate format
PowerWave XS Microplate Spectrophotometer Bio-Tek Instruments, Inc MQX200R www.biotek.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perlack, R. D., Stokes, B. J. US Department of Energy. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. Department of Energy. Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN. (2011).
  2. Prior, B. A., Kilian, S. G., duPreez, J. C. Fermentation of D-xylose by the yeasts Candida shehatae and Pichia stipitis. Process Biochem. 24, (1), 21-32 (1989).
  3. Kurtzman, C. P., Suzuki, M. Phylogenetic analysis of ascomycete yeasts that form coenzyme Q-9 and the proposal of the new genera Babjeviella, Meyerozyma, Millerozyma, Priceomyces and Scheffersomyces. Mcoscience. 51, (1), 2-14 (2010).
  4. Slininger, P. J., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. Comparative evaluation of ethanol production by xylose-fermenting yeasts presented high xylose concentrations. Biotechnol. Lett. 7, (6), 431-436 (1985).
  5. Slininger, P. J., Bothast, R. J., Ladisch, M. R., Okos, M. R. Optimum pH and temperature conditions for xylose fermentation by Pichia stipitis. Biotechnol. Bioeng. 35, (7), 727-731 (1990).
  6. Slininger, P. J., et al. Stoichiometry and kinetics of xylose fermentation by Pichia stipitis. Annals NY Acad. Sci. 589, 25-40 (1990).
  7. Slininger, P. J., Dien, B. S., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. Nitrogen source and mineral optimization enhance D-xylose conversion to ethanol by the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, (6), 1285-1296 (2006).
  8. Slininger, P. J., Thompson, S. R., Weber, S., Liu, Z. L. Repression of xylose-specific enzymes by ethanol in Scheffersomyces (Pichia) stipitis and utility of repitching xylose-grown populations to eliminat diauxic lag. Biotechnol. Bioeng. 108, (8), 1801-1815 (2011).
  9. Slininger, P. J., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. Culture nutrition and physiology impact inhibitor tolerance of the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124. Biotechnol. Bioeng. 102, (3), 778-790 (2009).
  10. Agbogbo, F. K., Coward-Kelly, G. Cellulosic ethanol production using the naturally occurring xylose-fermenting yeast, Pichia stipitis. Biotechnol. Lett. 30, (9), 1515-1524 (2008).
  11. Balan, V., Bals, B., Chundawat, S., Marshall, D., Dale, B. E. Lignocellulosic pretreatment using AFEX. Biofuels: Methods and protocols, Methods in Molecular Biology. 581, Humana Press, a part of Springer Science+Business Media, LLC. 61-77 (2009).
  12. Jin, M., Gunawan, C., Uppugundla, N., Balan, V., Dale, B. E. A novel integrated biological process for cellulosic ethanol production featuring high ethanol productivity, enzyme recycling, and yeast cells reuse. Energ. Environ. Sci. 5, (5), 7168-7175 (2012).
  13. Nigam, J. N. Development of xylose-fermenting yeast Pichia stipitis for ethanol production through adaptation on hardwood hemicellulose acid prehydrolysate. J. Appl. Microbiol. 90, (2), 208-215 (2001).
  14. Nigam, J. N. Ethanol production from wheat straw hemicellulose hydrolysate by Pichia stipitis. J. Biotechnol. 87, (1), 17-27 (2001).
  15. Hughes, S. R., et al. Random UV-C mutagenesis of Scheffersomyces (formerly Pichia) stipitis NRRL Y-7124 to improve anaerobic growth on lignocellulosic sugars. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 39, (1), 163-173 (2012).
  16. Bajwa, P. K., et al. Mutants of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis with improved tolerance to inhibitors in hardwood spent sulfite liquor. Biotechnol. Bioeng. 104, (5), 892-900 (2009).
  17. Bajwa, P. K., Pinel, D., Martin, V. J. J., Trevors, J. T., Lee, H. Strain improvement of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis by genome shuffling. J. Microbiol. Methods. 81, (2), 179-186 (2010).
  18. Slininger, P. J., et al. Evolved strains of Scheffersomyces stipitis achieving high ethanol productivity on acid- and base-pretreated biomass hydrolyzate at high solids loading. Biotechnol. Biofuels. 8:60, 1-27 (2015).
  19. Jeffries, T. W., et al. Genome sequence of the lignocellulosic-bioconverting and xylose-fermenting yeast Pichia stipitis. Nature Biotechnol. 25, (3), 319-326 (2007).
  20. Zabriski, D. W., Armiger, W. B., Phillips, D. H., Albano, P. A. Fermentation media formulation. Trader's Guide to Fermentation Media Formulation. 1-39 (1980).
  21. Syzbalski, W., Bryson, Y. Genetic studies on microbial cross resistance to toxic agents. I. Cross resistance of Escherichia coli to fifteen antibiotics. J. Biotechnol. 64, (4), 489-499 (1952).
  22. Klinke, H. B., Thomsen, A. B., Ahring, B. K. Inhibition of ethanol-producing yeast and bacteria by degradation products produced during pre-treatment of biomass. Appl. Microbiol. Biotechnol. 66, 10-26 (2004).
  23. Almeida, J. R. M., Bertilsson, M., Gorwa-Grauslund, M. F., Gorsich, S., Liden, G. Metabolic effects of furaldehydes and impacts on biotechnological processes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 625-638 (2009).
  24. Allen, S. A., et al. Furfural induces reactive oxygen species accumulation and cellular damage in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Biofuels. 3, (2010).
  25. Weisburger, J. H. Mutagenic, carcinogenic, and chemopreventive effects of phenols and catechols: the underlying mechanisms. ACS Symposium Series. 507, 35-47 (2009).
  26. Slininger, P. J., Dien, B. S., Lomont, J. M., Bothast, R. J., Ladisch, M. R. Evaluation of a kinetic model for computer simulation of growth and fermentation by Scheffersomyces (Pichia) stipitis fed D-xylose. Biotechnol. Bioeng. 111, (8), 1532-1540 (2014).
  27. Wang, X., et al. Comparative metabolic profiling revealed limitations in xylose-fermenting yeast during co-fermentation of glucose and xylose in the presence of inhibitors. Biotechnol. Bioeng. 111, (1), 152-164 (2014).
  28. Slininger, P. J., Branstrator, L. E., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. Growth, death, and oxygen uptake kinetics of Pichia stipitis on xylose. Biotechnol. Bioeng. 37, (10), 973-980 (1991).
טכניקות האבולוציה של שמרי פנטוז-תוסס יציבים לשם bioconversion של lignocellulose כדי אתנול
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Slininger, P. J., Shea-Andersh, M. A., Thompson, S. R., Dien, B. S., Kurtzman, C. P., Sousa, L. D. C., Balan, V. Techniques for the Evolution of Robust Pentose-fermenting Yeast for Bioconversion of Lignocellulose to Ethanol. J. Vis. Exp. (116), e54227, doi:10.3791/54227 (2016).More

Slininger, P. J., Shea-Andersh, M. A., Thompson, S. R., Dien, B. S., Kurtzman, C. P., Sousa, L. D. C., Balan, V. Techniques for the Evolution of Robust Pentose-fermenting Yeast for Bioconversion of Lignocellulose to Ethanol. J. Vis. Exp. (116), e54227, doi:10.3791/54227 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter