טכניקות האבולוציה של שמרי פנטוז-תוסס יציבים לשם bioconversion של lignocellulose כדי אתנול
Summary
טכניקות אבולוציה והבידוד מסתגלים מתוארות והפגינו להניב נגזרות של stipitis זן Scheffersomyces NRRL Y-7124 כי הם מסוגלים לצרוך hexose במהירות וסוכרים מעורבים פנטוז ב אנזים saccharified hydrolyzates undetoxified וכדי לצבור יותר מ -40 גרם / אתנול L.
Abstract
Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme saccharification processes release sugars that can be fermented by yeast. Traditional industrial yeasts do not ferment xylose (comprising up to 40% of plant sugars) and are not able to function in concentrated hydrolyzates. Concentrated hydrolyzates are needed to support economical ethanol recovery, but they are laden with toxic byproducts generated during pretreatment. While detoxification methods can render hydrolyzates fermentable, they are costly and generate waste disposal liabilities. Here, adaptive evolution and isolation techniques are described and demonstrated to yield derivatives of the native Scheffersomyces stipitis strain NRRL Y-7124 that are able to efficiently convert hydrolyzates to economically recoverable ethanol despite adverse culture conditions. Improved individuals are enriched in an evolving population using multiple selection pressures reliant on natural genetic diversity of the S. stipitis population and mutations induced by exposures to two diverse hydrolyzates, ethanol or UV radiation. Final evolution cultures are dilution plated to harvest predominant isolates, while intermediate populations, frozen in glycerol at various stages of evolution, are enriched on selective media using appropriate stress gradients to recover most promising isolates through dilution plating. Isolates are screened on various hydrolyzate types and ranked using a novel procedure involving dimensionless relative performance index (RPI) transformations of the xylose uptake rate and ethanol yield data. Using the RPI statistical parameter, an overall relative performance average is calculated to rank isolates based on multiple factors, including culture conditions (varying in nutrients and inhibitors) and kinetic characteristics. Through application of these techniques, derivatives of the parent strain had the following improved features in enzyme saccharified hydrolyzates at pH 5-6: reduced initial lag phase preceding growth, reduced diauxic lag during glucose-xylose transition, significantly enhanced fermentation rates, improved ethanol tolerance and accumulation to 40 g/L.
Introduction
שנתי מוערך של 1.3 מיליארד טון יבש של ביומסה lignocellulosic יכול לתמוך בייצור אתנול ולאפשר בארה"ב כדי להפחית את צריכת הנפט שלה ב -30%. 1 למרות תערובות סוכר תשואות הידרוליזה צמח ביומסה עשיר גלוקוז קסילוז, מעכבי תסיסה מופקים על ידי טיפול מקדים כימיים הדרושים לשבור hemicellulose ולחשוף תאית לתקיפה האנזימטית. חומצה אצטית, furfural, ו hydroxymethylfurfural (HMF) נחשבים מרכיבים מרכזיים בקרב מעכבים רבים יוצרות במהלך מקדים. על מנת להזיז את תעשיית האתנול lignocellulosic קדימה, מחקר ונהלים כדי לאפשר התפתחות של זני שמרים מסוגל לשרוד וביעילות מתפקד להשתמש בשתי hexose וסוכרים פנטוז בנוכחות תרכובות מעכבות כאלה נדרשים. חולשה משמעותית נוספת של זני שמרים מסורתיים תעשייתיים, כגון שמר אפייה, היא החוסר היכולת ביעילות fermenך * קסילוז זמין hydrolyzates של ביומסה במפעל.
זן סוג stipitis Pichia NRRL Y-7124 (CBS 5773), שמם לאחרונה Scheffersomyces stipitis, הוא שמרים תוסס פנטוז יליד כי היא ידועה לתסוס קסילוז כדי אתנול. 2,3 האבולוציה של זן NRRL Y-7124 נרדפה כאן כי זה תועד כדי יש את הפוטנציאל הגדול של זני שמרים יליד לצבור אתנול ההשבה כלכלית של מעל ל -40 g / L עם תוצר לוואי קסיליטול מעט. 4,5,6 בשנת מדיה אופטימלית, S. stipitis זן NRRL Y-7124 מייצרת 70 גר '/ ל אתנול 40 שע' (1.75 גר '/ ל / hr) בתשואה של 0.41 ± 0.06 g / g בתרבויות צפיפות התאים גבוהה (6 גרם / תאים L). 7,8 ההתנגדות אתנול מעכבי תסיסה, furfural, ו HMF גם דווחה, 9 וס stipitis כבר מדורג בין שמרים המבטיחים ביותר פנטוז-תוסס מקוריים זמינים עבור productio אתנול בקנה מידה מסחריתn מ lignocellulose. 10 הציב לעצמנו היעד ליישם hydrolyzates lignocellulosic undetoxified המגוון לחצי ברירת אתנול לכפות אבולוציה לקראת נגזרת חזקה יותר של זן NRRL Y-7124 מתאימים ליישומים תעשייתיים. מפתח בין תכונות משופרות בקשו היה שיעורי ספיגת סוכר מהר יותר hydrolyzates המרוכז, מופחת diauxy לניצול סוכר מעורב יעיל יותר, ואת העמידות גבוהה של אתנול ומעכבים. היישום של ס stipitis כדי hydrolyzates undetoxified היה מוקד מרכזי של מחקר כדי לחסל את ההוצאות התפעוליות הוסיף הקשורים בתהליכי ניקוי הגוף hydrolyzate, כגון overliming.
שני hydrolyzates מבטיח תעשייתי יושם לכפות אבולוציה:. אנזים אמונית סיבי saccharified-pretreated הרחבת התירס סטובר hydrolyzate (AFEX CSH) לדלל לייקר hydrolyzate וקליפות-pretreated חומצה (PSGHL) 11,12 הטכנולוגיה מקדימה AFEX מפותחת כדילמזער את הייצור של מעכבי תסיסה, תוך טיפול מקדים חומצה לדלל מייצג את הטכנולוגיה בעלות הנמוכה ביותר הנוכחית הנפוץ ביותר מתורגל לחשוף ביומסה מתאית עבור saccharification האנזימטית. PSGHL ניתן להפרדה מן התאית הנותרת לאחר טיפול מקדים והוא אופייני עשיר קסילוז מן hemicellulose הידרוליזה, אך נמוך ב גלוקוז. CSH AFEX ויצירות PSGHL נבדלים זה מזה בהיבטים מרכזיים אשר נוצלו כדי לנהל את תהליך האבולוציה. AFEX CSH נמוך ב אלדהידים furan ומעכבי חומצה אצטית אך גבוה ב חומצות אמינו מקורות חנקן אמוניה לעומת PSGHL (טבלה 1). PSGHL מציג את האתגר הנוסף של קסילוז להיות סוכר השולט זמין. לפיכך PSGHL ראוי להעשיר במיוחד עבור ניצול קסילוז השתפר hydrolyzates, חולשה מניעת שימוש מסחרי שמרים זמין. גם בקרב שמרים תוססים פנטוז ילידים, ההסתמכות על Xylo הסוכר לא הטובse לתמוך צמיחת תאים ותיקון הופך להיות אפילו יותר מאתגר hydrolyzates בגלל מגוון סיבות:. חסרים תזונתיים, מעכבי גרימת נזק נרחב לתא השלמות המבנית, ושיבוש חילוף החומרים בשל חוסר איזון חיזור 9 תוספת חנקן, בעיקר בצורה של חומצות אמינו, יכולות לייצג עלות תפעולית משמעותית עבור fermentations. ההשפעה של תוספת חנקן על הקרנה לבודדת ודירוג שנחקרה עם hydrolyzates וקליפות.
אנשים משופרים הועשרו בתוך אוכלוסייה מתפתחת באמצעות לחצי בחירה מרובים סומך על מגוון גנטי הטבעי של ס האוכלוסייה ומוטציות stipitis המושרה על ידי חשיפות שני hydrolyzates מגוונים, אתנול או קרינת UV. לחצי ברירה יושמו במקביל ובסדרות לחקור את התקדמות האבולוציה של ס stipitis כלפי נגזרים רצויים מסוגלים לגדול להתסיס ביעילות hydrolyzates(איור 1). Culturing החוזרת של אוכלוסיות תפקודיות hydrolyzates המאתגר יותר ויותר הושגה microplates העסקת סדרת דילול של אחד CSH 12% גלוקן AFEX או אחר הכינו PGSHL ב טעינה מוצקה 20%. היישום של צמיחה תיגר-אתנול על קסילוז בתרבות רציפה שיפור נוסף אוכלוסיות AFEX CSH מותאם על ידי העשרת עבור פנוטיפים הוכחת פחות רגישות אתנול דיכוי וניצול קסילוז. התכונה האחרונה הוצגה בעייתית לאחרונה לניצול pentose ידי זן NRRL Y-7124 בעקבות תסיסת גלוקוז. 8 עשרה על PSGHL שנחקרו ליד להרחיב פונקציונליות hydrolyzate.
נגזרים השתפרו משוערים של ס stipitis NRRL Y-7124 בודדו כל שלב של תהליך האבולוציה באמצעות העשרה ממוקד בתנאי מתח ציפוי דילול לבחור מושבות מתוך האוכלוסיות הכי הנפוצות. ביחס מימדיםמדדי ביצועים (RPIs) שמשו לדרג זנים מבוססים על ביצועים הכוללים, שבו התנהגות הקינטית הוערכה על סוגי hydrolyzate שונים ותוספי מזין מיושמים. למרות ההצלחות של הליכי עיבוד שונים על מנת לשפר את הפונקציונליות של ס stipitis ב hydrolyzates lignocellulosic תועדו בעבר, זנים הוכחת ייצור אתנול חסכוני על hydrolyzates undetoxified לא דווחו בעבר. 13-17 שימוש בהליכים האבולוציה להיות דמיינו בפירוט רב יותר כאן, Slininger et al. 18 פיתחו זנים כי הם השתפרו באופן משמעותי על זן ההורה NRRL Y-7124 והם מסוגלים לייצר> אתנול 40 גר '/ ל ב CSH AFEX האנזים hydrolyzate וקליפות saccharified (SGH) השלימו כראוי עם מקורות חנקן. זני רומן אלה הם בעלי העניין עתידי lignocellulose בפיתוח לתעשיית אתנול כסובייקטים של בניין מחקרים הגנומיקה נוספותעל אלה של Y-11,545 NRRL זן רצף בעבר. 19 מחקר הגנומיקה של זנים העליונים הנוצרים במהלך שלבים שונים של התפתחות שרטט באיור 1 היה להבהיר את ההיסטוריה של שינויים גנטיים שהתרחשו במהלך ההתפתחות כהקדמה לקדם מחקר שיפור זן.
Protocol
Representative Results
Discussion
צעדים אחדים היו חיוניים להצלחת תהליך האבולוציה. ראשית, הוא מפתח לבחור לחצי בחירה מתאימים לנהוג אבולוצית האוכלוסייה כלפי פנוטיפים הרצוי דרושים ליישום מוצלח. מדגיש סלקטיבית הבא נבחר ס stipitis פיתוח ויישומים בזמנים המתאימים להנחות והעשרת פנוטיפים הרצויים: חוזק גדל ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to express our sincere appreciation to Drs. Kenneth Vogel, Robert Mitchell and Gautam Sarath, Grain, Forage, and Bioenergy Research Unit, Agricultural Research Service, Lincoln, NE for their kind supply of switchgrass for this project. We also thank U.S. Department of Energy for funding to VB through the DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (GLBRC) Grant DE-FC02-07ER64494.
Materials
| Cellic Ctec, Contains Xylanase (endo-1,4-) | Novozymes | No product number | www.novozymes.com, 1-919-494-3000 |
| Cellic Htec, Contains Cellulase and Xyalanase | Novozymes | No product number | www.novozymes.com, 1-919-494-3000 |
| Toasted Nutrisoy Flour | Archer Daniels Midland Co. (ADM) | 63160 | ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL 1800-37-5843 |
| Pluronic F-68 (Surfactant) | Sigma-Aldrich | P1300 | Sigma-Aldrich |
| Difco Vitamin Assay Casamino Acids | Becton Dickinson and Company | 228830 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| D,L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T3300 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, Sigma-Aldrich |
| Bacto Agar | Becton Dickinson and Company | 214010 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Bacto Malt Extract | Becton Dickinson and Company | 218630 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Bacto Yeast Extract | Becton Dickinson and Company | 212750 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Peptone Type IV from soybean | Fluka | P0521-500g | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Adenine, > 99% powder | Sigma-Aldrich | A8626 | CAS 73-24-5, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Cytosine, > 99% | Sigma-Aldrich | C3506 | CAS 71-30-7, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Guanine, SigmaUltra | Sigma-Aldrich | G6779 | CAS 73-40-5, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Thymine, 99% | Sigma-Aldrich | T0376 | CAS 65-71-4, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Uracil, 99% | Sigma-Aldrich | U0750 | CAS 66-22-8, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous, Certified ACS | Fisher Chemical | D16-500 | CAS 50-99-7, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich |
| D-Xylose, assay > 99% | Sigma-Aldrich | X1500 | CAS 58-86-6, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich |
| 96-well, flat bottom plates | Becton Dickinson Falcon | 351172 | multiple suppliers: e.g. Thermo-Fisher, VWR, Daigger |
| Wypall L40 Wiper | Kimberly-Clark | towel in microplate boxes to absorb water for humidification; multiple suppliers: e.g. Thermo-Fisher, uline, Daigger | |
| Corning graduated pyrex flask, 125-mL, narrow opening (stopper #5) | Corning Life Science Glass | 4980-125 | multiple suppliers: e.g. Thermo-Fisher, VWR, Daigger |
| Innova 42R shaker/incubator, 2.5 cm (1") rotation | New Brunswick Scientific (1-800-631-5417) | M1335-0016 | multiple suppliers: e.g. Eppendorf, Thermo-Fisher. Other shaker/incubators with a 2.5 cm (1") throw could be used. |
| Duetz Cover clamp for 4 deepwell MTP plates | Applikon Biotechnology | Z365001700 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Duetz System sandwich cover for 96 deepwell plates | Applikon Biotechnology | Z365001296 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Duetz System silicone seal (0.8mm black low evap) for 96 deep well plate cover | Applikon Biotechnology | V0W1040027 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Blue microfiber layer for Duetz system sandwich cover | Applikon Biotechnology | V0W1040001 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| 96 well, 2 mL square well pyramid bottom plates, natural popypropylene | Applikon Biotechnology | ZC3DXP0240 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Bellco 32mm silicon sponge plug closures, pk of 25 for 125-mL flasks | Bellco | 1924-00032 | Thomas Scientific, their Catalog number is 1203K27 |
| Bellco Spinner Flask, 1968-Glass Dome, Sealable Flange Type, 100-mL working volume. This design no longer manufactured. | Bellco | 1968-00100 (original Cat. No.) | Jacketed vessels have lower inlet & upper outlet ports for temp. control with circulating water bath. Vessels are 75mm in outer diam and 200mm in height. There are four side ports at ~45o angles and one top port. Port openings appropriate size for size 0 neoprene stoppers (21-22mm inner diameters on ports). |
| Mathis Labomat IR Dryer Oven | MathisAg | Typ-Nbr BFA12 215307 | Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157 |
| Dual Channel Biochemistry Analyzer | YSI Life Sciences | 2900D-UP | www.ysi.com, robotic system for rapid sugars assay in 96-well microplate format |
| PowerWave XS Microplate Spectrophotometer | Bio-Tek Instruments, Inc | MQX200R | www.biotek.com |
References
- Perlack, R. D., Stokes, B. J. . Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. , (2011).
- Prior, B. A., Kilian, S. G., duPreez, J. C. Fermentation of D-xylose by the yeasts Candida shehatae and Pichia stipitis. Process Biochem. 24 (1), 21-32 (1989).
- Kurtzman, C. P., Suzuki, M. Phylogenetic analysis of ascomycete yeasts that form coenzyme Q-9 and the proposal of the new genera Babjeviella, Meyerozyma, Millerozyma, Priceomyces and Scheffersomyces. Mcoscience. 51 (1), 2-14 (2010).
- Slininger, P. J., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. Comparative evaluation of ethanol production by xylose-fermenting yeasts presented high xylose concentrations. Biotechnol. Lett. 7 (6), 431-436 (1985).
- Slininger, P. J., Bothast, R. J., Ladisch, M. R., Okos, M. R. Optimum pH and temperature conditions for xylose fermentation by Pichia stipitis. Biotechnol. Bioeng. 35 (7), 727-731 (1990).
- Slininger, P. J., et al. Stoichiometry and kinetics of xylose fermentation by Pichia stipitis. Annals NY Acad. Sci. 589, 25-40 (1990).
- Slininger, P. J., Dien, B. S., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. Nitrogen source and mineral optimization enhance D-xylose conversion to ethanol by the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (6), 1285-1296 (2006).
- Slininger, P. J., Thompson, S. R., Weber, S., Liu, Z. L. Repression of xylose-specific enzymes by ethanol in Scheffersomyces (Pichia) stipitis and utility of repitching xylose-grown populations to eliminat diauxic lag. Biotechnol. Bioeng. 108 (8), 1801-1815 (2011).
- Slininger, P. J., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. Culture nutrition and physiology impact inhibitor tolerance of the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124. Biotechnol. Bioeng. 102 (3), 778-790 (2009).
- Agbogbo, F. K., Coward-Kelly, G. Cellulosic ethanol production using the naturally occurring xylose-fermenting yeast, Pichia stipitis. Biotechnol. Lett. 30 (9), 1515-1524 (2008).
- Balan, V., Bals, B., Chundawat, S., Marshall, D., Dale, B. E. Lignocellulosic pretreatment using AFEX. Biofuels: Methods and protocols, Methods in Molecular Biology. 581, 61-77 (2009).
- Jin, M., Gunawan, C., Uppugundla, N., Balan, V., Dale, B. E. A novel integrated biological process for cellulosic ethanol production featuring high ethanol productivity, enzyme recycling, and yeast cells reuse. Energ. Environ. Sci. 5 (5), 7168-7175 (2012).
- Nigam, J. N. Development of xylose-fermenting yeast Pichia stipitis for ethanol production through adaptation on hardwood hemicellulose acid prehydrolysate. J. Appl. Microbiol. 90 (2), 208-215 (2001).
- Nigam, J. N. Ethanol production from wheat straw hemicellulose hydrolysate by Pichia stipitis. J. Biotechnol. 87 (1), 17-27 (2001).
- Hughes, S. R., et al. Random UV-C mutagenesis of Scheffersomyces (formerly Pichia) stipitis NRRL Y-7124 to improve anaerobic growth on lignocellulosic sugars. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 39 (1), 163-173 (2012).
- Bajwa, P. K., et al. Mutants of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis with improved tolerance to inhibitors in hardwood spent sulfite liquor. Biotechnol. Bioeng. 104 (5), 892-900 (2009).
- Bajwa, P. K., Pinel, D., Martin, V. J. J., Trevors, J. T., Lee, H. Strain improvement of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis by genome shuffling. J. Microbiol. Methods. 81 (2), 179-186 (2010).
- Slininger, P. J., et al. Evolved strains of Scheffersomyces stipitis achieving high ethanol productivity on acid- and base-pretreated biomass hydrolyzate at high solids loading. Biotechnol. Biofuels. 8:60, 1-27 (2015).
- Jeffries, T. W., et al. Genome sequence of the lignocellulosic-bioconverting and xylose-fermenting yeast Pichia stipitis. Nature Biotechnol. 25 (3), 319-326 (2007).
- Zabriski, D. W., Armiger, W. B., Phillips, D. H., Albano, P. A. Fermentation media formulation. Trader’s Guide to Fermentation Media Formulation. , 1-39 (1980).
- Syzbalski, W., Bryson, Y. Genetic studies on microbial cross resistance to toxic agents. I. Cross resistance of Escherichia coli to fifteen antibiotics. J. Biotechnol. 64 (4), 489-499 (1952).
- Klinke, H. B., Thomsen, A. B., Ahring, B. K. Inhibition of ethanol-producing yeast and bacteria by degradation products produced during pre-treatment of biomass. Appl. Microbiol. Biotechnol. 66, 10-26 (2004).
- Almeida, J. R. M., Bertilsson, M., Gorwa-Grauslund, M. F., Gorsich, S., Liden, G. Metabolic effects of furaldehydes and impacts on biotechnological processes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 625-638 (2009).
- Allen, S. A., et al. Furfural induces reactive oxygen species accumulation and cellular damage in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Biofuels. 3, (2010).
- Weisburger, J. H. Mutagenic, carcinogenic, and chemopreventive effects of phenols and catechols: the underlying mechanisms. ACS Symposium Series. 507, 35-47 (2009).
- Slininger, P. J., Dien, B. S., Lomont, J. M., Bothast, R. J., Ladisch, M. R. Evaluation of a kinetic model for computer simulation of growth and fermentation by Scheffersomyces (Pichia) stipitis fed D-xylose. Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1532-1540 (2014).
- Wang, X., et al. Comparative metabolic profiling revealed limitations in xylose-fermenting yeast during co-fermentation of glucose and xylose in the presence of inhibitors. Biotechnol. Bioeng. 111 (1), 152-164 (2014).
- Slininger, P. J., Branstrator, L. E., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. Growth, death, and oxygen uptake kinetics of Pichia stipitis on xylose. Biotechnol. Bioeng. 37 (10), 973-980 (1991).
