Tecniche per l'evoluzione della robusta lievito Pentoso-fermentazione per bioconversione della lignocellulosa a etanolo
Summary
Tecniche di evoluzione e di isolamento Adaptive sono descritti e hanno dimostrato di produrre derivati di tensione Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 che sono in grado di consumare rapidamente esosi e zuccheri misti pentosi in enzima saccarificato idrolizzati undetoxified e di accumulare più di 40 g / L di etanolo.
Abstract
Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme saccharification processes release sugars that can be fermented by yeast. Traditional industrial yeasts do not ferment xylose (comprising up to 40% of plant sugars) and are not able to function in concentrated hydrolyzates. Concentrated hydrolyzates are needed to support economical ethanol recovery, but they are laden with toxic byproducts generated during pretreatment. While detoxification methods can render hydrolyzates fermentable, they are costly and generate waste disposal liabilities. Here, adaptive evolution and isolation techniques are described and demonstrated to yield derivatives of the native Scheffersomyces stipitis strain NRRL Y-7124 that are able to efficiently convert hydrolyzates to economically recoverable ethanol despite adverse culture conditions. Improved individuals are enriched in an evolving population using multiple selection pressures reliant on natural genetic diversity of the S. stipitis population and mutations induced by exposures to two diverse hydrolyzates, ethanol or UV radiation. Final evolution cultures are dilution plated to harvest predominant isolates, while intermediate populations, frozen in glycerol at various stages of evolution, are enriched on selective media using appropriate stress gradients to recover most promising isolates through dilution plating. Isolates are screened on various hydrolyzate types and ranked using a novel procedure involving dimensionless relative performance index (RPI) transformations of the xylose uptake rate and ethanol yield data. Using the RPI statistical parameter, an overall relative performance average is calculated to rank isolates based on multiple factors, including culture conditions (varying in nutrients and inhibitors) and kinetic characteristics. Through application of these techniques, derivatives of the parent strain had the following improved features in enzyme saccharified hydrolyzates at pH 5-6: reduced initial lag phase preceding growth, reduced diauxic lag during glucose-xylose transition, significantly enhanced fermentation rates, improved ethanol tolerance and accumulation to 40 g/L.
Introduction
Un 1,3 miliardi di tonnellate a secco annuo stimato di biomassa lignocellulosica potrebbero sostenere la produzione di etanolo e consentire agli Stati Uniti di ridurre il consumo di petrolio del 30%. 1 Sebbene impianto a biomasse miscele rendimenti idrolisi zucchero ricchi di glucosio e xilosio, inibitori della fermentazione sono generati dal pretrattamento chimico necessario per abbattere emicellulosa ed esporre la cellulosa per l'attacco enzimatico. L'acido acetico, furfurolo, e idrossimetilfurfurale (HMF) si pensa di essere componenti chiave tra molti inibitori che si formano durante il pretrattamento. Per spostare l'industria dell'etanolo lignocellulosiche avanti, ricerca e procedure per consentire l'evoluzione di ceppi di lievito in grado di sopravvivere ed efficiente funzionamento di utilizzare sia esosi e pentosi in presenza di tali composti inibitori sono necessari. Una significativa debolezza aggiuntiva di ceppi di lievito industriali tradizionali, come Saccharomyces cerevisiae, è l'incapacità di fer efficientet il xilosio disponibile in idrolizzati di biomassa vegetale.
Pichia stipitis ceppo NRRL Y-7124 (CBS 5773), recentemente rinominato stipitis Scheffersomyces, è un lievito di fermentazione pentoso nativa che è ben noto a fermentare xilosio in etanolo. 2,3 L'evoluzione del ceppo NRRL Y-7124 è stato perseguito qui perché è stato documentato per hanno il maggiore potenziale di ceppi autoctoni di lievito di accumulare etanolo economicamente recuperabili superiore a 40 g / L con poco sottoprodotto xilitolo. 4,5,6 In mezzi ottimale, S. ceppo stipitis NRRL Y-7124 produce 70 g / L di etanolo a 40 ore (1,75 g / L / hr) con una resa di 0,41 ± 0,06 g / g in colture ad alta densità cellulare (cellule 6 g / L). 7,8 Resistenza agli inibitori di fermentazione etanolo, furfurale e HMF è stata riportata anche, 9 e S. stipitis è stato classificato tra i più promettenti lieviti indigeni pentoso-fermentazione disponibili per scala commerciale di etanolo production da lignocellulosa. 10 Il nostro obiettivo era di applicare diverse idrolizzati lignocellulosici undetoxified e pressioni selettive etanolo per forzare evoluzione verso un derivato più robusta di ceppo NRRL Y-7124 adatto per applicazioni industriali. Chiave tra caratteristiche migliorate ricercati erano i tassi più veloci di zucchero di assorbimento in idrolizzati concentrati, ridotto diauxy per un utilizzo misto di zucchero più efficiente e più elevati tolleranze di etanolo e inibitori. L'applicazione di S. stipitis a idrolizzati undetoxified era un obiettivo chiave della ricerca per eliminare le spese di funzionamento aggiunto associati ai processi di disintossicazione idrolizzato, come overliming.
Due idrolizzati industrialmente promettenti sono state applicate per forzare l'evoluzione:. Enzima saccarificato espansione pretrattati paglia del mais idrolizzato fibra di ammoniaca (AFEX CSH) e diluire l'acido-pretrattati panico verga idrolizzato liquore (PSGHL) 11,12 tecnologia di pretrattamento AFEX è stato sviluppato perminimizzare la produzione di inibitori della fermentazione, mentre diluito pretrattamento acido rappresenta la tecnologia minor costo corrente più comunemente praticato per esporre biomassa cellulosica per saccarificazione enzimatica. PSGHL è separabile dalla cellulosa che rimane dopo pretrattamento ed è tipicamente ricco di xilosio dal emicellulosa idrolizzato, ma a basso contenuto di glucosio. AFEX CSH e composizioni PSGHL differiscono l'uno dall'altro in aspetti chiave che sono stati sfruttati per gestire il processo di evoluzione. AFEX CSH è inferiore in aldeidi furano e inibitori dell'acido acetico ma superiore di aminoacidi e fonti di azoto ammoniacale rispetto PSGHL (Tabella 1). PSGHL presenta la sfida aggiuntiva di xilosio essere lo zucchero predominante disponibile. Così PSGHL è opportuno arricchire specificatamente per una migliore utilizzazione xilosio in idrolizzati, una debolezza prevenire l'uso commerciale di lievito disponibili. Anche tra i lieviti di fermentazione pentosi autoctoni, la dipendenza dal xylo zucchero non ottimalese per sostenere la crescita cellulare e la riparazione diventa ancora più impegnativo in idrolizzati a causa di una serie di motivi:. carenze nutrizionali, inibitori causando danni alla cella integrità strutturale e disagi per il metabolismo dovuti a squilibri redox 9 supplementazione azoto, in particolare sotto forma di aminoacidi, possono rappresentare un costo di esercizio significativo per fermentazioni. L'impatto della supplementazione di azoto sullo screening isolare e la classifica è stata esplorata con idrolizzati panico verga.
Individui migliorati sono stati arricchiti in una popolazione in continua evoluzione utilizzando più pressioni selettive affidamento sulla naturale diversità genetica del S. popolazione stipitis e mutazioni indotte da esposizioni a due idrolizzati diverse, etanolo o radiazioni UV. Pressioni di selezione sono stati applicati in parallelo ed in serie ad esplorare il progresso evoluzione S. stipitis verso derivati desiderati in grado di crescere e fermentare in modo efficiente in idrolizzati(Figura 1). La coltura ripetitivo delle popolazioni funzionali in idrolizzati sempre più difficili è stato realizzato in micropiastre utilizzando una serie di diluizioni di entrambi il 12% glucano CSH AFEX oppure PGSHL preparati al 20% di solidi di carico. L'applicazione di una crescita etanolo-sfidato il xilosio in coltura continua ulteriormente migliorata Afex CSH adattato popolazioni, arricchendo di fenotipi che dimostrano meno suscettibilità a etanolo repressione di utilizzo xilosio. Quest'ultima caratteristica è stata recentemente dimostrato problematico l'utilizzo pentoso dal ceppo NRRL Y-7124 dopo la fermentazione del glucosio. 8 Arricchimento su PSGHL è stato accanto esplorata per ampliare la funzionalità idrolizzato.
Derivati putativi migliorate di S. stipitis NRRL Y-7124 sono stati isolati da ogni fase del processo di evoluzione utilizzando arricchimento mirato in condizioni di stress e la placcatura di diluizione a raccogliere le colonie dalle popolazioni più diffuse. relativa adimensionaleindici di performance (RPI) sono stati utilizzati per classificare ceppi sulla base di prestazioni complessive, in cui il comportamento cinetico è stata valutata su diversi tipi idrolisati e supplementi nutrizionali applicate. Anche se i successi di varie procedure di adattamento per migliorare la funzionalità di S. stipitis in idrolizzati lignocellulosici sono stati precedentemente documentato, i ceppi che dimostrano la produzione di etanolo economica su idrolizzati undetoxified non sono stati precedentemente riportati. 13-17 Utilizzando le procedure evoluzione da visualizzare in dettaglio qui, Slininger et al. 18 hanno sviluppato ceppi che sono notevolmente migliorate nel corso ceppo NRRL Y-7124 e sono in grado di produrre> 40 g / L di etanolo in AFEX CSH ed enzimi saccarificato idrolizzato panico verga (SGH) opportunamente integrato con le fonti di azoto. Questi nuovi ceppi sono di futuro interesse per la lignocellulosa in via di sviluppo per l'industria dell'etanolo e come soggetti di genomica ulteriori studi edificiosu quelli di ceppo precedentemente sequenziato NRRL Y-11545. 19 Uno studio di genomica dei migliori ceppi di prodotti durante le varie fasi di evoluzione diagramed nella figura 1 sarebbe chiarire la cronologia delle modifiche genetiche che si sono verificati durante lo sviluppo come un preludio ad ulteriori ricerche miglioramento ceppo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diversi passaggi sono stati fondamentali per il successo del processo di evoluzione. Innanzitutto, è fondamentale scegliere adeguate pressioni selettive a guidare l'evoluzione della popolazione verso i fenotipi desiderati che sono necessari per una corretta applicazione. I seguenti sollecitazioni selettivi sono stati scelti per S. stipitis sviluppo e applicata in tempi opportuni per guidare arricchimento per i fenotipi desiderati: crescente forza del 12% glucano AFEX CSH (che costringe la crescita e la fer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to express our sincere appreciation to Drs. Kenneth Vogel, Robert Mitchell and Gautam Sarath, Grain, Forage, and Bioenergy Research Unit, Agricultural Research Service, Lincoln, NE for their kind supply of switchgrass for this project. We also thank U.S. Department of Energy for funding to VB through the DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (GLBRC) Grant DE-FC02-07ER64494.
Materials
| Cellic Ctec, Contains Xylanase (endo-1,4-) | Novozymes | No product number | www.novozymes.com, 1-919-494-3000 |
| Cellic Htec, Contains Cellulase and Xyalanase | Novozymes | No product number | www.novozymes.com, 1-919-494-3000 |
| Toasted Nutrisoy Flour | Archer Daniels Midland Co. (ADM) | 63160 | ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL 1800-37-5843 |
| Pluronic F-68 (Surfactant) | Sigma-Aldrich | P1300 | Sigma-Aldrich |
| Difco Vitamin Assay Casamino Acids | Becton Dickinson and Company | 228830 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| D,L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T3300 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, Sigma-Aldrich |
| Bacto Agar | Becton Dickinson and Company | 214010 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Bacto Malt Extract | Becton Dickinson and Company | 218630 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Bacto Yeast Extract | Becton Dickinson and Company | 212750 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Peptone Type IV from soybean | Fluka | P0521-500g | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Adenine, > 99% powder | Sigma-Aldrich | A8626 | CAS 73-24-5, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Cytosine, > 99% | Sigma-Aldrich | C3506 | CAS 71-30-7, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Guanine, SigmaUltra | Sigma-Aldrich | G6779 | CAS 73-40-5, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Thymine, 99% | Sigma-Aldrich | T0376 | CAS 65-71-4, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Uracil, 99% | Sigma-Aldrich | U0750 | CAS 66-22-8, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous, Certified ACS | Fisher Chemical | D16-500 | CAS 50-99-7, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich |
| D-Xylose, assay > 99% | Sigma-Aldrich | X1500 | CAS 58-86-6, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich |
| 96-well, flat bottom plates | Becton Dickinson Falcon | 351172 | multiple suppliers: e.g. Thermo-Fisher, VWR, Daigger |
| Wypall L40 Wiper | Kimberly-Clark | towel in microplate boxes to absorb water for humidification; multiple suppliers: e.g. Thermo-Fisher, uline, Daigger | |
| Corning graduated pyrex flask, 125-mL, narrow opening (stopper #5) | Corning Life Science Glass | 4980-125 | multiple suppliers: e.g. Thermo-Fisher, VWR, Daigger |
| Innova 42R shaker/incubator, 2.5 cm (1") rotation | New Brunswick Scientific (1-800-631-5417) | M1335-0016 | multiple suppliers: e.g. Eppendorf, Thermo-Fisher. Other shaker/incubators with a 2.5 cm (1") throw could be used. |
| Duetz Cover clamp for 4 deepwell MTP plates | Applikon Biotechnology | Z365001700 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Duetz System sandwich cover for 96 deepwell plates | Applikon Biotechnology | Z365001296 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Duetz System silicone seal (0.8mm black low evap) for 96 deep well plate cover | Applikon Biotechnology | V0W1040027 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Blue microfiber layer for Duetz system sandwich cover | Applikon Biotechnology | V0W1040001 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| 96 well, 2 mL square well pyramid bottom plates, natural popypropylene | Applikon Biotechnology | ZC3DXP0240 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Bellco 32mm silicon sponge plug closures, pk of 25 for 125-mL flasks | Bellco | 1924-00032 | Thomas Scientific, their Catalog number is 1203K27 |
| Bellco Spinner Flask, 1968-Glass Dome, Sealable Flange Type, 100-mL working volume. This design no longer manufactured. | Bellco | 1968-00100 (original Cat. No.) | Jacketed vessels have lower inlet & upper outlet ports for temp. control with circulating water bath. Vessels are 75mm in outer diam and 200mm in height. There are four side ports at ~45o angles and one top port. Port openings appropriate size for size 0 neoprene stoppers (21-22mm inner diameters on ports). |
| Mathis Labomat IR Dryer Oven | MathisAg | Typ-Nbr BFA12 215307 | Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157 |
| Dual Channel Biochemistry Analyzer | YSI Life Sciences | 2900D-UP | www.ysi.com, robotic system for rapid sugars assay in 96-well microplate format |
| PowerWave XS Microplate Spectrophotometer | Bio-Tek Instruments, Inc | MQX200R | www.biotek.com |
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