Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Методы эволюции Robust пентозы брожения дрожжей для биоконверсии лигноцеллюлозы к этанолу

doi: 10.3791/54227 Published: October 24, 2016

Summary

Адаптивные методы эволюции и изоляции описаны и продемонстрированы с получением производных Scheffersomyces stipitis штамма NRRL Y-7124, которые способны быстро потреблять гексозы и пентозы смешанных сахаров в фермента осахаривают undetoxified гидролизатов и аккумулировать более 40 г / л этанола.

Introduction

По оценкам , ежегодные 1,3 млрд сухих тонн биомассы лигноцеллюлозы может поддержать производство этанола и позволит США сократить потребление нефти на 30%. 1 Хотя биомасса растений урожайность гидролиза сахара смеси , богатые глюкозы и ксилозы, ингибиторы брожения генерируются предварительной химической обработки , необходимой чтобы сломать гемицеллюлозы и подвергать целлюлозу ферментной атаке. Уксусная кислота, фурфурол и оксиметилфурфурола (HMF), как полагают, являются ключевыми компонентами среди многих ингибиторов, которые формируют во время предварительной обработки. Для того чтобы переместить лигноцеллюлозного производство этанола вперед, исследования и процедуры, чтобы позволить эволюцию штаммов дрожжей, способные выживать и эффективно функционировать использовать как гексозы и пентозы, в присутствии таких соединений, ингибирующих необходимы. Существенным дополнительным недостатком традиционных промышленных штаммов дрожжей, таких как Saccharomyces CEREVISIAE, является невозможность эффективного fermenт ксилозы имеющихся в гидролизатов биомассы растений.

Pichia stipitis штамма NRRL Y-7124 (CBS 5773), который недавно был переименован Scheffersomyces stipitis, является уроженцем пентозы брожения дрожжей , который хорошо известен брожение ксилозы в этанол. 2,3 Эволюция штамма NRRL Y-7124 преследовалась здесь , потому что было документально имеют наибольший потенциал нативных штаммов дрожжей для накопления экономически извлекаемые этанола более 40 г / л с небольшим количеством ксилита побочного продукта. 4,5,6 в оптимальном средах, С. stipitis штамм NRRL Y-7124 производит 70 г / л этанола в 40 ч (1,75 г / л / ч) с выходом 0,41 ± 0,06 г / г в культурах с высокой плотностью клеток (6 г / л клеток). 7,8 Сопротивление для ингибиторов ферментации этанол, фурфурол и HMF также сообщалось, 9 и С. stipitis занимает первое место среди наиболее перспективных родных пентозы брожения дрожжей , доступных для промышленного масштаба этанола костюмноп от лигноцеллюлозы. 10 Наша цель заключалась в применении разнообразных undetoxified лигноцеллюлозных гидролизатов и давления отбора этанола , чтобы заставить эволюцию к более надежной производной штамма NRRL Y-7124 , пригодного для промышленного применения. Ключевое место среди усовершенствованных функций искомых были более высокие скорости сахара поглощение в концентрированных гидролизатов, снижение diauxy для более эффективного использования смешанного сахара, а также более высокие допуски этанола и ингибиторов. Применение S. stipitis к undetoxified гидролизатов был одним из ключевых направлений исследований , чтобы исключить дополнительные операционные расходы , связанные с гидролизата процессов детоксикации, такие как overliming.

Две промышленно перспективных гидролизатов были применены к силе эволюции:. Фермента осахаривают аммиака волокна расширения предварительно обработанных гидролизат кукурузы Стовер (AFEX CSH) и разбавленной кислотой предварительно обработанный проса гидролизат ликер (PSGHL) 11,12 технология предварительной обработки AFEX разрабатывается с цельюсвести к минимуму образование ингибиторов ферментации, в то время как предварительная обработка разбавленная кислота, представляет текущую низкую стоимость технологии наиболее часто практикуется подвергать целлюлозной биомассы для ферментативного осахаривания. PSGHL отделима от целлюлозы, оставшегося после предварительной обработки и характерно богатая ксилозы из гидролизованного гемицеллюлозы, но с низким содержанием глюкозы. AFEX CSH и PSGHL композиции отличаются друг от друга в ключевых аспектах, которые эксплуатировались для управления процессом эволюции. AFEX CSH ниже в фурановых альдегидов и ингибиторы уксусной кислоты , но выше , в аминокислоты и источники азота , аммиака , по сравнению с PSGHL (таблица 1). PSGHL представляет дополнительную проблему ксилозы будучи преобладающим сахаром доступны. Таким образом, PSGHL целесообразно специально обогащают для повышения эффективности использования ксилозы в гидролизатов, слабость, предотвращающий коммерческое использование имеющихся дрожжей. Даже среди родных пентозы бродильных дрожжей, опора на неоптимальной сахара XyloSE для поддержки роста клеток и ремонт становится еще более сложной в гидролизатов из - за целого ряда причин:. недостаток питательных веществ, ингибиторов , вызывающих массовые повреждения клеток структурной целостности, а также нарушения в обмене веществ за счет окислительно - восстановительных дисбалансов 9 добавок азота, особенно в форме аминокислоты, могут представлять собой значительный эксплуатационные расходы для брожений. Влияние добавок азота на изолята скрининга и ранжирования был исследован с просо гидролизатов.

Улучшенные особи были обогащены в развивающейся популяции с использованием нескольких давления отбора зависит от естественного генетического разнообразия S. населения и мутации stipitis , индуцированный воздействием двух различных гидролизатов, этанол или УФ - излучения. Давление отбора были применены параллельно и последовательно исследовать ход эволюции в S. stipitis к желаемых производных , способных расти и брожение эффективно в гидролизатов(Рисунок 1). Повторяющиеся культивирование функциональных групп населения в более сложных гидролизатов было достигнуто в микропланшетах с использованием серии разведений либо 12% глюкан AFEX CSH или иначе PGSHL получают при 20% загрузки твердой фазы. Применение этанола роста заражали на ксилозы в непрерывной культуре дополнительно улучшена Afex CSH адаптированный населения путем обогащения для фенотипов, демонстрирующих меньшую восприимчивость к этанолу репрессию утилизации ксилозы. Последняя особенность недавно было показано , проблематично пентозы использования штаммом NRRL Y-7124 следуя ферментации глюкозы. 8 Обогащение на PSGHL была следующая изучить , чтобы расширить функциональные возможности гидролизата.

Предположительные улучшенные производные S. stipitis NRRL Y-7124 были выделены из каждой фазы процесса эволюции с использованием целевого обогащения в условиях стресса и разбавления покрытия , чтобы выбрать колонии из наиболее распространенных групп населения. безразмерная относительнаяПоказатели эффективности (RPIs) были использованы для ранжирования штаммов на основе общей производительности, где кинетическое поведение было оценено на различных типах гидролизата и пищевых добавок, применяемых. Хотя успехи различных процедур адаптации в целях улучшения функциональности S. stipitis в лигноцеллюлозных гидролизатов были ранее документированы, штаммы , демонстрирующих экономичного производства этанола на undetoxified гидролизатов не сообщалось ранее. 13-17 С использованием процедур эволюции визуализировать здесь более подробно, Slininger и др. 18 разработали штаммы, которые значительно улучшены по сравнению родительский штамм NRRL Y-7124 и способны производить> 40 г / л этанола в AFEX CSH и фермента осахаривают гидролизат проса (SGH) соответственно с добавлением источников азота. Эти новые штаммы представляют интерес для будущего развивающегося лигноцеллюлозы в этанол промышленности и в качестве субъектов дополнительных исследований в области геномики строительствана тех , кто ранее секвенировали штамма NRRL Y-11545. 19. геномика исследование верхних штаммов , полученных на различных этапах эволюции схематически на рисунке 1 бы пролить свет на историю генетических изменений , которые произошли в процессе развития в качестве прелюдии для дальнейших исследований по улучшению деформации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка исходных материалов и оборудования для Assays

  1. Подготовка гидролизатов с использованием 18 до 20% исходной биомассы сухого веса в реакции предварительной обработки для использования в процессе эволюции, изоляции и процедур ранжирования. См Slininger и др. 2015 18 для детальных методов подготовки Afex CSH, PSGHL и SGH с азотными добавками N1 или N2 , используемых в процессе эволюции, выделения или ранжирования. Таблицу 1 для композиции каждого гидролизата типа.
    Примечание: Азотные Укрепления SGH были назначены в качестве SGH-N1 или SGH-N2 определяется следующим образом: SGH-N1 = SGH укреплен до 42: 1 молярном углерода к азоту (C: N) с источниками азота, включая мочевины, витамин свободных аминокислот кислоты из казеина, D, L-триптофан, L-цистеин и витамины из определенных источников (таких, что ~ 15% от молярного азота N первична аминоазот (ПАН) и ~ 85% N от мочевины); SGH-N2 = SGH укреплен до 37: 1 C: N с мочевиной и соевой муки, как самая низкая стоимость коммерческого источника OF аминокислоты и витамины, обеспечивая ~ 12% N от PAN и 88% в виде мочевины.
  2. Приобретать лиофилизированного культуры родительского штамма, Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 (CBS 5773) от АРС Culture Collection (Национальный центр сельскохозяйственного использования результатов исследований, Пеория, штат Иллинойс), а также подготовить запаса глицерина культур в соответствии с указаниями. Поддержание маточных культур родительского дрожжей и его производных в 10% глицерине при -80 ° С.
    1. запасы подряд глицериновые дрожжам солод пептон декстроза (YM) Чашки с агаром (3 г / л дрожжевого экстракта, 3 г / л солодового экстракта, 5 г / л пептона, 10 г / л декстрозы, 20 г / л агара) и инкубировать 48- 72 ч при 25 ° C. 8 развитых пластин может храниться до недели при температуре 4 ° с до использования в качестве жидкой предварительной культуры инокулята.
  3. Подготовка Оптимальное определенной среде (ODM), синтетической среде , совместимые с промышленными способами формулирования 20 , который был ранее разработанный для оптимального превращения ксилозы в этанол материнской улайн Scheffersomyces (Pichia) stipitis NRRL Y-7124. 7 Используйте определенной среде во всех предварительных культивирований и культур для биопроб производительности ферментации , а также для производства этанола оспорено, эволюция непрерывной культуры ксилозы кормили. Состав ODM указана для справки в таблице 2.
  4. Как было описано ранее, 18 анализа биомассы клеток с использованием cuvette- или микроплиты спектрофотометр чтения, в случае необходимости, для измерения культуры оптической плотности при длине волны 620 нм (A 620). Сахара, количественно оценить этанол, фурфурол, оксиметилфурфурола (HMF) и уксусную кислоту в образцах культур с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) или роботизированного ферментативного определения глюкозы и ксилозы для более высокой пропускной способности.

2. Пополните Прочные производных во время последовательной передачи на AFEX CSH

  1. Инокулирования предкультуральной штамма NRRL Y-7124. Передача клетки от YM агара до 75 мл ODM + 150 г / л ксилозы, чтобы поддерживать способность расти при Osmotic стресс. Выдержите Предкультуры в 125 мл колбах с закрытыми кремниевого губки штекеры 24 час при 25 ° С с перемешиванием (150 оборотов в минуту, 1 "орбита).
  2. Размораживайте аликвоты 6-12% глюкан AFEX CSH в холодной воде для использования. Доведения рН до 5, если это необходимо, и фильтр стерилизуют перед подготовкой серии разведений в 96-луночных микропланшетов.
  3. Заполните микропланшет с 50 мкл на лунку и 8 лунок на гидролизата разведения, а затем прививают с несколькими микролитров предкультурой на лунку , чтобы обеспечить начальную оптическую плотность (620 нм) 620 ≥0.1. Инкубируйте пластины статически 24-48 ч при 25 ° С в пластиковой коробке с влажным бумажным полотенцем для влажности.
  4. Использование наиболее Концентрированный гидролизат разбавления , который заметно вырос до 620> 1, передача 1-5 мкл в каждую лунку нового гидролизат серии разведений для достижения первоначальный 620 ≥ 0,1.
  5. Монитор культуры роста 620 в микропланшетах с помощью спектрофотометра. Неинокулированной серии разведений серVES в качестве контроля и пустым. Пластина крышки оставлены во время мониторинга в целях предотвращения загрязнения, а также показания соответствующим образом скорректированы.
  6. Подготовка запасов глицерина адаптации культур на регулярной основе для последующего выделения улучшенных штаммов или для использования в reinoculating сохраняющуюся гидролизат серии разведений. Для подготовки запасов, бассейн четыре скважины (200 мкл) наибольшей концентрации гидролизата колонизирована. Смешайте 1: 1 с 20% стерильного глицерина в криопробирок, чтобы заморозить клетки в 10% глицерине при -80 ° С.
  7. Повторите шаги 2,3-2,6 до роста в 12% глюкан AFEX CSH не постоянно видна через 24 часа.

3. Изолировать одноклеточ- толерантные производные после обогащения на AFEX CSH

  1. Streak выбраны запасы глицерина адаптации культур к YM агар, а также использовать полосы для инокуляции 50 мкл 3% или 6% глюкан AFEX CSH (рН 5) в каждом из трех стрипы (начальная 620 ~ 0,1). Инкубируйте микропланшеты 24 ч, как и в шаге 2.3. бассейн репликите колонизировали скважины на самом высоком гидролизата прочности с сильным ростом и разбавления пластины YM или 6% глюкан AFEX CSH агар. Готовят последний как 1: 1 смесь стерилизовать через фильтр 12% глюкан Afex CSH с теплым раствором автоклавного / л агара 30 г.
  2. Pick 5 отдельных колоний с самого высокого роста показывая разбавление пластины после 24-48 ч инкубации при 25 ° C, чтобы заморозить, как глицерин маточных культур. Streak каждая колония на YM пластины. Выдержите 24 ч. С помощью стерильной петли, передавать развитую полосу клеток в небольшом объеме 10% глицерина, перемешать, чтобы приостановить клетки, и распределить на 2-3 криопробирок для замораживания при температуре -80 ° С.

4. Оценка Выполнение AFEX CSH толерантного производных По сравнению с Родителя

  1. Тестирование изолятов в простых 6% глюкан AFEX CSH Batch культур.
    1. Передача клетки от 48 ч пластин прожилками от запасов глицерина до рН 7 фосфатный буфер калия (0,4 мм) с получением суспензии клеток с 620 = 10. Используйте 1 мклкаждая подвеска для инокуляции каждого из четырех лунок 50 мкл 3% глюкан гидролизата первоначального 620 = 0,2. Инкубируйте микропланшеты 24 ч, как и в шаге 2.3. Подготовьте 3% глюкан Afex CSH при рН 5 путем разбавления 12% глюкан Afex CSH 1: 3 стерильной водой.
    2. Передача двух 24 часа в сутки стрипы для инокуляции 25 мл Предкультуры с рН 5 12% глюкан AFEX CSH, используемые при 50% от полной силы. Выдержите Предкультуры в 50 мл колбах с кремнием губки затворов в течение 24 ч при 25 ° С, ~ 150 оборотов в минуту (1 "орбита) Подготовьте вполсилы 12% глюкан AFEX CSH путем разбавления гидролизате 1: 1. Стерильной водой.
    3. Используйте вполсилы гидролизата Предкультуры для инокуляции аналогичные 25 мл культуры роста к исходному A 620 = 0,1. Инкубируйте культур роста, как указано выше (4.1.2) и образец в день (0,2 мл). Монитор скопления биомассы (A 620) и концентрации сахаров и продуктов ферментации (ВЭЖХ).
  2. В качестве альтернативы, repitch (т.е., урожай и гEuSe) популяции 6% глюкана AFEX CSH выращенных дрожжей для тестирования в 8% глюкана гидролизата периодических культурах, как описано ранее. 18
  3. В качестве альтернативы, дополнительное испытание популяции repitched 6% глюкана CSH культур Afex путем кормления с 12% глюкана гидролизата, как было описано ранее. 18
  4. Тест diauxic отставание изолятов в пакетном культурах ODM со смешанными сахара.
    1. Привить Предкультуры 75 мл ODM с 150 г / л ксилозы в 125 мл колбы с силиконовой губки закрытия путем переноса петли из YM глицерина прожилками. Выдержите 24 ч, как и в шаге 2.1.
    2. Используйте Предкультуры для инокуляции аналогичные 75 мл тест-культур с ODM, содержащий 75 г / л глюкозы и 75 г / л ксилозы при рН 6,5. Колбах при 25 & deg; С, 150 оборотов в минуту. Образец ежедневно.
    3. В качестве альтернативы, проверить влияние 0-15 г / л уксусной кислоты на diauxy в процессе ферментации глюкозы и ксилозы с использованием аналогичного протокола, за исключением того, исходный уровень рН устанавливается на уровне 6,0 ± 0,2 в тест-культур для поддержания рН 6-7 дюкольцо потребление уксусной кислоты, как описано ранее. 18

5. Применение непрерывной культуры выбрать для Ethanol-вызов Ксилоза утилизации

  1. Подготовка ODM в качестве непрерывной подачи культуральной среды 60-100 г / л ксилозы, 20-50 г / л этанола при рН 6,3 ± 0,2. Выбор комбинации ксилозы и этанола , чтобы имитировать частичную ферментацию 150 г / л ксилозы, предполагая , потенциальный выход ~ 0,5 г этанола / г ксилозы, и для размещения потенциал 50-70 г / л этанола , чтобы иметь место. 8
  2. Для приготовления непрерывной культуре посевного материала , передача представителя AFEX CSH-толерантный колонии (аналогично Colony 5 в примере, на рисунке 1) с помощью петли из YM пластины 48 ч до 75 мл этанола , свободных от ODM (100 г / л ксилозы, в данном случае) в 125 мл колбах. Инкубируют при 25 ° С, 150 оборотов в минуту (1 "орбиты) в течение 24 ч. Выбор концентрации ODM ксилозы предкультурой совпадающее исходной непрерывной культуры холдинг объема.
  3. Инокуляции непрерывной культуры , держащей объем ODM при рН 6,3 ± 0,2 , имеющий 100 г / л ксилозы + 20 г / л этанола с ~ 5-10 мл предкультуральной концентрат AFEX CSH-толерантного изолята (аналогично Colony 5, на фиг.1 ) , чтобы получить 100 мл при начальной 620 ~ 0,5. Поддержание культуры проведение объема (V R), при 25 ° С в 100 мл с рубашкой , вращающуюся колбу при перемешивании со скоростью 200 оборотов в минуту и снабжен оборудованием стерилизуемым рН - электродом, регулятор рН и температуры контролируемой водяной бане , циркулирующей.
  4. Первоначально, так как рост клеток будет медленным из-за воздействия этанола, установить питательной среды для дозирования с использованием рН-активируемые насос. Установите насос для питания рН-6,3 ODM с 100 г / л ксилозы и 50 г / л этанола при ферментации культуры падает рН до 5,4, тем самым останавливая дальнейшее снижение рН. Поддержание объема в 100 мл с вытекающего насос непрерывно скользя поверхность культуры. Следовательно, концентрация этанола повышается при продолжении обмена веществ и питания. Измерить сточные воды и берут образцы (1-2 мл) из непрерывных культур каждый 48-72 ч для анализа жизнеспособных концентрации клеток, продуктов и субстратов, как описано ранее. 18 , чтобы найти жизнеспособное концентрации клеток, делают серийные разведения 1:10 образцов в буфер (смотрите раздел 4.1.1) и распространение пластины разведения на YM агар (см 1.2.1). На основе сбора сточных вод скоростей (Q), вычислить степень разбавления (D) (Q / V R), а также , в примере S. stipitis, она колебалась от 0 до 0,01 ч -1.
  5. Сохранить запасы глицерина регулярно путем выделения из жизнеспособности пластин буферизованных разбавлений образца формирования 30-100 колоний, представляющих наиболее распространенные устойчивые колонистов в то время в обогащении. Flood пластины с ~ 5 мл 10% -ного глицерина, чтобы обеспечить получение дубликатов криопробирок. Для поддержания или передышки, остановить непрерывную культуру и перезапустить при необходимости, используя самую последнюю (устойчив) глицерине (ов).
  6. Для повторного запуска, Штриховатост в глицерине (ы) наиболееУстойчивые популяции Ю.М. агар и передавать 24-48 HR клетки с помощью петли для предварительной культуры без этанола ODM для инкубации, как указано выше. Инокуляции 100 мл , удерживающие объем ODM первоначального 620 0.5 с использованием концентрата из предварительно культивируют дрожжей, и позволяют выращивать культуру порционно к стационарной фазе , прежде чем поток подачи среды перезапущен.
  7. Если культуры могут устойчиво расти при> 0,01 ч -1 на ксилозы в присутствии> 25 г / л этанола, начать непрерывную подачу культуры (ODM + 60 г / л ксилозы + этанол в интервале от 30 до 50 г / л) при низкой Степень разбавления ~ 0,01 ч -1 до 100 мл , занимающих объем (первоначально ODM + 60 г / л ксилозы + 20 г / л этанола). В течение долгого времени, повышают этанол в подаваемом в направлении 50 г / л. Захват передовых популяций в запасах глицерина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание низкой скорости разбавления позволяет сформировать достаточно высокой концентрации клеток, чтобы снизить доступность кислорода и поддержки брожения.
  8. Необязательно применять ультрафиолетовое (УФ) irradiatиона ежемесячно запаса глицерина популяций, используемых для reinoculate непрерывных культур.
    1. Ресуспендируют колонии из запаса глицерина прожилок в 10 мл ODM (как в предварительных культивирований) с 60 г / л ксилозы, а также объединить все запасы в одной колбе. Стерильном Нанести Отстоявшийся клеточную суспензию при ~ 5 × 10 8 жизнеспособных клеток / мл , чтобы только покрыть днища 4-5 чашки Петри с 6 мл / пластины. Для получения 6 мл покрытия стандартного одноразового использования чашку Петри, обойтись 15 мл, чтобы преодолеть поверхностное натяжение, а затем удалить 9 мл.
    2. Expose каждую открытую культуру пластину УФ от источника света в кабинете биологической безопасности. Отрегулируйте время воздействия УФ-излучения или расстояния, чтобы получить желаемую скорость убийств> 90%. Здесь, выставить в течение 45 мин при температуре около 56 см от источника.
    3. Развести пластины клеточные суспензии до и после облучения. Скорость убийств Оценка на основе колониеобразующих единиц. Для S. stipitis пример, скорость убийств составляет ~ 97%.
    4. Передача УФ-воздействию культур (24-30 мл) к фольге-соуERed колбу на 50 мл, и инкубируют при 25 ° С и 150 оборотах в минуту в течение 24 часов , чтобы позволить небольшой процент жизнеспособных клеток заселить до ~ 1 × 10 8 жизнеспособных S. stipitis клеток / мл. Предотвращая фото реактивации, крышка из фольги сохраняет мутации в то время как культуры инкубируют.
    5. Используйте заселен мутагенеза культуру для инокуляции непрерывных культур до ~ 1 × 10 7 жизнеспособных клеток / мл. Перезапустите этанол обогащенный ODM + 60 г / л корма ксилозы среды для продолжения процесса выбора.

6. Оценка глицерине групп населения и выявления лиц, с улучшенной Ксилоза ферментация в присутствии этанола

  1. Streak выбран глицерине культуры Ю.М. агар в качестве первого шага на экране для лучшего роста и ферментации ксилозы в присутствии этанола.
  2. Передача каждого выделяющегося население быть подвергнуты скринингу с агаровых прожилок 75 мл в предварительных культивирований ODM с 150 г / л глюкозы, и инкубируют в 125 мл колбы 96ч до применения в качестве посевного материала для тест-культур. Крупные глюкоза выращенных популяции потребует индукцию ферментов утилизации ксилозы.
    1. Для тестирования индукции, собирать каждую культуру, приостановить клетки до 30 мл, парафировать 620 40 в ODM + 60 г / л ксилозы + 30-45 г / л этанола, и инкубировали при 25 ° С, 150 оборотов в минуту (1 "орбита) в 50 мл колбы с кремниевыми затворами губки. Нарисуйте образцы дважды в день для мониторинга поглощения ксилозы методом ВЭЖХ.
  3. В качестве альтернативы, как описано в разделе Slininger и др., 18 с целью оценки роста на ксилозы в присутствии этанола, готовят Предкультуры каждого эволюционировала населения путем переноса петли до 75 мл ODM с 150 г / л ксилозы в 125 мл колбах, и инкубировать 96 ч при 25 ° с, 150 оборотов в минуту (1 "орбиты). Инокулируйте тест - культур с низкой начальной 620 0.1 в 25 мл ОДМ + 60 г / л ксилозы + 30-45 г / л этанола в 125 мл колбах. Инкубируйте колбы при 25 ° C, 300 оборотов в минуту, 1 "орбиты и образца.

  1. На основании результатов шага 6, выберите глицерине популяции, показывающие превосходную способность к росту на брожение и ксилозы в присутствии этанола. Используйте их для стрик пластин. Полоса пластины используются для подготовки плотных, буферные суспензий ячейки 620 = 5. Затем клеточные суспензии используют для инокуляции Предкультуры в 96-луночных глубоких до 620 = 0,5. Инокулируйте 1 мл Предкультуры на PSGHL смешанный 1: 1 с ОДМ + 50 г / л ксилозы (без этанола). Выдержите Предкультуры в 96-луночные, глубокие луночные планшеты с вентилируемым низкой испаряемости охватывает в течение 48 ч при 25 ° С, 400 оборотов в минуту, 1 "орбиты. Отдельные различных запаса глицерина населения пустые лунки.
  2. Используя каждый предкультуральной, прививают шестнадцать 1 мл реплицировать культуры первоначального 620 ~ 0,5 в 1: 1 PSGHL: ODM + 50 г / л ксилозы с 20, 30 или 40 г / л этанола обогащать толерантных колонистов. Выдержите обогащения cultuрес аналогично предварительных культивирований.
  3. Для каждого отдельного глицерина запаса, урожай культуры скважин с самой высокой концентрацией этанола позволяет использовать роста и ксилозы. Пластинчатые каждую линию клеток к YM агар для получения распространенных единичных колоний для сохранения в глицерине. Возьмите десять колоний на линии и полосы каждой ячейки к агаром YM для подготовки запаса глицерина.

8. далее обогащать Robust Evolved Штаммы во время последовательной передачи на PSGHL, как и для AFEX CSH

  1. Подготовка предварительных культур NRRL Y-7124 (родителю), AFEX CSH толерантных эволюционировали изолируют, и непрерывной культуры эволюционировали населения с повышенной способностью использовать ксилозу в присутствии этанола. Инокулируйте 75 мл ОДМ + 150 г / л ксилозы по петле из глицерине прожилками, как описано выше (этап 2.1) для процесса гидролизат адаптации AFEX CSH.
  2. Развести PSGHL с водой, чтобы обеспечить ряд возрастающих концентраций. Готовят 96-луночного микроплиты для каждой из трех клеточных линий, используя каждыйPSGHL разбавления для заполнения 8 лунок с 50 мкл. Используйте предкультуральной для инокуляции 50 мкл каждого микро-культуры серии разведения парафировать 620 ~ 0,1-0,5.
    1. Продолжить развитие дрожжей в увеличении преимущества PSGHL с использованием той же процедуры , как AFEX CSH гидролизата адаптации подробно описано выше (стадия 2) до тех пор , культуры не могут расти в полной гидролизата Предел прочности при стабильном 14-й среднее соотношение ΔA 620 на Δtime как последовательные переводы продолжались еще четыре месяца.

9. Изолировать Колонии Одноклеточные Использование PSGHL Градиенты с или без Этанол Вызова

  1. Получить одноклеточного изолирует непосредственно от полной крепости PSGHL конечных адаптации пластин путем разбавления покрытия на YM агар. Возьмите десять больших колоний для каждой из трех клеточных линий и бар серию до YM пластин для подготовки запасов глицерина, как описано выше (шаг 3.2).
  2. При желании, изучить более ранние моменты времени вПроцесс эволюции путем выделения из хранимых запасов глицерина трех клеточных линий.
    1. Инокуляции предкультурой для каждой клеточной линии путем петли из глицерине прожилок и инкубировать 24 ч по 30 мл ODM + 50 г / л ксилозы (50 мл колб, 25 ° C, 150 оборотов в минуту).
    2. Вызов клетки из предварительных культивирований к росту в гидролизата путем инокуляции 50 мкл 50% PSGHL в стрипы к исходному A 620 ~ 0,2 и инкубирования статически 48 часов.
    3. Spread 0,1 мл каждой культуры на обогащенной PSGHL градиентных чашках с агаром в пределах гидролизат прочности от 0 до 50% (доставляющие ~ 300-400 жизнеспособных клеток на пластину), и выбрать 10 отдельных колоний на одну клеточную линию от максимально возможной площади гидролизат концентрации градиента . 21 подряд выбрал колонии YM для подготовки запаса глицерина , как в шаге 3.2.
    4. В качестве альтернативы к этапу 9.2.3, вместо инокуляции агара градиента, прививают лунки 96-луночных микро-пластин первоначального 620 ~ 0,2, WheRe скважины предназначены для размещения ряда гидролизатов концентраций от 50 до 100% -ного этанола и от 10 до 40 г / л. В этом случае, разработка микро-пластин 72-96 ч и иным образом, как на стадии 2.3. Изолировать десять одиночных колоний из лунок самых сложных комбинаций гидролизат-этанола, свидетельствующие о росте с помощью разбавления покрытия, а также подготовить запасы глицерина, как в шаге 3.2.

10. В первичном скрининге, ликвидировать Inferior изолирует путем сравнения и ранжирования выступлений на PSGHL на двух питательными условиями

  1. Нанести высокую пропускную способность глубоко луночного планшета экран производительности PSGHL на экран пять наборов тридцати изолирует наряду с NRRL Y-7124 родителем и AFEX CSH-толерантного изолята (аналог колонии 5 эволюции примера Рисунок 1) в качестве средства управления , чтобы выбрать шесть лучших штаммов (20%) из каждого набора, чтобы перейти на второй ступени отбора (этап 12).
  2. Проводят экран в глубоких луночных заполненных 1 мл на лунку и покрыты Wiй крышки из нержавеющей стали с черным силиконовым низким испарительных уплотнений. Крепление всех видов пластин на борту инкубатор / шейкере и работают при температуре 25 ° C и 400 оборотов в минуту (1 "шейкер орбиты). Конструированию все глубоко луночный планшет заполнения шаблонов, чтобы обеспечить разделение различных изолятов с помощью открытых скважин.
  3. Для начала культивации выбрать шарик клеток из глицерина прожилками, приготовленных из 30 культур, полученные, как описано выше (в шагах 3, 7 и 9), чтобы дублировать скважин ОДМ + 50 г / л ксилозы и инкубировать 48 ч.
  4. В качестве среды для вызова preculturing изоляты, готовят 50% PSGHL путем смешивания PSGHL 1: 1 с ODM + 10 г / л глюкозы + 50 г / л ксилозы. Для скрининга 30 изолятов и два контрольных штаммов, 2 пластины с 2-х скважин в каждой из 16 изолятов заполнены, оставляя пустые лунки между различными изолятов.
  5. Для CHALLENGE культур, передачи, объемом 50 мкл ODM предварительных культур (А 620 ~ 10) к каждому из двух 50% PSGHL вызов культуральных лунок для каждого из изолятов и контролирует , чтобы получить INITIАль 620 ~ 0,5 и инкубировать 72 ч.
  6. Используйте два тестовых сред разной питательной богатства для скрининга изолятов: 60% PSGHL + ODM питательных веществ; и 75% PSGHL + ODM + YM питательные вещества. Добавить ODM питательные вещества (за исключением сахара) в половине силы в качестве стандарта для ODM использования с 50 г / л сахара (шаг 1.3). Как назначенный, добавьте YM питательных веществ (кроме сахара) в половину стандартной прочности 3 г / л дрожжевого экстракта, 3 г / л экстракта солода, 5 г / л пептона.
  7. Привить тест - культур путем переноса 50 мкл 72 ч 50% PSGHL бросить вызов предварительных культур для инокуляции 1000 мкл для первоначального 620 ~ 0,5 в пяти глубоких скважин для каждого из двух тестовых сред.
  8. Образец каждого изолята ежедневно. Пипетировать содержимое хорошо микроцентрифуге трубки и центрифуге (5533 XG, 15 мин), чтобы получить надосадочную жидкость для этанола, глюкозы и ксилозы анализов с высокой пропускной способностью. Мера биомассы в качестве 620 в 96-луночных микро- планшетах (200 мкл / лунку) с помощью спектрофотометра.
  9. В каждый набор 30olates испытания (5 комплектов для S. stipitis NRRL Y-7124 развивались штаммы), рассчитать относительные показатели эффективности (RPI) , как описано в пункте 11 ниже , и использовать для ранжирования каждого штамма на основе выхода этанола (максимум этанола накопленной за первоначального сахара входит в комплект) и скорость поглощения ксилозы (концентрация ксилозы, потребленной на начальной 96 часов) на обоих испытательных средах.

11. Ранг изолятов первичного скрининга PSGHL Использование индекса относительной производительности (RPI)

  1. После первичного скрининга, вычислить безразмерные относительные показатели эффективности (RPI) для того , чтобы ранжировать 30 изолятов в каждом из пяти различных экспериментов на экран изолирует на PSGHL с двух различных композиций питательных на эксперимент, то есть 60% PSGHL и 75% PSGHL.
  2. Вычислить статистический параметр F для использования в рейтинге изолята производительности в группе изолятов в данном эксперименте: F = (XX ср) / с. Здесь X является параметр рабочей характеристики, такие как выход (Y)или скорости (R), наблюдается для каждого изолята, в то время как X и СРЕДНЕМ s являются среднее и стандартное отклонение, соответственно, Х наблюдается для всех изолятов в пределах данного эксперимента. Для нормальных распределений, -2 <F <2.
  3. Для каждого изолята в эксперименте, рассчитать относительную производительность на основе скорости, RPI R = (2 + F R) × 100/4, а так же рассчитать относительную эффективность на основе доходности, RPI Y = (2 + F Y) × 100/4 , Значение RPI находится в пределах от 0 до ~ 100 процентили (низшего к высшему). Затем вычислить RPI средние значения для каждого изолята в пределах данного гидролизата эксперимента следующим образом : RPI = ср (RPI Y + RPI R) / 2, где выход и скорость взносов имеют равный вес в данном приложении.
    Следует отметить, что в целом, выход и скорости параметры могут быть взвешены, если считать неравное по значимости.
  4. Рассчитайте RPI в целом по п типов гидролизатов тестируемых: RPI в целом = 1, п [(RPI Y + RPI R) / 2] я / п. Рассмотрим каждый изолируют в экспериментальном наборе 30 изолятов и 2 управления. Во время первичного рейтинге ~ 150 одиночной колонии изолятов адаптирована к ксилозу богатой PSGHL, ИРЦ в целом рассчитывается по ставкам и доходности в рамках двух составов PSGHL , применяемых на экране, то есть, 60% PSGHL и 75% PSGHL, где п = 2.
  5. На основе RPI в целом в пределах каждого эксперимента, выбрать верхний процент изолятов , чтобы перейти к вторичному экрану. В этом примере верхний 20% штаммов выбираются так, чтобы проходить через (то есть 30 из 150 проверенных).

12. В дополнительном экране, сравнение лучших исполнителей основного экрана на несколько полных гидролизатов (> 100 г / л Смешанные сахара), чтобы Reveal Высочайшие функционирующая Прочные Штаммы

  1. Сравнить топ исполнителей PSGHL на 6% глюкан Afex CSH и SGH исправленный с двумя уровнями азота, SGH-N1 и SGH-N2 (составs , как в таблице 1) для окончательного ранжирования. Сите 30 изолятов , которые были главными исполнителями в первичной глубокой луночного планшета экран PSGHL (шаги 10 и 11) и два элемента управления (родительского штамма NRRL Y-7124 и AFEX CSH-толерантного изолят ( по аналогии с Colony 5, рис 1 пример ).
  2. Начало посадки культурных, выбирая бусинку клеток из глицерина прожилками продублировать глубоких скважин 1 мл ОДМ + 50 г / л ксилозы, как до, так и инкубировать 48 ч в глубокой системе луночного планшета (шаг 10,2). Затем перенесите 50 мкл ODM предварительных культивирований до 50% SGH бросить вызов культур, и инкубировать в глубокой системе луночного планшета в течение 72 ч , чтобы получить 620 в ~ 10). Приготовьте 50% SGH путем смешивания SGH 1: 1 с сахарина ODM + 50 г / л ксилозы (рН 5,6).
  3. Для каждого из изолятов, инокуляции 16 мл аликвоты SGH-N1 или N2 SGH-с клеточного осадка (15 мин, 2711 XG) из трех лунках вызов культуры , чтобы получить первоначальный тест - культуры А 620 ~ 2,0. Выдержите тест-культур на 25 & #176;. С, 180 оборотов в минуту (1 "орбита) в 25 мл колбы с оболочкой из силиконовой губки закрытий Примеры колб ежедневно и анализируют на экране PSGHL.
  4. Кроме того, экран изолирует, как в шагах 12.2 и 12.3, но на этот раз заменой SGH-N1 и SGH-N2 с 6% глюкан AFEX CSH при рН 5,2 для использования при получении вызов культуральной среды и испытания культуральной среды. Для 50% -ного условного предела CHALLENGE культур, используют 6% Afex CSH, разведенным 1: 1 с водой, так как оно представляет собой азот достаточно, без поправок.
  5. Повторите шаги 12.1-12.4, чтобы дублировать результаты.

13. Ранг по исполнениям изолятов на вторичном экране с помощью RPI в целом для Голосовать за использования несколько полных гидролизатов

  1. Расчет относительных показателей эффективности (RPI) для того, чтобы ранжировать каждый из верхних 20% изолятов (~ 30 из 150) от основного экрана, которые были испытаны на вторичном экране на фермента осахаривают гидролизата композиций различной питательной богатства.
  2. оценка каждогоизолят испытания на вторичном экране на основе скорости поглощения ксилозы и выхода этанола осуществляется на трех ферментных-осахаривают предварительно обработанные гидролизатов композиций в дубликате, включая AFEX CSH (I = 1 и 2), SGH-N1 (I = 3 и 4) и SGH -N2 (I = 5 и 6).
  3. Вычислить RPI в целом для каждого изолята, и применить этот ранжирования параметр , чтобы дополнительно веять список высших изолятов: RPI в целом = Σ = 1, п [(RPI Y + RPI R) / 2] я / п, где п = 6 ,
    Примечание: Продемонстрировать кинетика превосходящими изолятов в SGH-N2 гидролизатов в колбах культуры, следуя процедурам , описанным в Slininger 18 и др.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

С. stipitis выработалось с использованием комбинаций трех культур отбора, которые включали Afex CSH, PSGHL и этанол-вызов ксилозы офсетные непрерывную культуру. На рисунке 1 показана принципиальная схема экспериментов эволюции , выполненных вместе с изолятов найти либо выполнить наиболее эффективно в целом, или наиболее эффективно на одном из гидролизатов протестированных. в таблице 3 приведены номера NRRL о присоединении этих улучшенных изолятов и обобщает адаптационных напряжений , применяемых в процессе достижения обогащенную населения , из которого был выделен каждый штамм. Некоторые изоляты были замечены, чтобы иметь высокую относительную производительность на одном или двух гидролизата типов, но 7 из 11 изолятов хорошо зарекомендовал себя на всех типах гидролизатов, хотя большинство из них были выявлены и оспорены только одного типа в процессе эволюции. Успехи различной эволюции здесь подходы, используемые продемонстрированы на рисунках 2 -7 и в таблице 4.

На рисунке 2 показаны различные положительные сдвиги , наблюдавшиеся после первой фазы адаптации , в которых были обогащены устойчивые производные штамма NRRL Y-7124 во время последовательной передачи в возрастающих концентраций AFEX CSH (этап 2). В культурах, растущих на 6% глюкан AFEX CSH, то усовершенствованным население демонстрирует более быстрое накопление и более высокие финальные титры этанола, чем родительский штамм. Более быстрое использование глюкозы также рассматривается наряду с более быстрым поглощением ксилозы сразу после истощения глюкозы. Дополнительно на фиг.3, стабильность измененной популяции признаков продемонстрировано в синтетической среде ODM со смесью 87 г / л глюкозы и 66 г / л ксилозы. В этом случае, как обогащенная популяция (фигура 3В) и изолированных колоний (колониеобразующих 1 и колонии 5, рис 3С и 3D, разрешениемpectively) способны опережать родительский штамм, используя ксилозу более эффективно для производства этанола более быстро, сокращая время до пика этанола, по крайней мере 4-х дней. Значительно более высокие концентрации этанола были накоплены эволюционировали штаммов на ODM (55-60 г / л) по сравнению с исходным (40-45 г / л). Мутации, которые привели к устойчивому фенотипу восстановленного diauxy при переходе к глюкозе-ксилозы и более эффективной ферментации ксилозы, возникла как популяция дрожжей развилась в AFEX CSH.

Дальнейшее совершенствование колонии 5 преследовали его представления естественного отбора в ксилозы офсетные непрерывной культуре в присутствии возрастающих уровней этанола до 50 г / л. При выполнении этого условия, население дрожжей сохраняется в непрерывной культуре должны быть способны индуцировать ферменты для утилизации ксилозы в качестве единственного источника углерода для того, чтобы иметь возможность расти со скоростью, достаточно высокой для заполнения ферментера, несмотря на устойчивый разбавленияставка. В случае родительского штамма, индукция ксилозы ферментов начинает ингибируется при концентрации этанола цене 15-20 г / л. 8 Производные Colony 5 были захвачены в запасы глицерина при ранних и поздних временных точках функционирования непрерывной культуры, и фиг.4 показывает успешное улучшение утилизации ксилозы в присутствии 40 г / л этанола , наблюдаемой в дифференцированной производных Colony 5 по сравнению с NRRL Y-7124 родителем и начальной Colony 5 , привитых к процессу.

Изолятов , вытекающие из всех фаз схемы адаптации рисунка 1 были показаны в PSGHL для выявления тех , с превосходной способностью к ферментировать ксилозу (этап 10.1). Изоляты , показанные на рисунке 5 , являются одними из лучших исполнителей на PSGHL выхода из ~ 150 занимает в этом первичном экране и во всех вторичных экранах производительности , как описано ниже. Чтобы указать улучшение эволюционировали изолятовпо отношению к их родителей, была выражена производительность каждого изолята как отношение кинетических значений параметров изолята к родительским штаммом. Отношение значения "один" произошло , если производительность изолят была эквивалентна материнской компании . На рисунках 5а и итог верхней изоляции выступления на 60% и 75% сильных PSGHL с ODM или ODM + YM пищевых добавок. При увеличении концентрации гидролизата и резкостью, показатели функционирования уменьшились. В прочности PSGHL 60%, пять из семи верхней изолятов подвергается воздействию давления отбора PSGHL осуществляется во много раз лучше, чем NRRL Y-7124 (изолируют 1). Четыре изолята лучше, чем у Colony 5 (изолировать 33), которая эволюционировала во время воздействия AFEX CSH, но не было никакого предыдущего селективного воздействия PSGHL. Тем не менее, в 75% прочности PSGHL, только 3 изолятов значительно превосходил и родителю и Colony 5 (изолируют 33), несмотря на добавленных питательных веществ. Из них превосходит изолирует 15 и 16 были previouslу оспорены с увеличением концентрации PSGHL в качестве давления отбора направляющей эволюцию. Штаммы 15, 14 и 3 были подвергнуты только PSGHL, в то время как 11, 13 и 16 имели несколько экспозиций. Штаммы 3, 11 и 13 были из более ранних моментов времени в ходе эволюции на PSGHL и так было несколько меньше возможностей развиться толерантность по сравнению с 14, 15 и 16. В то время как это видно на рисунке 5 , что последовательная передача в увеличивающихся сильных PSGHL служил развивать штаммы устойчивых к его ингибиторной среде, также очевидно, что воздействие родительского штамма NRRL Y-7124 к AFEX CSH в одиночку потенциально может генерировать изоляты, такие как Colony 5 (33) с перекрестной толерантности к PSGHL. Таким образом, было показано, что устойчивые штаммы, способные выступать в нескольких гидролизатов можно найти путем обогащения толерантности в одном гидролизата с последующим скринингом производительности в другой. Изолятов, полученных из ксилозы вскармливании непрерывной культуре также подвергали скринингу на PSGHL 60% и 75% прочности спитательные вещества, а также добавляли глюкозу в 75 г / л, с тем, чтобы поддерживать вызов этанола и испытать diauxic задержку на ксилозы следующие утилизации глюкозы. В то время как изоляты 27, 28 и 30 были выше других из этой фазы адаптации, оба дают и ксилозы показатели эффективности скорость поглощения были похожи на родителей на 75% PSGHL с добавлением ODM и YM питательных веществ, которое не обязательно удивительного в том, что ни один не имел предыдущая воздействие этого гидролизата (смотри также Slininger и др. 18 дополнительных данных , не показанных здесь для культур при условии , 75 г / л глюкозы).

Лучшие штаммы, выбранные из основного экрана на ксилозы богатых PSGHL были впоследствии скринингу на трех полных гидролизатов. Эти гидролизаты (таблица 1) включены AFEX CSH и разбавленных кислот предварительной обработке SG обрабатывали коммерческим целлюлаз и дополнениями на двух разных уровнях азота (SGH-N1 и SGH-N2) , чтобы определить наиболее универсальный ISOLates относительно вариаций ингибитора и питательной среды. Относительные показатели эффективности (RPIs) были рассчитаны для ферментации каждого изолята в пределах каждого гидролизата (6А). На фиг.6В показаны объединенные общие показатели производительности , рассчитанные для каждого изолята. Пять изолятов (3, 14, 27, 28, 33) имели общую RPI выше 60, что отсортирована в качестве наиболее надежной для всех вариаций гидролизата и питательных условий, вместе взятых. Обзор таблице 3, и изолирует 3 и 14 были эволюционировали в PSGHL в то время как 27, 28, и 33 были эволюционировали в AFEX CSH или AFEX CSH и этанол-вызов непрерывной культуры на ксилозы. Ни один из штаммов, обладающих превосходной множественный гидролизат использование не развивались на более чем один гидролизата.

Некоторые штаммы были "специалисты" работают лучше по обе SGH-N1 / 2 или AFEX CSH. Эти изоляты наиболее эффективны в качестве специалистов по SGHгидролизаты (11, 16 и 9) были получены в процессе эволюции на PSGHL в качестве окончательного или только вызов. Изолятов 11 и 16, которые изначально были обогащены за счет увеличения Afex CSH вызов, способность эффективно использовать Afex CSH не был активно выбран во время длительного окончательного обогащения в PSGHL, а также ключевые генетические факторы, поддерживающие его использование, очевидно, были потеряны. И наоборот, изолирует 14, 25, 27, 30 и 33 были превосходные исполнители на AFEX CSH, и все, за исключением изолят 14 развились на AFEX CSH с или без этанола вызов. Так что, как и ожидалось, направленная эволюция на AFEX CSH или PSGHL, как правило, чтобы выбрать для дрожжей хорошо адаптированы к гидролизата выбора. Единственным исключением в этом отношении был изолят 14. изолят 14 возникла из PSGHL только вызов и был выделен из YM агар разведения покрытия конечной культуры обогащения PSGHL. Slininger и др. 18 показали , что этот изолят обладают превосходной способностью индукции фермента ксилозы в глюкозе выращенных клеток в присутствии5-15 г / л уксусной кислоты и снижается diauxic лаг на ODM с 75 г / л каждого из глюкозы и ксилозы, несмотря на> 30 г / л этанола, имевшие место до глюкозо-ксилоза точки перехода.

Вышестоящие кинетика эволюционировали штаммов относительно родительского штамма S. stipitis NRRL Y-7124 были продемонстрированы , как показано в таблице 4, представляющие результаты низкого уровня аэрации колбах культур , привитых к исходному 620 8,4 ± 2,5 75 мл SGH-N2 (рН 6,2) , инкубировали в 125 мл колбах с силиконовой губки крышками на 25 ° с, 150 оборотов в минуту (1 "орбита), а на рисунке 7, представляющие умеренную аэрацию опок культур инокулировали парафировать 620 0,5 в 23 мл SGH-N 2 на 50 мл колбу. 18 Эти условия представляют собой два разных типа операций , которые предложены литература как потенциально коммерчески перспективными для производства этанола С. stipitis. 8,22 В елямит пример низкого уровня аэрации, высокая плотность клеток обеспечивает быстрое брожение, чтобы начать немедленно. В то время как во втором случае, низкую плотность клеток и более высокий уровень аэрации приводят к логарифмическому росту строить населения и ускорения роста ассоциированных превращение сахара в этанол. Эти данные свидетельствуют о том, что выросшие штаммы имеют значительные кинетические преимущества по сравнению с родительским штаммом: больше скорости поглощения быстрого глюкозы (Таблица 4), более быстрый скорость поглощения конкретных ксилозы (Таблица 4), более быстрого повышения производительности этанола на глюкозу и ксилозу и в целом (таблица 4), короче , отставание предшествующего роста (Рисунок 7), и короче diauxic глюкозы ксилозы переходное отставание. Эти усовершенствования позволили этанол аккумулировать свыше 40 г / л и до пика днями ранее (рисунок 7) , чем был замечен для родительского NRRL Y-7124. Более высокая общая производительность этанола (таблица 4) был достигнут при 1,5 до 5 разS , что из родительского штамма (таблица 4), в зависимости от выделяемого штамма.

Рисунок 1
Рисунок 1:. Scheffersomyces stipitis диаграмма адаптации потока Схема , показанная указывает порядок напряжений , применяемых в процессе адаптации и точки восстановления превосходных изолятов (цифры в скобках). Смотрите также Таблица 3 изолята ключ в качестве эталона для деформации идентичностей. Для того, чтобы обеспечить ориентацию времени, числа в красный цвет указывает на количество дней в каждой фазе адаптации. Для последовательных фаз переноса в AFEX CSH и ксилозы богатых PSGHL, каждый день адаптации представляет собой приблизительно 2-4 поколений. Для непрерывной фазы культуры (205 дней общего количества), степень разбавления D варьировала в ~ 0-0,1 ч -1 в течение 125 сут работы с рН активируемые кормления. В следующий80 дней, операция была в непрерывном потоке с D в 0,012 ч -1, обеспечивая время генерации (LN 2) / (D) 58 ч или 1 поколения на 2,4 г в стационарном состоянии. Затем образец адаптированного населения из 205-дневного непрерывного культивирования подвергали мутагенезу с УФ - светом и засевают в непрерывной культуре с управлением D в 0,012 час -1. (Воспроизведено из Slininger и др. 18) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2:. Улучшенная партия ферментации 6% глюкана AFEX CSH Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 родительский штамм ферментации 6% глюкана AFEX CSH (А) по сравнению с адаптировано Колонии 5 сбраживание 6% глюкана AFEX предварительно обработанных стеблей кукурузы чydrolyzate (В). Символы обозначают биомассы (красный квадрат), глюкозу (черный круг с прерывистая линия), ксилозы (синий круг с сплошной линией), этанол (зеленый треугольник) и ксилита (фиолетовый ромб). (Воспроизведено из Slininger и др. 18) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Снижение diauxic отставание в определенной среде со смешанными Брожение сахаров характеристики сравниваются в ODM с 66 г / л глюкозы и 87 г / л ксилозы для родительского штамма S.. stipitis NRRL Y-7124 (А), AFEX CSH адаптированный населения , производный от Y-7124 (В), одноклеточной колонии 1 изолированный от адаптированного S. stipitis населения (С), одна ячейка Coloштат Нью - Йорк 5 изолированы от адаптированного населения (D). Символы обозначают биомассы (красный квадрат), глюкозу (черный круг с прерывистая линия), ксилозы (синий круг с сплошной линией), этанол (зеленый треугольник), ксилит (фиолетовый алмаз) и адонит (золото бриллиант с черным краем). (Воспроизведено из Slininger и др. 18) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4: Этанол устойчивые производные колонии 5. Гидролизат толерантного Colony 5 получила дальнейшее развитие непрерывного отбора культуры на ODM , содержащей ксилозу в качестве единственного источника углерода и высоким уровнем этанола. Два производных популяции запаса глицерина, полученные в начале процесса отбора (2A.1.53R, оранжевый треугольник и пунктирной линией) иосле УФ-облучение непрерывной культуры посевного (2A.1.30R.2, фиолетовый круг и пунктирной линией) показаны в сравнении с NRRL Y-7124 родительского штамма (зеленый круг с сплошной линией) и AFEX CSH толерантного Colony 5 (черный треугольник с Сплошная линия). Поглощение ксилоза густыми популяциями глюкозы выращенных дрожжей (620 = 50) в ODM с 40 г / л этанола показали , что все штаммы , адаптированные превзошло неприспособленной родителя в способности вызывать ксилозы метаболизм. (Воспроизведено из Slininger и др. 18) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рис . 5: Соотношение повышения производительности толерантного изолята по сравнению с родителем Спектакли превосходными толерантных изолятов суммированы по отношению кконтроль родительский штамм NRRL Y-7124 для каждого состава PSGHL (A, B). Представления были оценены с точки зрения скорости поглощения ксилозы (синие полосы, представляющие соотношение изолята к родителю) и выхода этанола на сахар из комплекта поставки (зеленые полосы, представляющие соотношение изолята к родителю). (Воспроизведено из Slininger и др. 18) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6: Изолировать ранжирования на основе RPI. Понятие относительный показатель производительности (RPI) был применен к результатам деятельности вторичного экрана для того, чтобы ранжировать 33 изолятов в пределах каждого гидролизата типа на основе скорости поглощения ксилозы и выхода этанола на сахар из комплекта поставки. (A) Относительная Ранкороль любого данного изолята зависит от типа гидролизата (P <0,001): SGH-N1 (синие столбики), SGH-N2 (красные столбики) и AFEX CSH (зеленые столбики). (B) Общий RPI рассчитывается по всем гидролизата типов (светло - голубые столбики) показали превосходные штаммы с наиболее надежной производительности через различных условиях гидролизата. (Воспроизведено из Slininger и др. 18) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7
Рисунок 7: Сравнительные SGH ферментация вышестоящих адаптированных изолятов S. stipitis. Улучшенный адаптированный изоляты и их родительский штамм NRRL Y-7124 сравниваются ферментацию ферментативные гидролизаты разбавленной кислоты предварительно обработанных проса (20% твердых веществ нагрузки) при 25 ° C и начальный рН 6,2 при низкой начальной плотность клеток. Время курсы биомассы (красные квадраты), глюкоза (черные круги и прерывистая линия), ксилозы (синие круги и сплошная линия) и этанола (зеленые треугольники) показаны. Усы представляют диапазон относительно среднего значения, отмеченного символами. (Воспроизведено из Slininger и др. 18) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1:. Композиции гидролизатов , используемые в культивации (. Воспроизведено из Slininger и др 18) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 2: Оптимальная среда для Defined Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 7ТПС: //www.jove.com/files/ftp_upload/54227/54227table2.xlsx "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 3:. Резюме превосходящих толерантного Scheffersomyces stipitis штаммов , используемых для ферментации гидролизатов биомассы растений (. Воспроизведено из Slininger и др 18) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 4: Сравнительная кинетика изолятов на проса гидролизата SGH-N2 заражают первоначального 620 = 8,4 ± 2,5 Цены нормированные ставки на единицу оптической плотности во время глюкозы или потребления ксилозы.. (Воспроизведено из Slininger и др. 18) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы скачать этот ТАBLE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Несколько шагов имеют решающее значение для успеха процесса эволюции. Во-первых, она является ключом, чтобы выбрать соответствующие давления отбора, чтобы вести эволюцию населения в сторону желаемых фенотипов, которые необходимы для успешного применения. Следующие селективные напряжения были выбраны для S. stipitis развитие и применяются в соответствующие моменты времени , чтобы направлять по обогащению для желательных фенотипов: повышение прочности на 12% глюкана AFEX CSH (вынуждающих роста и ферментации различных сахаров в присутствии уксусной кислоты и низкие уровни фурановых альдегидов и других ингибиторов); ксилозы подают непрерывные культуры с увеличением концентрации этанола (вынуждающих индукции ксилозы фермента для уменьшения diauxic задержки); и увеличение прочности на 20% нагрузки твердых частиц PSGHL (вынуждающих рост и ферментацию ксилозы в присутствии высокой уксусной кислоты, фуранов и другие ингибиторы). Во-вторых, важно сохранить растущие популяции дрожжей путем замораживания глицерина Stocks образцов населения, как прогрессирует процесс обогащения. Такие снимки населения могут быть сохранены для периодического функционального тестирования для документирования прогресса эволюции и позволить последующие обособления по желанию, или перезапустить эволюции процессов после перерыва. Третий ключевой этап в процедуре эволюции было восстановить исключительные изоляты путем обогащения популяций выбора культуры или глицерина укомплектованный популяций на удобной селективной среде (например, агар или микро-планшеты, содержащие стресс градиент представляет серию гидролизата и / или концентрации этанола) , Затем выжившие колонии, растущие под наиболее стрессовом состоянии может быть выбран, чтобы сохранить для характеристики позже. Эти три основных этапа могут быть повторены, чтобы проводить каждый дополнительный желаемый фенотип давление отбора, или, в качестве альтернативы, множественные давления в одном цикле, если это необходимо. Когда местное население родитель дрожжей подвергается воздействию различных стрессов, генетическое разнообразие, как ожидается, возникают тыс грубые природные или индуцированные мутации, и продолжали воздействие позволит естественный отбор для обогащения для лиц с наиболее полезных мутаций, поддерживающих конкурентное выживание. Ожидается, что выбранный фенотип будет происходить в результате множественных генетических мутаций. В приведенном выше протоколе, мутации могут быть вызваны при УФ-обработки или потенциально во время воздействия дрожжей на гидролизатов. Гидролизаты , как известно, содержат три класса соединений разрушительно для микроорганизмов:. Карбоновых кислот, альдегидов и фенольных соединений 22 Reactive альдегиды, такие как фурфурол и 5-оксиметилфурфурола, может привести к повреждению клеток и вызывают повышение активных форм кислорода (ROS), генерируемый как правило , в митохондрии. РОС хорошо известно, вызывают мутации ДНК в эукариотических клетках. 23,24 The фенольных соединений, присутствующих в гидролизатов, хотя и не ранее , как известно, генотоксичен, может способствовать и синергично мутагенные эффекты альдегидов и мутагенного ROS. 25

jove_content "> Ступенчатый стратегия прогрессивно сложных условиях, как ожидается, построить эволюционировали штаммов с серией улучшений фенотип, как целевой, а также нецелевой. Возможно, что некоторые нецелевой фенотипы могут возникнуть, которые являются нежелательными или неустойчивыми. Для чтобы захватить наиболее функционирующие и устойчивые штаммы, дополнительный ключевой шаг, который необходимо принять, чтобы оценить и сравнить выбранные изоляты коммерчески соответствующие признаки, достигая для обеих целевых и нецелевых фенотипов. для этого, изолят выступления должны быть сопоставлены в разнообразие стрессовых условиях ориентированных на применение, например, в гидролизатов с различными проблемами ингибитора и питательных составов, что позволяет выбору наилучших общих штаммов, устойчивых и устойчивы к широкой промышленной вариации лигноцеллюлозного субстрата. Кроме того, задача устойчивости штамма может быть включена в экран, как это было сделано в примере, включив шаги preculturing involvИНГ первоначальный рост дрожжей на двух неселективных средах, YM агара в течение нескольких поколений с последующим синтетическим ODM с 50 г / л ксилозы в течение еще 6-7 поколений, давая возможность для дестабилизации желаемых черт культуры до воздействия на вызов производительности в гидролизат. На основе существенных признаков производительности, такие как выход этанола и скорость поглощения ксилоза, изоляты затем ранжируются в каждом другом состоянии стресса, такие, как каждый гидролизата среды испытано, которая может отличаться от обогащения культуральной среды изолята в. Безразмерный RPI может быть использован для расчета средней общей относительной производительности и ранг изолятов сравниваемых. Безразмерный фактор целесообразно отражать относительную производительность в различных типах гидролизатов и на основе различных оценок производительности, таких как доходность по сравнению с темпами. Эта процедура ранжирования определяет штаммы, которые выполняют последовательно хорошо через широкие вариации в условиях роста и гидрolyzates и склонны быть одновременно надежными и генетически стабильными.

Различные итерации и модификации этих основных этапов могут быть необходимы, чтобы приспособить эволюцию любого микробного штамма, способного специфических или уникальных особенностей производительности на лигноцеллюлозных гидролизатов или других субстратов, представляющих интерес. В S. stipitis пример, важно отметить , что добавление питательных веществ, в том числе недорогих коммерческих источников, к гидролизатов , полученных при высоких загрузки твердой фазы имеет ключевое значение для управления динамическим диапазоном изомированных характеристик для улучшения статистического разделения во время скрининга. Важность питательных веществ для успешной ферментации концентрированных ингибирующих гидролизатов также сообщалось ранее, и, как полагают, из-за повышенной потребности аминокислот и других питательных веществ, необходимых для поддержания клеток, окислительно-восстановительного балансировки и ремонта в результате таких стрессовых условиях, особенно при использовании ксилозы. 9,26,27Кроме того, если питательные вещества слишком разреженным или слишком обильная, различия в изомированных представлений может быть трудно обнаружить статистически из-за все изоляты делает чрезвычайно плохо, или все делают чрезвычайно хорошо, соответственно. Изолирует способен выполнять хорошо в разнообразных условиях, как ожидается, будет надежной или устойчивой к изменениям в промышленных условиях.

Основным ограничением этого протокола является то, что адаптивная эволюция и скрининг очень буквальным в результатах, в том, что "один будет получать то, что обогащает и экраны для". Таким образом, обогащение и экранные условия должны быть разработаны для усиления и идентификации лиц, соответственно, с желательных изменений в фенотипов, сохраняя при этом желаемые ранее существовавшие черты. Эволюция может повлиять на невыбранные для признаков , которые имеют решающее значение для промышленной деятельности (например, требования к фактору роста). По этой причине прогресс обогащение населения в течение одного признака необходимо периодически контролироватьред для других признаков как метод поиска неисправностей для нежелательных изменений. Например, одна из уникальных черт S. stipitis является его родным способность расти дальше и брожение ксилозы. Все обогатительные и скрининговые субстраты включали ксилозы в качестве единственного или основного источника способствующим углерода в присутствии ингибиторов. Следовательно, общая черта всех культур по обогащению в этом примере, что они непосредственно выбраны для более быстрых ксилозы с использованием штаммов, население которых становится все более и более обогащены в последовательном или непрерывном культивировании, потому что они были лучше конкурентов. В качестве ожидаемого результата, улучшенные штаммы были все способны к быстрому увеличению потребления ксилозы, но усовершенствования выхода этанола были гораздо менее драматично, чем улучшения скорости поглощения ксилозы. Последняя тенденция, вероятно, произошло, поскольку выход этанола родительским штаммом была относительно высокой на уровне около 0,3 г / г, или 60% от теоретического выхода (0,51 г / г), в качестве клеточного роста стал неподвижным в гидролизатов, оставляя меньше места дляулучшение. В культурах, более высокие урожаи этанола может быть, возможно, выбран потому, что в отношении этанола является ингибитором роста, что обусловило необходимость мониторинга производительности выделившегося населения для этого признака. Концентрации этанола поддерживаться на уровне ниже уровня для ингибирования роста будет, как правило, чтобы нейтрализовать это как фактор отбора. Для S. stipitis NRRL Y-7124, 40 г половинок / л этанола удельная скорость роста в то время как 64 г / л предотвращает рост полностью. 28 В этаноле оспорено непрерывные культуры кормили ксилозы, аэрации поддерживают на низком уровне и нормы разбавления также оставаться достаточно низкой с достаточным количеством ксилозы настоящего к способствуют ферментации, а не дыхание этанола и предотвратить обогащение для нежелательного использования этанола собственности. Кроме того, питательные добавки к гидролизатов, используемых в экранах производительности были тщательно разработан таким образом, чтобы избежать выбора для штаммов, нуждающихся в дорогостоящих снабжение богатой питательными веществами, такими как дрожжевой экстракт. Дополнения всегда включены самые низкие расходы коммерческие источники availablе, такие как соевая мука и мочевина, хотя более богатые компоненты, такие, как в УМ применялись в тандеме культур для сравнительных испытаний, таких, как в препаратах 60% и 75% PSGHL, которые, как правило, разрушающих азота. ODM синтетическая среда, используемый в предкультуральной и исполнительской культуры экранов, была первоначально разработана для оптимальной работы родительского штамма S. stipitis NRRL Y-7124 7 в соответствии с оптимизацией обычной культуральной среды , описанной Traders Protein 20 , который рекомендует определенные ингредиенты, включая витамины, минералы, пуринов и пиримидинов, а также источники аминокислот для снабжения питательными веществами , совместимые с рентабельный промышленного масштаба с использованием коммерческих источников. Заключительная рекомендация в разработке соответствующих штаммов, чтобы сохранить дизайн обогащения и экрана условий, соответствующих, как можно ближе к ожидаемым условиям промышленных процессов.

Экономически конкурентоспособный возобновляемая этанол уже давно преследовали до гразвиваются зависимость от ископаемого топлива. Для того, чтобы улучшить способность S. stipitis NRRL Y-7124 терпеть, растут и брожение ингибирующие гидролизатов лигноцеллюлозы, некоторые исследователи использовали повторяющиеся Культивирование в ксилозы богатых раствора , полученного из разбавленной кислоты-предварительной обработки биомассы лигноцеллюлозы. 13,14,16,17 Over-известкование детоксифицировать ингибиторы по - прежнему необходима , чтобы обеспечить приемлемый уровень производительности ранних адаптированных штаммов на твердой древесины и пшеничной соломы предварительной обработки ликеров. 13,14 Несколько повторных раундов УФ - мутагенеза и генома перетасовки были применены для создания производных S. stipitis NRRL Y-7124 с повышенной толерантностью ингибитора и роста в твердой древесины провели сульфитного (HWSSL). 16,17 Тем не менее, концентрация этанола , образуемые этими штаммами в HWSSL были ниже 10 г / л после 6 до 7 дней. Используя методы , показанные и описанные здесь, новые эволюционировали штаммы S. stipitis NRRL Y-7124 были разработаны для удовлетворения phenotyЦели пэ необходимы для экономичного коммерческого использования: брожение гидролизатов при рН 5-6 без предварительного мер детоксикации, такие как чрезмерная известкование, что приводит к утилизации дорогостоящих отходов; значительно снижается рост и diauxic лаги; аккумуляции этанол достаточно высоко для коммерческой перегонки (> 40 г / л этанола); более быстрый рост и производительность этанола, чем сообщалось ранее для отечественных штаммов дрожжей, бродильные undetoxified гидролизатов; и производительность в различных гидролизатов при высокой загрузки твердой фазы, в том числе соответствующим сои азотом, дополненной SGH (которая в противном случае азот бедных) и неполной эндотелиальной AFEX CSH. Улучшенные штаммы, разработанные с использованием новых агрессивных подходов к эволюции, воплощенные в ключевых шагов, изложенных выше, как ожидается, выиграют экономику производства этанола из сельскохозяйственной биомассы за счет снижения эксплуатационных расходов, капитальных затрат, а также энергетические и водные входы. Это первый план эволюции штамма сообщалось, получая адаптированные штаммы S. stipitдемонстрирует экономически извлекаемые производства этанола на undetoxified гидролизатов.

Новые штаммы S. stipitis , вытекающие из каждой фазы процесса эволюции (рисунок 1) являются кандидатами для будущих исследований , чтобы определить генетические изменения , связанные с конкретными давлений отбора , применяемых и механизмов , лежащих в основе ключевых атрибутов улучшенной гидролизата ферментации, такие как толерантность ингибитора и снижение diauxic лагом. Такое ценное новое знание будет способствовать инженерии дрожжей биокатализаторов и процессов следующего поколения для преобразования лигноцеллюлозных биотоплива и других продуктов. Как получены новые штаммы, то, вероятно, будет полезно еще раз пройти производную популяцию с помощью протокола эволюции штаммов, аналогичной описанной здесь, для того, чтобы выбрать наиболее полезные трансформантов для коммерческого использования в гидролизатов. Точно так же, как и новые штаммы микроорганизмов обнаружены с потенциалом, чтобы сделать мойРиад полезных новых продуктов из возобновляемых источников биомассы, процесс эволюции может быть дополнительно применен для повышения деформации надежности и производительности в гидролизатов, потенциально позволяя новые Биокаталитические процессы и продукты должны быть доступны.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cellic Ctec, Contains Xylanase (endo-1,4-) Novozymes No product number www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Cellic Htec, Contains Cellulase and Xyalanase Novozymes No product number www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Toasted Nutrisoy Flour Archer Daniels Midland Co. (ADM) 63160 ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL  1800-37-5843
Pluronic F-68 (Surfactant) Sigma-Aldrich P1300 Sigma-Aldrich
Difco Vitamin Assay Casamino Acids Becton Dickinson and Company 228830 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
D,L-tryptophan  Sigma-Aldrich T3300 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
L-cysteine  Sigma-Aldrich C7352 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, Sigma-Aldrich
Bacto Agar Becton Dickinson and Company 214010 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Malt Extract Becton Dickinson and Company 218630 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Yeast Extract Becton Dickinson and Company 212750 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Peptone Type IV from soybean Fluka P0521-500g multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Adenine, >99% powder Sigma-Aldrich A8626 CAS 73-24-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Cytosine, >99% Sigma-Aldrich C3506 CAS 71-30-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Guanine, SigmaUltra Sigma-Aldrich G6779 CAS 73-40-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Thymine, 99% Sigma-Aldrich T0376 CAS 65-71-4. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Uracil, 99% Sigma-Aldrich U0750 CAS 66-22-8. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous, Certified ACS Fisher Chemical D16-500 CAS 50-99-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
D-Xylose, assay >99% Sigma-Aldrich X1500 CAS 58-86-6. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
96-well, flat bottom plates Becton Dickinson Falcon 351172 multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Wypall L40 Wiper Kimberly-Clark towel in microplate boxes to absorb water for humidification; multiple suppliers e.g., Thermo-Fisher, uline, Daigger
Corning graduated pyrex flask, 125 ml, narrow opening (stopper #5) Corning Life Science Glass 4980-125 multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Innova 42R shaker/incubator, 2.5 cm (1") rotation New Brunswick Scientific (1-800-631-5417) M1335-0016 multiple suppliers: e.g., Eppendorf, Thermo-Fisher. Other shaker/incubators with a 2.5 cm (1") throw could be used.
Duetz Cover clamp for 4 deep well MTP plates Applikon Biotechnology Z365001700 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System sandwich cover for 96 deep well plates Applikon Biotechnology Z365001296 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System silicone seal (0.8 mm black low evap) for 96 deep well plate cover Applikon Biotechnology V0W1040027 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Blue microfiber layer for Duetz system sandwich cover Applikon Biotechnology V0W1040001 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
96 well, 2 ml square well pyramid bottom plates, natural popypropylene Applikon Biotechnology ZC3DXP0240 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Bellco 32 mm silicon sponge plug closures, pk of 25 for 125 ml flasks Bellco 1924-00032 Thomas Scientific, their Catalog number is 1203K27
Bellco Spinner Flask, 1968-Glass Dome, Sealable Flange Type, 100 ml working volume. This design no longer manufactured. Bellco 1968-00100 (original Cat. No.) Jacketed vessels have lower inlet & upper outlet ports for temp. control with circulating water bath. Vessels are 75 mm in outer diam and 200 mm in height. There are four side ports at ~45° angles and one top port. Port openings appropriate size for size 0 neoprene stoppers (21-22 mm inner diameters on ports).
Mathis Labomat IR Dryer Oven MathisAg Typ-Nbr BFA12 215307 Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157
Dual Channel Biochemistry Analyzer YSI Life Sciences 2900D-UP www.ysi.com, robotic system for rapid sugars assay in 96-well microplate format
PowerWave XS Microplate Spectrophotometer Bio-Tek Instruments, Inc MQX200R www.biotek.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perlack, R. D., Stokes, B. J. US Department of Energy. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. Department of Energy. Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN. (2011).
  2. Prior, B. A., Kilian, S. G., duPreez, J. C. Fermentation of D-xylose by the yeasts Candida shehatae and Pichia stipitis. Process Biochem. 24, (1), 21-32 (1989).
  3. Kurtzman, C. P., Suzuki, M. Phylogenetic analysis of ascomycete yeasts that form coenzyme Q-9 and the proposal of the new genera Babjeviella, Meyerozyma, Millerozyma, Priceomyces and Scheffersomyces. Mcoscience. 51, (1), 2-14 (2010).
  4. Slininger, P. J., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. Comparative evaluation of ethanol production by xylose-fermenting yeasts presented high xylose concentrations. Biotechnol. Lett. 7, (6), 431-436 (1985).
  5. Slininger, P. J., Bothast, R. J., Ladisch, M. R., Okos, M. R. Optimum pH and temperature conditions for xylose fermentation by Pichia stipitis. Biotechnol. Bioeng. 35, (7), 727-731 (1990).
  6. Slininger, P. J., et al. Stoichiometry and kinetics of xylose fermentation by Pichia stipitis. Annals NY Acad. Sci. 589, 25-40 (1990).
  7. Slininger, P. J., Dien, B. S., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. Nitrogen source and mineral optimization enhance D-xylose conversion to ethanol by the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, (6), 1285-1296 (2006).
  8. Slininger, P. J., Thompson, S. R., Weber, S., Liu, Z. L. Repression of xylose-specific enzymes by ethanol in Scheffersomyces (Pichia) stipitis and utility of repitching xylose-grown populations to eliminat diauxic lag. Biotechnol. Bioeng. 108, (8), 1801-1815 (2011).
  9. Slininger, P. J., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. Culture nutrition and physiology impact inhibitor tolerance of the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124. Biotechnol. Bioeng. 102, (3), 778-790 (2009).
  10. Agbogbo, F. K., Coward-Kelly, G. Cellulosic ethanol production using the naturally occurring xylose-fermenting yeast, Pichia stipitis. Biotechnol. Lett. 30, (9), 1515-1524 (2008).
  11. Balan, V., Bals, B., Chundawat, S., Marshall, D., Dale, B. E. Lignocellulosic pretreatment using AFEX. Biofuels: Methods and protocols, Methods in Molecular Biology. 581, Humana Press, a part of Springer Science+Business Media, LLC. 61-77 (2009).
  12. Jin, M., Gunawan, C., Uppugundla, N., Balan, V., Dale, B. E. A novel integrated biological process for cellulosic ethanol production featuring high ethanol productivity, enzyme recycling, and yeast cells reuse. Energ. Environ. Sci. 5, (5), 7168-7175 (2012).
  13. Nigam, J. N. Development of xylose-fermenting yeast Pichia stipitis for ethanol production through adaptation on hardwood hemicellulose acid prehydrolysate. J. Appl. Microbiol. 90, (2), 208-215 (2001).
  14. Nigam, J. N. Ethanol production from wheat straw hemicellulose hydrolysate by Pichia stipitis. J. Biotechnol. 87, (1), 17-27 (2001).
  15. Hughes, S. R., et al. Random UV-C mutagenesis of Scheffersomyces (formerly Pichia) stipitis NRRL Y-7124 to improve anaerobic growth on lignocellulosic sugars. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 39, (1), 163-173 (2012).
  16. Bajwa, P. K., et al. Mutants of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis with improved tolerance to inhibitors in hardwood spent sulfite liquor. Biotechnol. Bioeng. 104, (5), 892-900 (2009).
  17. Bajwa, P. K., Pinel, D., Martin, V. J. J., Trevors, J. T., Lee, H. Strain improvement of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis by genome shuffling. J. Microbiol. Methods. 81, (2), 179-186 (2010).
  18. Slininger, P. J., et al. Evolved strains of Scheffersomyces stipitis achieving high ethanol productivity on acid- and base-pretreated biomass hydrolyzate at high solids loading. Biotechnol. Biofuels. 8:60, 1-27 (2015).
  19. Jeffries, T. W., et al. Genome sequence of the lignocellulosic-bioconverting and xylose-fermenting yeast Pichia stipitis. Nature Biotechnol. 25, (3), 319-326 (2007).
  20. Zabriski, D. W., Armiger, W. B., Phillips, D. H., Albano, P. A. Fermentation media formulation. Trader's Guide to Fermentation Media Formulation. 1-39 (1980).
  21. Syzbalski, W., Bryson, Y. Genetic studies on microbial cross resistance to toxic agents. I. Cross resistance of Escherichia coli to fifteen antibiotics. J. Biotechnol. 64, (4), 489-499 (1952).
  22. Klinke, H. B., Thomsen, A. B., Ahring, B. K. Inhibition of ethanol-producing yeast and bacteria by degradation products produced during pre-treatment of biomass. Appl. Microbiol. Biotechnol. 66, 10-26 (2004).
  23. Almeida, J. R. M., Bertilsson, M., Gorwa-Grauslund, M. F., Gorsich, S., Liden, G. Metabolic effects of furaldehydes and impacts on biotechnological processes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 625-638 (2009).
  24. Allen, S. A., et al. Furfural induces reactive oxygen species accumulation and cellular damage in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Biofuels. 3, (2010).
  25. Weisburger, J. H. Mutagenic, carcinogenic, and chemopreventive effects of phenols and catechols: the underlying mechanisms. ACS Symposium Series. 507, 35-47 (2009).
  26. Slininger, P. J., Dien, B. S., Lomont, J. M., Bothast, R. J., Ladisch, M. R. Evaluation of a kinetic model for computer simulation of growth and fermentation by Scheffersomyces (Pichia) stipitis fed D-xylose. Biotechnol. Bioeng. 111, (8), 1532-1540 (2014).
  27. Wang, X., et al. Comparative metabolic profiling revealed limitations in xylose-fermenting yeast during co-fermentation of glucose and xylose in the presence of inhibitors. Biotechnol. Bioeng. 111, (1), 152-164 (2014).
  28. Slininger, P. J., Branstrator, L. E., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. Growth, death, and oxygen uptake kinetics of Pichia stipitis on xylose. Biotechnol. Bioeng. 37, (10), 973-980 (1991).
Методы эволюции Robust пентозы брожения дрожжей для биоконверсии лигноцеллюлозы к этанолу
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Slininger, P. J., Shea-Andersh, M. A., Thompson, S. R., Dien, B. S., Kurtzman, C. P., Sousa, L. D. C., Balan, V. Techniques for the Evolution of Robust Pentose-fermenting Yeast for Bioconversion of Lignocellulose to Ethanol. J. Vis. Exp. (116), e54227, doi:10.3791/54227 (2016).More

Slininger, P. J., Shea-Andersh, M. A., Thompson, S. R., Dien, B. S., Kurtzman, C. P., Sousa, L. D. C., Balan, V. Techniques for the Evolution of Robust Pentose-fermenting Yeast for Bioconversion of Lignocellulose to Ethanol. J. Vis. Exp. (116), e54227, doi:10.3791/54227 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter