Las técnicas para la Evolución de la robusta levaduras que fermentan la pentosa para la bioconversión de lignocelulosa en etanol
Summary
Técnicas de evolución y de aislamiento de adaptación se describen y se demostraron para producir derivados de la cepa Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 que son capaces de consumir rápidamente azúcares hexosa y pentosa mixtos en enzima sacarificadas hidrolizados undetoxified y acumular más de 40 g / L de etanol.
Abstract
Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme saccharification processes release sugars that can be fermented by yeast. Traditional industrial yeasts do not ferment xylose (comprising up to 40% of plant sugars) and are not able to function in concentrated hydrolyzates. Concentrated hydrolyzates are needed to support economical ethanol recovery, but they are laden with toxic byproducts generated during pretreatment. While detoxification methods can render hydrolyzates fermentable, they are costly and generate waste disposal liabilities. Here, adaptive evolution and isolation techniques are described and demonstrated to yield derivatives of the native Scheffersomyces stipitis strain NRRL Y-7124 that are able to efficiently convert hydrolyzates to economically recoverable ethanol despite adverse culture conditions. Improved individuals are enriched in an evolving population using multiple selection pressures reliant on natural genetic diversity of the S. stipitis population and mutations induced by exposures to two diverse hydrolyzates, ethanol or UV radiation. Final evolution cultures are dilution plated to harvest predominant isolates, while intermediate populations, frozen in glycerol at various stages of evolution, are enriched on selective media using appropriate stress gradients to recover most promising isolates through dilution plating. Isolates are screened on various hydrolyzate types and ranked using a novel procedure involving dimensionless relative performance index (RPI) transformations of the xylose uptake rate and ethanol yield data. Using the RPI statistical parameter, an overall relative performance average is calculated to rank isolates based on multiple factors, including culture conditions (varying in nutrients and inhibitors) and kinetic characteristics. Through application of these techniques, derivatives of the parent strain had the following improved features in enzyme saccharified hydrolyzates at pH 5-6: reduced initial lag phase preceding growth, reduced diauxic lag during glucose-xylose transition, significantly enhanced fermentation rates, improved ethanol tolerance and accumulation to 40 g/L.
Introduction
Se estima que 1,3 millones de toneladas secas anuales de biomasa lignocelulósica podrían apoyar la producción de etanol y permitir que los EE.UU. para reducir su consumo de petróleo en un 30%. 1 Aunque la biomasa vegetal mezclas de los rendimientos de hidrólisis de azúcar ricos en glucosa y xilosa, inhibidores de la fermentación son generados por el pretratamiento químico necesario para descomponer hemicelulosa y celulosa para exponer ataque enzimático. ácido acético, furfural, hidroximetilfurfural y (HMF) se cree que son componentes clave entre muchos inhibidores que se forman durante el pretratamiento. Con el fin de mover la industria del etanol lignocelulósico hacia adelante, la investigación y los procedimientos que permiten la evolución de cepas de levadura capaces de sobrevivir y eficaz funcionamiento de usar tanto hexosa y pentosa en presencia de tales compuestos inhibidores son necesarios. Una debilidad adicional significativo de cepas de levaduras industriales tradicionales, tales como Saccharomyces cerevisiae, es la incapacidad de Fermen eficientet la xilosa disponibles en hidrolizados de biomasa vegetal.
Pichia stipitis tipo de cepa NRRL Y-7124 (CBS 5773), recientemente renombrado stipitis Scheffersomyces, es una levadura de fermentación de pentosa nativo que es bien conocido para fermentar la xilosa a etanol. 2,3 La evolución de la cepa NRRL Y-7124 fue perseguido aquí ya que se ha documentado para tienen el mayor potencial de cepas de levaduras nativas para acumular etanol económicamente recuperables inferior o igual a 40 g / L con poco subproducto xilitol. 4,5,6 En los medios de comunicación óptima, S. cepa stipitis NRRL Y-7124 produce 70 g / L de etanol en 40 hr (1.75 g / L / hr) con un rendimiento de 0,41 ± 0,06 g / g en cultivos de alta densidad celular (células 6 g / L). 7,8 Resistencia a los inhibidores de la fermentación del etanol, furfural y HMF también se ha informado, 9 y S. stipitis ha sido clasificada entre las levaduras que fermentan la pentosa nativas más prometedoras disponibles para el etanol Productio escala comercialn a partir de lignocelulosa. 10 Nuestro objetivo era aplicar diversos hidrolizados lignocelulósicos undetoxified y presiones de selección etanol para forzar la evolución hacia una más sólida derivada de la cepa NRRL Y-7124 adecuado para aplicaciones industriales. La llave entre características mejoradas solicitados son más rápidas tasas de absorción de azúcar en hidrolizados de concentrados, reducida diauxy para la utilización de azúcar mezclado más eficiente y más altas tolerancias de etanol e inhibidores. La aplicación de S. stipitis de hidrolizados undetoxified fue un elemento clave de la investigación para eliminar el gasto operativo añadido asociado a los procesos de descontaminación de hidrolizados, tales como overliming.
Dos hidrolizados industrialmente prometedores se aplicaron para forzar la evolución:. Sacarificado enzima fibra de amoniaco expansión pretratados con hidrolizado de rastrojo de maíz (AFEX CSH) y diluir el licor Panicum virgatum hidrolizado ácido pretratados (PSGHL) 11,12 tecnología de pretratamiento AFEX está siendo desarrollado paraminimizar la producción de inhibidores de la fermentación, mientras que el pretratamiento con ácido diluido representa la actual tecnología de bajo coste más comúnmente practicado para exponer la biomasa celulósica para la sacarificación enzimática. PSGHL es separable de la celulosa restante después del tratamiento previo y es característicamente rico en xilosa a partir de la hemicelulosa hidrolizada, pero bajo en glucosa. AFEX CSH y composiciones PSGHL difieren entre sí en aspectos clave que fueron explotadas para gestionar el proceso de la evolución. AFEX CSH es más bajo en aldehídos de furano y los inhibidores de ácido acético, pero más alta en aminoácidos y fuentes de nitrógeno de amoníaco en comparación con PSGHL (Tabla 1). PSGHL presenta el reto adicional de xilosa ser el azúcar predominante disponible. Por lo tanto PSGHL es apropiada para enriquecer específicamente para la mejora de la utilización de xilosa en hidrolizados, una debilidad prevenir el uso comercial de la levadura disponibles. Incluso entre las levaduras de fermentación de pentosa nativas, la dependencia de la xilo azúcar subóptimaSE para apoyar el crecimiento celular y la reparación se hace aún más difícil en los hidrolizados debido a una variedad de razones:. deficiencias de nutrientes, inhibidores causan un daño generalizado a la celda integridad estructural, y la interrupción de metabolismo debido a los desequilibrios redox 9 suplementación con nitrógeno, especialmente en la forma de aminoácidos, pueden representar un coste operativo importante para las fermentaciones. El impacto de la suplementación de nitrógeno sobre el cribado del aislamiento y la clasificación fue explorada con hidrolizados de P. virgatum.
La mejora de los individuos se enriquecieron en una población evoluciona el uso de múltiples presiones de selección dependen de la diversidad genética natural de la S. la población y las mutaciones stipitis inducida por la exposición a dos diversos hidrolizados, etanol o radiación UV. Presiones de selección se aplicaron en paralelo y en serie para explorar el progreso evolución de S. stipitis hacia derivados deseados capaces de crecer y fermentar de manera eficiente en hidrolizados(Figura 1). El cultivo repetitivo de las poblaciones funcionales en hidrolizados cada vez más desafiantes se llevó a cabo en microplacas el empleo de una serie de dilución de cualquiera de glucano CSH AFEX 12% o más preparado PGSHL a 20% de carga de sólidos. La aplicación de un crecimiento de etanol-desafió en xilosa en cultivo continuo mejorado aún más CSH adaptada poblaciones AFEX mediante el enriquecimiento de fenotipos que demuestran menor susceptibilidad a etanol represión de la utilización de xilosa. Esta última característica ha demostrado recientemente problemática de la utilización de pentosa por la cepa NRRL Y-7124 después de la fermentación de la glucosa. 8 Enriquecimiento en PSGHL se exploró junto a ampliar la funcionalidad hidrolizado.
Derivados mejorados putativa de S. stipitis NRRL Y-7124 fueron aisladas de cada fase del proceso de evolución dirigida mediante el enriquecimiento en condiciones de estrés y una dilución en placas para recoger colonias de las poblaciones de mayor prevalencia. en relación adimensionalíndices de rendimiento (RPI) se utilizaron para clasificar las cepas basado en el rendimiento general, donde se evaluó el comportamiento cinético de los diferentes tipos de hidrolizados y suplementos de nutrientes aplicados. Aunque los éxitos de diversos procedimientos de adaptación para mejorar la funcionalidad de S. stipitis en hidrolizados lignocelulósicos se han documentado anteriormente, las cepas que demuestran la producción de etanol económico en hidrolizados undetoxified no se ha informado anteriormente. 13-17 Usando los procedimientos de evolución para ser visualizado en más detalle aquí, Slininger et al. 18 cepas que se mejoran significativamente durante desarrollaron la cepa parental NRRL y-7124 y son capaces de producir> 40 g / L de etanol en AFEX CSH y la enzima hidrolizado sacarificado Panicum virgatum (SGH) debidamente complementado con fuentes de nitrógeno. Estas nuevas cepas son de interés para el futuro desarrollo de la lignocelulosa a la industria del etanol y como sujetos de la genómica estudios adicionales edificioen los de la cepa previamente secuenciados NRRL Y-11545. 19 Un estudio de la genómica de los mejores cepas producidas durante las diversas fases de la evolución esquematiza en la figura 1 sería dilucidar la historia de los cambios genéticos que ocurrieron durante el desarrollo como un preludio a seguir investigando la mejora de cepas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Varias medidas fueron cruciales para el éxito del proceso de la evolución. En primer lugar, es la clave para elegir las presiones de selección apropiados para conducir la evolución de la población hacia los fenotipos deseados que se necesitan para la aplicación exitosa. Los siguientes tensiones selectivos fueron elegidos para S. stipitis desarrollo y aplicado en los momentos apropiados para guiar enriquecimiento para los fenotipos deseados: el aumento de puntos fuertes de 12% glucano AFEX CSH (que fuerza …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to express our sincere appreciation to Drs. Kenneth Vogel, Robert Mitchell and Gautam Sarath, Grain, Forage, and Bioenergy Research Unit, Agricultural Research Service, Lincoln, NE for their kind supply of switchgrass for this project. We also thank U.S. Department of Energy for funding to VB through the DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (GLBRC) Grant DE-FC02-07ER64494.
Materials
| Cellic Ctec, Contains Xylanase (endo-1,4-) | Novozymes | No product number | www.novozymes.com, 1-919-494-3000 |
| Cellic Htec, Contains Cellulase and Xyalanase | Novozymes | No product number | www.novozymes.com, 1-919-494-3000 |
| Toasted Nutrisoy Flour | Archer Daniels Midland Co. (ADM) | 63160 | ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL 1800-37-5843 |
| Pluronic F-68 (Surfactant) | Sigma-Aldrich | P1300 | Sigma-Aldrich |
| Difco Vitamin Assay Casamino Acids | Becton Dickinson and Company | 228830 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| D,L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T3300 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, Sigma-Aldrich |
| Bacto Agar | Becton Dickinson and Company | 214010 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Bacto Malt Extract | Becton Dickinson and Company | 218630 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Bacto Yeast Extract | Becton Dickinson and Company | 212750 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Peptone Type IV from soybean | Fluka | P0521-500g | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Adenine, > 99% powder | Sigma-Aldrich | A8626 | CAS 73-24-5, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Cytosine, > 99% | Sigma-Aldrich | C3506 | CAS 71-30-7, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Guanine, SigmaUltra | Sigma-Aldrich | G6779 | CAS 73-40-5, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Thymine, 99% | Sigma-Aldrich | T0376 | CAS 65-71-4, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Uracil, 99% | Sigma-Aldrich | U0750 | CAS 66-22-8, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous, Certified ACS | Fisher Chemical | D16-500 | CAS 50-99-7, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich |
| D-Xylose, assay > 99% | Sigma-Aldrich | X1500 | CAS 58-86-6, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich |
| 96-well, flat bottom plates | Becton Dickinson Falcon | 351172 | multiple suppliers: e.g. Thermo-Fisher, VWR, Daigger |
| Wypall L40 Wiper | Kimberly-Clark | towel in microplate boxes to absorb water for humidification; multiple suppliers: e.g. Thermo-Fisher, uline, Daigger | |
| Corning graduated pyrex flask, 125-mL, narrow opening (stopper #5) | Corning Life Science Glass | 4980-125 | multiple suppliers: e.g. Thermo-Fisher, VWR, Daigger |
| Innova 42R shaker/incubator, 2.5 cm (1") rotation | New Brunswick Scientific (1-800-631-5417) | M1335-0016 | multiple suppliers: e.g. Eppendorf, Thermo-Fisher. Other shaker/incubators with a 2.5 cm (1") throw could be used. |
| Duetz Cover clamp for 4 deepwell MTP plates | Applikon Biotechnology | Z365001700 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Duetz System sandwich cover for 96 deepwell plates | Applikon Biotechnology | Z365001296 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Duetz System silicone seal (0.8mm black low evap) for 96 deep well plate cover | Applikon Biotechnology | V0W1040027 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Blue microfiber layer for Duetz system sandwich cover | Applikon Biotechnology | V0W1040001 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| 96 well, 2 mL square well pyramid bottom plates, natural popypropylene | Applikon Biotechnology | ZC3DXP0240 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Bellco 32mm silicon sponge plug closures, pk of 25 for 125-mL flasks | Bellco | 1924-00032 | Thomas Scientific, their Catalog number is 1203K27 |
| Bellco Spinner Flask, 1968-Glass Dome, Sealable Flange Type, 100-mL working volume. This design no longer manufactured. | Bellco | 1968-00100 (original Cat. No.) | Jacketed vessels have lower inlet & upper outlet ports for temp. control with circulating water bath. Vessels are 75mm in outer diam and 200mm in height. There are four side ports at ~45o angles and one top port. Port openings appropriate size for size 0 neoprene stoppers (21-22mm inner diameters on ports). |
| Mathis Labomat IR Dryer Oven | MathisAg | Typ-Nbr BFA12 215307 | Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157 |
| Dual Channel Biochemistry Analyzer | YSI Life Sciences | 2900D-UP | www.ysi.com, robotic system for rapid sugars assay in 96-well microplate format |
| PowerWave XS Microplate Spectrophotometer | Bio-Tek Instruments, Inc | MQX200R | www.biotek.com |
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