Introduction
Proteinsyntese er en væsentlig og energisk kostbar proces i alle celler 1. Først og fremmest skal celler investere energi i produktionen af translationsmaskineriet, ribosomerne. For eksempel en deler sig aktivt gærcelle producerer så meget som 2.000 ribosomer per minut. En sådan produktion kræver op til 60% af den samlede transkriptionel aktivitet og op til 90% af den totale splejsning aktivitet af celle 2. Desuden er nødvendige energi til syntese af aminosyrer, aminoacyl-tRNA og peptidbindinger. I planter, tilsætning én aminosyre til en peptidkæde omkostninger fra 4,5 til 5,9 molekyler ATP 3. Derfor er det ikke overraskende, at oversættelsen af mRNA til protein er et stort site af regulering, især når det kommer til at håndtere skiftende miljøforhold.
Indledningen trin i oversættelse, der er foreningen af en mRNA med ribosomet, er det vigtigste mål for reguleringen afoversættelse 4. Som følge af reguleringen af oversættelse samt andre post-transkriptionelle regulatoriske trin, kan kun 40% af de variationer i koncentrationen protein forklares med mRNA overflod 5,6. Således studiet af totalt mRNA giver forholdsvis dårlig information om protein overflod. På den anden side, sammenslutningen af mRNA med ribosomer giver bedre indblik i protein overflod ved at give adgang til disse mRNA er involveret i oversættelsen. Aktivt oversatte mRNA'er er associeret med flere ribosomer i strukturer kaldet polysomer. Omvendt vil dårligt oversat mRNA være forbundet med kun én ribosom (monosome). Følgelig kan den translationelle status af et mRNA evalueres ved at overvåge dets association med ribosomer 7.
Denne protokol beskriver isoleringen af polysomer fra seks dage gamle Arabidopsis thaliana kimplanter, den efterfølgende isolering af RNA, og analysen af resultaterne. Polysomes og monosomer er adskilt gennem en sucrosemassefyldegradient. Gradienter opsamles i seks fraktioner. Nogle af de fraktioner samles til opnåelse tre godt adskilt fraktioner: polysomer, monosomer og den lette fraktion (herefter kaldet supernatant), som indeholder de frie 60S og 40S ribosomale subunits og mRNA'er, som ikke er forbundet med ribosomer. Global oversættelse aktivitet kan estimeres ved at frembringe en polysom / monosome forhold, som bestemmes ved integration af arealet under kurven, og ved at sammenligne polysomerne profiler. mRNA'er og proteiner ekstraheres derefter fra de forskellige bestanddele og anvendes til analyse af RT-PCR, QRT-PCR, Northern blot, microarray, western blot eller proteomics. Denne protokol er blevet valideret for andre planter og væv.
Det udstyr, der kræves for at udføre denne protokol er almindeligt forekommende i de fleste laboratorier: Der er ikke behov for en gradient maker. Frysning hvert lag, før du tilføjer den næste forhindres fra enhver blanding eller forstyrrelse af lagene. Nr rør piercer anvendes til gradient samling, som kan opnås ved nedsænkning af et glas kapillarrør i gradienten. Derfor er de kostbare ultracentrifugerør forbliver ubeskadigede og kan genanvendes mange gange. Kollektivt, det gør den nuværende protokol en nem og billig metode til polysom profilering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af 20 til 50% (vægt / volumen) saccharosegradienter
Bemærk: De gradienter er lavet af 4 lag af saccharose (50%, 35% og 2 lag 20%) i et 13,2 ml ultracentrifugerør. Det er vores erfaring, at hælde 20% saccharose i to separate lag i høj grad forbedrer kvaliteten af polysom præparater.
- Forbered stamopløsninger. Sørg for, at alle løsninger er RNAse og DNAse gratis.
- Forbered 10X Salt Solution: 400 mM Tris-HCl pH 8,4, 200 mM KCI og 100 mM MgCl2.
- Forbered 2 M saccharoseopløsning: I 200 ml opløses 137 g saccharose i 1X Salt Solution.
- Fortynd saccharoseopløsningen i Salt Solution, som beskrevet i tabel 1, til fremstilling af gradienter. De angivne mængder er i seks gradienter.
| Endelig saccharosekoncentrationen | saccharose 2M (ml) | Saltopløsning 1X (ml) | Final Vol. (ml) |
| 50% | 8.8 | 3.2 | 12 |
| 35% | 12.9 | 12.1 | 25 |
| 20% | 7.4 | 17.6 | 25 |
| 20% | 5.8 | 14.2 | 20 |
Tabel 1. Fortyndinger af rørsukkeropløsningen at forberede seks gradienter.
- Hæld lagene som pr tabel 2.
| saccharose lag | 50% | 35% | 20% | 20% |
| Vol. (Ml) | 1,85 | 3,65 | 3.65 | 1,35 |
Tabel 2. Volumen af saccharose opløsning per lag.
- Efter udhældning hvert lag, holde rørene i en -40 ° C eller -80 ° C fryser indtil fuldstændig frysning før tilsætning af næste saccharose lag. Frysning opnås sædvanligvis efter 2 timer ved -40 ° C, men venter på omkring 6 timer før hælde det næste lag anbefales. De sidste 20% lag kan fryses eller tilsættes frisk på dagen for forsøget.
Bemærk: Frysning hvert lag, før du tilføjer den næste forhindrer enhver sammenblanding eller forstyrrelse af lagene. Gradienter kan holdes i en -40 ° C eller -80 ° C fryser i mindst seks måneder. - Hvis det ikke allerede er sket, tilføje de sidste 20% lag til gradienterne på dagen for forsøget. Derefter lod gradienterne tø ud i et kølerum eller et køleskab.
2. Fremstilling af cytosoliske ekstrakter
Bemærk: Vi Anbeende ved hjælp af to gradienter pr biologisk prøve. 300 mg er den optimale mængde af plantemateriale til fremstilling af to gradienter, når der arbejdes med 6 days old Arabidopsis thaliana planter. Når man arbejder med mindre translationelt aktive væv, kan mængden af plantemateriale øges op til 600 mg.
- Harvest seks dage gamle kimplanter dyrket på ½ Murashige og Skoog 8 medium suppleret med 1% saccharose eller tilsvarende medier ved quick-frysning i flydende nitrogen
- Grind plantemateriale i en forafkølet morter og støder med flydende nitrogen.
- Afvej 300 mg pulveriseret materiale i en forafkølet vejning skålen. Udfør dette trin hurtigt for at undgå optøning af prøven.
Bemærk: Hold frosne prøver for ikke mere end en uge i en -80 ° C fryser. - Tilsættes 2,4 ml forkølede polysom puffer (Salt Solution 4X, 5,26 mM EGTA, 0,5% (v / v) octylphenoxy poly (ethylenoxy) ethanol, forgrenede, 50 μg.ml -1 cycloheximid, 50 μg.ml 1chloramphenicol) og homogeniseres ved at blande med pipettespidsen. Overfør i to 1,5 ml rør. Arbejde hurtigt for at forhindre, at prøver fra opvarmning.
- Centrifuger ved 16.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C i en mikrocentrifuge for at pelletere debris.
Bemærk: For at undgå RNA-nedbrydning, altid holde prøverne ved 4 ° C, brug RNase / DNase gratis løsninger og arbejde i RNase / DNase frie forhold. Heparin kan sættes til polysom buffer, til en slutkoncentration på 300 μg.ml -1, for at øge RNA-beskyttelse. Men da heparin kan forstyrre nedstrøms analyse, vil det have, skal fjernes under RNA udfældningstrin ved at udføre lithiumchlorid udfældning i stedet for ethanoludfældning (note 4.7).
3. Polysomprofiler profilering
- pipettere forsigtigt supernatanten uden at forstyrre bundfaldet. Hvis plante- fragmenter er blevet pipetteret, gentag trin 2.5. Indlæse supernatanten på toppen af gradienten ved forsigtigt pipetting på sidevæggen af røret i en konstant strøm. Brug en gradient for hver 1,5 ml rør.
- Overførsel til forafkølet spande og centrifuger ved 175.000 xg i 2 timer 45 minutter ved 4 ° C, i en ultracentrifuge (fx 32.000 rpm ved anvendelse af en SW41 rotor).
- Opstil gradient samling som beskrevet i figur 1. UV cuvette har en 1 mm banelængde.
Figur 1. Gradient indsamlingssystem. UV kuvette er forbundet ved polyvinylchlorid rør til et glas kapillarrør, der stiger ned til bunden af gradienten. Gradienten skrider frem gennem systemet takket være en peristaltisk pumpe. OD 260 løbende læse og 2 ml fraktioner opsamles. Klik her for at se en større udgave afdette tal.
- Juster fraktionsopsamleren til stuetemperatur, og indstille karrusellen med en hastighed, der vil tillade indsamling af 2 ml fraktioner. Brug opsamlingsrør forafkølet.
- Opsaml fraktionerne fra bund til top under anvendelse af et glas kapillarrør forbundet ved polyvinylchlorid rør til gradient indsamlingssystem den. Bruge en plastic paraffin film til at sikre forbindelsen mellem polyvinylchlorid slanger og glasset kapillarrør.
- Læs absorbansen ved 260 nm fra bunden til toppen af gradienten. Når hele gradient opsamles, placere indsamling rør på is de før RNA ekstraktion.
4. RNA-ekstraktion
- Pool fraktionerne opsamlet fra to forløb, i 50 ml capped centrifugerør, som følger:
Polysomer: fraktionerne 1 til 3 (12 ml)
Monosomer: fraktion 4 (4 ml)
Supernatant: fraktioner 5 og 6 (8 ml) - Til hver fraktion, tilsættes 1 vol. 8M guanidinhydrochlorid,50 ug acryl bærer og 1,5 vol. isopropanol.
Bemærk: Akryl luftfartsselskab er lineær acrylamid, der anvendes som medudfælder at forbedre inddrivelsen af nukleinsyrer under alkohol nedbør. - Bland ved at vende rørene og udfælde O / N ved -20 ° C.
- Centrifuger ved 175.000 xg i 1 time ved 4 ° C, i en ultracentrifuge (32.000 rpm i en SW32 rotor). Hvis udfældningen trin udføres i et rør, som ikke er forenelig med ultracentrifugering, overførsel til et egnet rør.
- Supernatanten kasseres og pellet opløses i 200 pi RNAse-fri TE-buffer (10 mM Tris-HCI pH 7,5 mm - 1 mm EDTA). Overførsel til en frisk 1,5 ml rør.
- Uddrag RNA ved tilsætning af 1 vol. vandmættet phenol (pH 6,6) og 1 vol. chloroform: isoamylalkohol (24: 1). Bland kraftigt. Centrifuger ved 15.000 xg i 20 min ved 4 ° C. Overfør den vandige fase til et nyt 1,5 ml rør.
Bemærk: Syre phenol (pH 4,5) kan anvendes for at minimere DNA-kontaminering. - Udfælde RNA ved tilsætning 1/10 vol. 3 M natriumacetat og 3 vol. 100% ethanol. Tillad udfældning ved -80 ° C i 20 minutter eller O / N ved -20 ° C. Centrifuger ved 15.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
Bemærk: Hvis du bruger heparin i polysom buffer (note 2.5), udføre en lithiumchlorid (LiCl) udfældning i stedet for ethanol nedbør til korrekt fjerne ethvert spor af heparin, som kunne forstyrre nedstrøms analyse 9. Efter ekstraktion tilføje LiCI til en slutkoncentration på 2,5 M. Tillad udfældning i 30 minutter ved -20 ° C eller O / N ved 4 ° C. Centrifuger ved 15.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C. - Vask pillen med 500 pi 75% ethanol. Lufttørre pelleten og opløses i 30 pi TE-buffer. Vurdere RNA kvalitet ved elektroforese på en RNAse free 1,2% agarosegel (100V, 15 min) eller ved kapillær elektroforese metoder.
5. Data Analysis
- Eksport rå data til en grafisk og dataanalyse software.
Note: Som vist i figur 2A og B, de rå profiler giver kvalitativ information: antallet af polysom toppe, som kan ses, højden af toppen monosome, og tilstedeværelsen af en skulder, der svarer til de frie ribosom-underenheder. - Flet profiler til at tillade sammenligning af profilerne mellem prøverne. Brug skærmlæseren værktøj til at bestemme X-værdien af monosome top for hver prøve, og juster monosome toppe ved at fjerne ekstra datapunkter i begyndelsen af kurverne. Identificer det laveste punkt på kurven og bestemme dens Y-værdi (ved hjælp af skærmlæser værktøj). Indstil det laveste punkt Y-værdi til 0 ved hjælp af "sæt kolonner værdi" funktion.
- Bestem polysomer / monosomer forholdet ved at integrere arealet under kurven fra rå profiler (figur 3C). Brug data selector værktøj til at definere grænsen til området, der skal integreres. Brug derefter integrere funktionen (Analyse-matematik).
- Normalisérkurverne til toppen monosome ved at dividere alle datapunkter i en kurve ved Y-værdien af topmødet af toppen monosome (bestemt ved brug af skærmlæser værktøj). Vælg den kolonne, derefter under Analyse-matematik, vælg Normalize og vælge de "divideret med en bestemt værdi" metoder. Dette trin tillader sammenligning af relative polysomer (figur 3D).
Figur 2. Repræsentative Polysomprofiler. Arabidopsis thaliana vildtype (wt, økotype Col-0) og mutant kimplanter blev dyrket i seks dage på ½ Murashige og Skoog medium under lange dages lysperioder (16 timers lys, 8 timers mørke). A: rå Polysomprofiler fra wt frøplanter. B: rå Polysomprofiler fra mutant frøplanter. C: Bestemmelse af procentdelen af polysomer og monosomer ved integration af arealet under kurven D: Polysomprofiler profiles normaliseret til toppen monosome. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I litteraturen er Polysomprofiler ofte vist fra den lette fraktion til den tunge fraktion som et resultat af den måde gradienterne opsamles, dvs. fra toppen til bunden. Da gradienterne i protokollen beskrevet her opsamles fra bunden til toppen, profilerne vi viser starte med den tunge fraktion (polysomerne) og gå til den lette fraktion (fri ribosom-underenheder og RNA'er) (figur 2A). Vi derefter indsamle hver gradient i seks 2 ml fraktioner, men mindre fraktioner kan indsamles, hvis en mere detaljeret analyse af polysom indhold skal udføres.
Sammenfletning og normalisere kurverne til monosome top (figur 2D) muliggør sammenligning af profiler fra forskellige linjer eller vækstbetingelser. Dette giver information om den relative mængde af polysomer uafhængigt af niveauet for indvielse. En anden måde at ennalyze profilerne er at beregne arealet under kurven, således kan man bestemme den relative mængde af mRNA associeret med enten monosomer eller polysomerne (figur 2C). Dette forhold er specifik for en plante og vækstbetingelser. Dog kan denne fremgangsmåde ikke være relevant i tilfælde af dårligt translationelt aktive væv.
Vi har brugt denne metode til A. thaliana hele planter, unge og gamle rosetter samt for N. benthamiana (figur 3C), S. lycopersicum (figur 3E) og O. sativa blade (figur 3D). Profilen form afhænger af vækstbetingelserne, plante alder og analyserede væv. Her brugte vi A. thaliana seks dage gamle kimplanter. På dette stadium, den translationelle aktivitet er høj, og profilen viser velformede toppe (figur 2A og B). Dette er også tilfældetnår A. thaliana blomster indgår (figur 3A). Ved brug 4 uger gamle A. thaliana rosetter (figur 3B), prøverne oftest indeholder fuldt udviklet voksen efterlader hvor celler ikke deler. Derfor er den samlede polysomer og monosomer er lavere. Profilen viser færre, men stadig godt formede polysom toppe. Desuden peak monosome, skulderen viser den store mængde af frie 60S ribosomale subunits. Med andre slags planter eller væv, kan polysom toppe være knap synlige. Dette er tilfældet, når der anvendes 30 dage gamle O. sativa blade (figur 3D). Selv når mængden af mRNA'er er involveret i oversættelse er meget lav (ingen polysom peak kan ses på profilen), tilstedeværelsen af peak monosome angiver, at fraktioneringen var korrekt udført, og at mRNA'er kan yderligere ekstraheret fra den fraktion til yderligere analyse . Kvaliteten af ekstraheret RNA kvalitet vurderes ved agarosegelelektroforese (
Figur 3. Polysomprofiler fra forskellige plantemateriale og arter. (A) Arabidopsis thaliana blomster (300 mg), (B) Arabidopsis thaliana 4 uger gamle rosetter (600 mg), (C) Nicotiana benthamiana (unge blade af 40 dage gamle kort dag-grown plants - 300 mg), (D) Oryza sativa ( blade af 30 dage gamle planter - 300 mg), (E) Solanum lycopersicum (unge blade af 35 dage gamle kort dag-grown plants - 300 mg). De monosome toppe er angivet med pile.Iles / ftp_upload / 54.231 / 54231fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
. Figur 4. Vurdering af RNA kvalitet RNA (500 ng udvundet skud af 6 dage gamle Arabidopsis thaliana kimplanter) fra de angivne fraktioner blev lastet på en 1,2% agarosegel og separeret ved elektroforese (100V - 15 min). Cytosoliske (25S og 18S) rRNA er angivet med pile og chloroplast (23S og 16S) rRNA ved et beslag. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af den franske National Research Agency (ANR-14-CE02-0010). Vi takker Dr. Benjamin Field og Dr. Elodie Lanet for kritisk læsning af manuskriptet. Vi takker Mr. Michel Terese for hans hjælp med video redigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer - 13.2 ml | Beckman Coulter | 331372 | |
| Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer - 38.5 ml | Beckman Coulter | 326823 | |
| Glass capillary tube | Drummond Scientific | 1-000-1000 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima series | |
| Ultracentrifuge Rotor SW41 | Beckman Coulter | 331362 | |
| Ultracentrifuge Rotor SW32 | Beckman Coulter | 369650 | |
| Peristaltic pump | Any | ||
| Tygon R3607 polyvinyl chloride tubing | Fisher Scientific | 070534-22 | Polyvinyl chloride tubing, 2.29 mm |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-Rad | 731-8120 | |
| UV cuvette | Hellma | 170.700-QS | Quartz flow-through cuvette |
| UV Spectrophotometer | Varian | Cary50 | Read every 0.0125 sec |
| All chemicals | Any | Use only Molecular Biology Grade | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| Rnase-Free water | Any | ||
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 10083251 | |
| Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol, branched (Nonidet P40) | Euromedex | UN3500 | |
| Linear acrylamide (acryl carrier) | ThermoFischer scientific | AM9520 | RNA precipitation carrier |
| OriginPro 8 | OriginLab | Analysis software |
References
- Nelson, C. J., Millar, A. H.
- Warner, J. R. The economics of ribosome biosynthesis in yeast. Trends Biochem Sci. 24 (11), 437-440 (1999).
- Amthor, J. S. The McCree-de Wit-Penning de Vries-Thornley Respiration Paradigms: 30 Years Later. Ann Bot. 86 (1), 1-20 (2000).
- Preiss, T., W Hentze, M. Starting the protein synthesis machine: eukaryotic translation initiation. BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 25 (12), 1201-1211 (2003).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2013).
- Baerenfaller, K., et al. Genome-scale proteomics reveals Arabidopsis thaliana gene models and proteome dynamics. Science. 320 (5878), 938-941 (2008).
- Zanetti, E., Chang, I., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. Immunopurification of Polyribosomal Complexes of Arabidopsis for Global Analysis of Gene Expression. Plant physiol. 138 (2), 624-635 (2005).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. A. Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments. RNA. 13 (3), 414-421 (2007).
- Arabidopsis protocols. Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J. , Methods in molecular biology; 323. Clifton, N.J. (2006).
- Piques, M., et al. Ribosome and transcript copy numbers, polysome occupancy and enzyme dynamics in Arabidopsis. Mol syst biol. 5 (314), 314 (2009).
- Morita, M., Alain, T., Topisirovic, I., Sonenberg, N.
- Yángüez, E., Castro-Sanz, A. B., Fernández-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress. PloS One. 8 (8), (2013).
- Sormani, R., et al. Sublethal cadmium intoxication in Arabidopsis thaliana impacts translation at multiple levels. Cell Physiol. 52 (2), 436-447 (2011).
- Lanet, E., et al. Biochemical evidence for translational repression by Arabidopsis microRNAs. Plant cell. 21 (6), 1762-1768 (2009).
- Jabnoune, M., Secco, D., Lecampion, C., Robaglia, C., Shu, Q., Poirier, Y. A Rice cis-Natural Antisense RNA Acts as a Translational Enhancer for Its Cognate mRNA and Contributes to Phosphate Homeostasis and Plant Fitness. Plant cell. 25 (10), 4166-4182 (2013).
- Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. Methods Enzymol. 470 (10), Elsevier Inc. (2010).
- Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis. PNAS. 111 (1), 203-212 (2013).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
