Introduction
Eiwitsynthese is een essentieel en energetisch kostbaar proces in alle cellen 1. Allereerst moeten cellen energie in de productie van de translatie machinerie, de ribosomen. Bijvoorbeeld een actief delende gistcel produceert zoveel 2000 ribosomen per minuut. Deze productie is maximaal 60% van de totale transcriptionele activiteit en tot 90% van de totale splicing activiteit van de cel 2. Bovendien wordt energie gebruikt voor de synthese van aminozuren, aminoacyl-tRNA en peptidebindingen. In planten, het toevoegen van een aminozuur aan een peptideketen kosten 4,5-5,9 moleculen ATP 3. Daarom is het niet verwonderlijk dat de vertaling van mRNA tot eiwit is een belangrijke plaats van de regelgeving, met name als het gaat om het omgaan met veranderende omgevingsfactoren.
De initiatie stap van de vertaling, dat is de vereniging van een mRNA met het ribosoom, is het belangrijkste doelwit van de regulering van devertaling 4. Als gevolg van de regulering van translatie en andere post-transcriptionele regulerende stappen, kan slechts 40% van de variaties in eiwitconcentratie te verklaren door mRNA overvloed 5,6. Zo is de studie van het totale mRNA geeft relatief slechte informatie over eiwit overvloed. Aan de andere kant, de vereniging van mRNA met ribosomen geeft een beter inzicht in eiwit overvloed door het geven van toegang tot die mRNA's die betrokken zijn bij de vertaling. Actief vertaald mRNA's geassocieerd met een aantal ribosomen structuren genaamd polysomen. Omgekeerd zal slecht vertaald mRNA's geassocieerd worden met slechts één ribosoom (monosome). Bijgevolg kan de translationele status van mRNA geëvalueerd door monitoring de associatie met ribosomen 7.
Dit protocol beschrijft de isolatie van polysomen zes dagen oud Arabidopsis thaliana zaailingen, de daaropvolgende isolatie van RNA en de analyse van de resultaten. polysomes en monosomes worden gescheiden door een sucrose dichtheidsgradiënt. Verlopen worden verzameld in zes fracties. Enkele fracties worden samengevoegd tot drie goed gescheiden fracties te verkrijgen: polysomen, monosomes en de lichte fractie (hierna supernatant), waarin het vrije 60S en 40S ribosomale subeenheden en mRNA's die niet zijn gekoppeld aan ribosomen bevat. Global vertaling activiteit kan worden bepaald door het genereren van een polysoom / monosome verhouding die wordt bepaald door integratie van het gebied onder de curve, en door vergelijking van de polysomen profielen. mRNA's en eiwitten worden geëxtraheerd uit de verschillende fracties en gebruikt voor analyse door RT-PCR, qRT-PCR, Northern blot, microarray, western blot of proteomics. Dit protocol is gevalideerd voor andere planten en weefsels.
De voor dit protocol voeren materiaal worden aangetroffen in de meeste laboratoria: Er is geen behoefte aan een gradiënt maker. Bevriezing elke laag voor het toevoegen van het volgende voorkomens uit een mix of verstoring van de lagen. Nr buis piercer wordt gebruikt gradiënt collectie die kan worden bereikt door onderdompeling van een glazen capillaire buis in het verloop. Daarom is de kostbare ultracentrifugebuizen onbeschadigd blijven en kunnen worden hergebruikt vaak. Collectief, dit maakt het huidige protocol een gemakkelijke en goedkope methode voor het polysoomdisplays profilering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van 20 tot 50% (w / v) sucrose gradiënten
Opmerking: De gradiënten bestaan uit 4 lagen sucrose (50%, 35% en 2 lagen 20%) in 13,2 ml ultracentrifuge buis. In onze ervaring, het gieten van de 20% sucrose in twee afzonderlijke lagen aanzienlijk verbetert de kwaliteit van polysoomdisplays preparaten.
- Bereid de voorraad oplossingen. Zorg ervoor dat alle oplossingen zijn RNAse en DNAse gratis.
- Bereid 10X zoutoplossing: 400 mM Tris-HCl pH 8,4, 200 mM KCl en 100 mM MgCl2.
- Bereid 2 M Sucrose Oplossing: Voor 200 ml, los 137 g sucrose in 1X Salt Solution.
- Verdun de sucroseoplossing in zoutoplossing, zoals beschreven in Tabel 1, de gradiënten te bereiden. De volumes zijn gegeven voor zes hellingen.
| Final sucrose concentratie | sucrose 2M (ml) | Zoutoplossing 1X (ml) | Def Vol. (ml) |
| 50% | 8.8 | 3.2 | 12 |
| 35% | 12.9 | 12.1 | 25 |
| 20% | 7.4 | 17.6 | 25 |
| 20% | 5.8 | 14.2 | 20 |
Tabel 1. verdunningen van de sucrose-oplossing tot zes hellingen te bereiden.
- Giet de lagen volgens tabel 2.
| sucrose layer | 50% | 35% | 20% | 20% |
| Vol. (Ml) | 1.85 | 3.65 | 3.65 | 1.35 |
Tabel 2. Volume van sucrose-oplossing per laag.
- Na het gieten elke laag, houdt de buizen in een -40 ° C of -80 ° C vriezer tot volledige bevriezing voor het toevoegen van de volgende laag sucrose. Bevriezen wordt gewoonlijk bereikt na 2 uur bij -40 ° C, maar wachten ongeveer 6 uur voor het gieten van de volgende laag wordt aanbevolen. De laatste 20% laag kan worden bevroren of vers toegevoegd op de dag van het experiment.
Opmerking: Het bevriezen elke laag voor het toevoegen van het volgende voorkomt vermenging of verstoring van de lagen. Gradiënten kunnen in een -40 ° C bewaard of -80 ° C vriezer gedurende ten minste zes maanden. - Als het nog niet is gedaan, voeg de laatste 20% laag om de hellingen op de dag van het experiment. Vervolgens laat de gradiënten ontdooien in een koude kamer of een koelkast.
2. Bereiding van cytosolextracten
Let op: We recommeindigen met twee hellingen per biologisch monster. 300 mg is de optimale hoeveelheid plantaardig materiaal tot twee hellingen te bereiden bij het werken met 6 dagen oud Arabidopsis thaliana zaailingen. Bij het werken met minder translationeel actieve weefsels, kan de hoeveelheid plantenmateriaal worden verhoogd tot 600 mg.
- Harvest zes dagen oude zaailingen gegroeid op ½ Murashige en Skoog 8 medium aangevuld met 1% sucrose of gelijkwaardige media door diepvriezen in vloeibare stikstof
- Grind plantmateriaal in een voorgekoeld mortier en een stamper met vloeibare stikstof.
- Weeg 300 mg poedervormig materiaal in een voorgekoeld weegschaal. Voer deze stap snel ontdooien van het monster te voorkomen.
Opmerking: Bewaar de ingevroren monsters niet meer dan een week in een -80 ° C vriezer. - Voeg 2,4 ml voorgekoelde polysoomdisplays buffer (Salt Solution 4X, 5,26 mM EGTA, 0,5% (v / v) octylfenoxy poly (ethyleenoxy) ethanol, vertakte, 50 μg.ml -1 cycloheximide, 50 μg.ml 1chlooramfenicol) en homogeniseren door mengen met de pipet tip. Over in twee 1,5 ml buizen. Werk snel te voorkomen dat de monsters opwarmt.
- Centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C in een microcentrifuge om vuil te pelleteren.
Opmerking: Om RNA degradatie te voorkomen, altijd de monsters bij 4 ° C, gebruik RNase / DNase gratis oplossingen en werken in RNase / DNase vrije omstandigheden. Heparine kan worden toegevoegd aan de polysoomdisplays buffer tot een eindconcentratie van 300 μg.ml -1, RNA beter te beschermen. Aangezien heparine kunnen interfereren met benedenstrooms analyse zal tijdens de RNA neerslaan door het uitvoeren lithiumchloride precipitatie plaats van ethanolprecipitatie (zie toelichting 4.7) te verwijderen.
3. polysoom Profiling
- Voorzichtig pipet de bovenstaande vloeistof zonder de pellet te verstoren. Als plantendeeltjes zijn gepipetteerd, herhaalt u stap 2.5. Plaats het supernatant bovenop de gradiënt door zachtjes pipetting op de zijwand van de buis in een constante stroom. Gebruik een helling voor elke 1,5 ml buis.
- Transfer emmers en centrifugeer voorgekoeld bij 175.000 xg gedurende 2 u 45 min bij 4 ° C, in een ultracentrifuge (bijvoorbeeld 32.000 rpm bij gebruik van een SW41 rotor).
- Stel het verloop verzamelen zoals beschreven in figuur 1. De UV cuvette heeft een 1 mm weglengte.
Figuur 1. Gradient opvangsysteem. De UV cuvette is via polyvinylchloride buis een glazen capillaire buis die afdaalt naar de bodem van de gradiënt. De gradiënt doorloopt het systeem door een peristaltische pomp. OD 260 wordt continu gelezen en 2 ml fracties worden verzameld. Klik hier om een grotere versie te bekijkendit figuur.
- Pas de fractie collector naar RT, en zet de carrousel op een snelheid die het verzamelen van 2 ml fracties zal toestaan. Gebruik pre-gekoelde collectie buizen.
- Verzamelen van de fracties van onder naar boven met een glazen capillaire buis verbonden met polyvinylchloride slang aan het verloop opvangsysteem. Gebruik een kunststof paraffine film de verbinding tussen de polyvinylchloride buis en de glazen capillaire fixeren.
- Lees absorptie bij 260 nm van de bodem naar de top van de gradiënt. Wanneer het gehele verloop wordt verzameld, plaatst de collectie buizen op ijs voor RNA-extractie.
4. RNA-extractie
- Verzamel de verzamelde fracties uit twee hellingen, in 50 ml centrifugebuizen afgedekt, als volgt:
Polysomen: fracties 1-3 (12 ml)
Monosomes: deel 4 (4 ml)
Supernatant: fracties 5 en 6 (8 ml) - Aan elke fractie, voeg 1 vol. 8M guanidine hydrochloride,50 ug acryl drager en 1,5 vol. isopropanol.
Opmerking: Acryl drager lineair acrylamide, gebruikt als coprecipiteermiddel de terugwinning van nucleïnezuren in alcoholprecipitatie verbeteren. - Meng door de buizen en precipiteren O / N bij -20 ° C.
- Centrifugeer bij 175.000 xg gedurende 1 uur bij 4 ° C, in een ultracentrifuge (32.000 rpm in een SW32 rotor). Als de precipitatie wordt uitgevoerd in een buis die niet compatibel is met ultracentrifugatie, In een geschikte buis.
- Verwijder het supernatant en los de pellet in 200 ul RNAse-vrij TE-buffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5-1 mM EDTA). Over te dragen aan een nieuwe 1,5 ml buis.
- Extract RNA door toevoeging van 1 vol. water verzadigd fenol (pH 6,6) en 1 vol. chloroform: isoamylalcohol (24: 1). Meng krachtig. Centrifugeer bij 15.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Breng de waterige fase naar een nieuwe 1,5 ml buis.
Noot: Zuur fenol (pH 4,5) kan worden gebruikt om DNA besmetting te minimaliseren. - RNA te precipiteren door toevoeging van 1/10 volume. 3 M natriumacetaat en 3 vol. 100% ethanol. Laten neerslaan bij -80 ° C gedurende 20 min of O / N bij -20 ° C. Centrifugeer bij 15.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
Opmerking: Bij gebruik van heparine in de polysoomdisplays buffer (zie toelichting 2.5), het uitvoeren van een lithium chloride (LiCl) neerslaan in plaats van ethanolprecipitatie om enig spoor van heparine die kunnen interfereren met downstream-analyse 9 naar behoren te verwijderen. Na extractie voeg LiCl tot een eindconcentratie van 2,5 M. toegestaan precipitatie gedurende 30 minuten bij -20 ° C of O / N bij 4 ° C. Centrifugeer bij 15.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. - Was de pellet met 500 pl 75% ethanol. Lucht droog de pellet en los op in 30 ui TE-buffer. Beoordelen RNA kwaliteit die door elektroforese op een vrije RNAse 1,2% agarosegel (100V, 15 min) of door capillaire elektroforese werkwijzen.
5. Data Analysis
- Export ruwe data naar een grafische en data-analyse software.
Notitie: Zoals getoond in figuur 2A en B, de ruwe profielen geven kwalitatieve informatie: het aantal polysoomdisplays pieken die te zien is de hoogte van de piek monosome, en de aanwezigheid van een schouder overeenkomt met de vrije ribosoom subeenheden. - Samenvoegen profielen aan vergelijking van de profielen tussen monsters mogelijk. Gebruik het scherm lezer tool om de X-waarde van de monosome piek voor elk monster te bepalen en lijn de monosome pieken door het verwijderen van extra meetpunten aan het begin van de bochten. Identificeer het laagste punt van de curve en zijn bepalend voor de Y-waarde (met behulp van de lezer gereedschap scherm). Stel het laagste punt Y waarde op 0 met behulp van de functie "set kolommen value".
- Bepaal de polysomen / monosomes verhouding door de integratie van het gebied onder de curve van de ruwe profielen (figuur 3C). Gebruik de gegevensselector gereedschap definiëren de grens van het gebied te integreren. Maak dan gebruik van de integratie-functie (Analysis-Wiskunde).
- normaliserende bocht naar monosome piek door het verdelen van alle datapunten van een kromme door de Y-waarde van de top van de monosome piek (bepaald met behulp van de lezer gereedschap scherm). Selecteer de kolom, vervolgens onder Analyse-Wiskunde, selecteert normaliseren en kiezen voor de "gedeeld door een bepaalde waarde" methoden. Deze stap maakt vergelijking van het relatieve niveau van polysomen (Figuur 3D).
Figuur 2. Vertegenwoordiger polysoomdisplays profielen. Arabidopsis thaliana wild-type (wt, ecotype Col-0) en mutant zaailingen werden gekweekt voor zes dagen op ½ Murashige en Skoog medium onder lange dag fotoperiodiciteit (16 uur licht, 8 uur donker). A: raw polysoomdisplays profielen van wt zaailingen. B: raw polysoomdisplays profielen van mutant zaailingen. C: Bepaling van het percentage polysomen en monosomes door integratie van het gebied onder de kromme D: polysoomdisplays profiles genormaliseerd naar de monosome piek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In de literatuur worden polysoomdisplay profielen vaak blijkt uit de lichte fractie met de zware fractie als gevolg van de manier waarop de gradiënten worden verzameld, dus van boven naar beneden. Omdat in het hier beschreven protocol het verlopen worden verzameld van de bodem naar de top, de profielen tonen we beginnen met de zware fractie (de polysomen) en naar de lichte fractie (vrij ribosoom subeenheden en RNA) (Figuur 2A). Vervolgens hebben we het verzamelen van elke helling in zes 2 ml fracties, maar kleinere fracties kunnen worden verzameld als een meer gedetailleerde analyse van polysoomdisplays gehalte dient te worden uitgevoerd.
Het samenvoegen en het normaliseren van de bocht naar monosome piek (figuur 2D) kan de vergelijking van de profielen van verschillende lijnen of groeiomstandigheden. Deze geeft informatie over de relatieve hoeveelheid polysomen onafhankelijk van de mate van opening. Een andere manier om eenAnalyseer de profielen is het oppervlak onder de kromme te berekenen, dus kan men de relatieve hoeveelheden mRNA tezamen met de monosomes of polysomen (figuur 2C) te bepalen. Deze verhouding is specifiek voor een plant en groeiomstandigheden. Echter, deze benadering niet relevant in het geval van slecht translationeel actieve weefsels.
We hebben deze methode voor het A. gebruikt thaliana hele zaailingen, jong en oud rozetten, alsook voor N. benthamiana (Figuur 3C), S. lycopersicum (figuur 3E) en O. sativa bladeren (Figuur 3D). De profielvorm is afhankelijk van de groeiomstandigheden, plantleeftijd en de weefsels geanalyseerd. Hier gebruikten we A. thaliana zes dagen oude zaailingen. In deze fase, de translationele activiteit hoog, en het profiel toont mooi gevormde pieken (figuur 2A en B). Dit is ook het gevalwanneer A. thaliana bloemen worden gebruikt (Figuur 3A). Bij het gebruik van 4 weken oud A. thaliana rozetten (Figuur 3B), de monsters bevatten meestal volledig ontwikkelde volwassen verlaat waar de cellen niet verdelen. Vandaar dat het totale bedrag van polysomen en monosomes lager is. Het profiel toont minder, maar nog steeds goed gevormd polysoomdisplays pieken. Naast de monosome piek, de schouder toont de grote hoeveelheid vrij 60S ribosomale subeenheden. Met andere vorm van planten of weefsels, kan de polysoomdisplays pieken nauwelijks zichtbaar zijn. Dit is het geval wanneer 30 dagen oud O. sativa bladeren (Figuur 3D). Zelfs wanneer de hoeveelheid mRNA die deze vertaling zeer gering (geen polysoomdisplays piek te zien op het profiel), de aanwezigheid van de monosome piek geeft aan dat de fractionering behoren is uitgevoerd en dat mRNA kan verder worden geëxtraheerd uit de fractie voor verdere analyse . De kwaliteit van het geëxtraheerde RNA kwaliteit wordt bepaald door agarose gelelektroforese (
Figuur 3. polysoom profielen van verschillende plantmateriaal en soorten. (A) Arabidopsis thaliana bloemen (300 mg), (B) Arabidopsis thaliana 4 weken oud rozetten (600 mg), (C) Nicotiana benthamiana (jonge bladeren van 40 dagen oude korte dagen geteelde planten - 300mg), (D) Oryza sativa ( bladeren van 30 dagen oude planten - 300 mg), (E) Solanum lycopersicum (jonge bladeren van 35 dagen oud op korte dag geteelde planten - 300 mg). De monosome pieken zijn aangegeven met pijlen.iles / ftp_upload / 54231 / 54231fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
. Figuur 4. Beoordeling van RNA kwaliteit RNA (500 ng gewonnen uit scheuten van 6 dagen oude zaailingen van Arabidopsis thaliana) vanaf het aangegeven fracties werden geladen op een 1,2% agarosegel en door elektroforese (100V - 15 min). Cytosolische (25S en 18S) rRNA zijn aangegeven met pijlpunten en chloroplast (23S en 16S) rRNA door een beugel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Franse National Research Agency (ANR-14-CE02-0010). Wij danken Dr Benjamin Field en Dr. Elodie Lanet voor kritische lezing van het manuscript. We danken de heer Michel Terese voor zijn hulp met video editing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer - 13.2 ml | Beckman Coulter | 331372 | |
| Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer - 38.5 ml | Beckman Coulter | 326823 | |
| Glass capillary tube | Drummond Scientific | 1-000-1000 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima series | |
| Ultracentrifuge Rotor SW41 | Beckman Coulter | 331362 | |
| Ultracentrifuge Rotor SW32 | Beckman Coulter | 369650 | |
| Peristaltic pump | Any | ||
| Tygon R3607 polyvinyl chloride tubing | Fisher Scientific | 070534-22 | Polyvinyl chloride tubing, 2.29 mm |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-Rad | 731-8120 | |
| UV cuvette | Hellma | 170.700-QS | Quartz flow-through cuvette |
| UV Spectrophotometer | Varian | Cary50 | Read every 0.0125 sec |
| All chemicals | Any | Use only Molecular Biology Grade | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| Rnase-Free water | Any | ||
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 10083251 | |
| Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol, branched (Nonidet P40) | Euromedex | UN3500 | |
| Linear acrylamide (acryl carrier) | ThermoFischer scientific | AM9520 | RNA precipitation carrier |
| OriginPro 8 | OriginLab | Analysis software |
References
- Nelson, C. J., Millar, A. H.
- Warner, J. R. The economics of ribosome biosynthesis in yeast. Trends Biochem Sci. 24 (11), 437-440 (1999).
- Amthor, J. S. The McCree-de Wit-Penning de Vries-Thornley Respiration Paradigms: 30 Years Later. Ann Bot. 86 (1), 1-20 (2000).
- Preiss, T., W Hentze, M. Starting the protein synthesis machine: eukaryotic translation initiation. BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 25 (12), 1201-1211 (2003).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2013).
- Baerenfaller, K., et al. Genome-scale proteomics reveals Arabidopsis thaliana gene models and proteome dynamics. Science. 320 (5878), 938-941 (2008).
- Zanetti, E., Chang, I., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. Immunopurification of Polyribosomal Complexes of Arabidopsis for Global Analysis of Gene Expression. Plant physiol. 138 (2), 624-635 (2005).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. A. Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments. RNA. 13 (3), 414-421 (2007).
- Arabidopsis protocols. Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J. , Methods in molecular biology; 323. Clifton, N.J. (2006).
- Piques, M., et al. Ribosome and transcript copy numbers, polysome occupancy and enzyme dynamics in Arabidopsis. Mol syst biol. 5 (314), 314 (2009).
- Morita, M., Alain, T., Topisirovic, I., Sonenberg, N.
- Yángüez, E., Castro-Sanz, A. B., Fernández-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress. PloS One. 8 (8), (2013).
- Sormani, R., et al. Sublethal cadmium intoxication in Arabidopsis thaliana impacts translation at multiple levels. Cell Physiol. 52 (2), 436-447 (2011).
- Lanet, E., et al. Biochemical evidence for translational repression by Arabidopsis microRNAs. Plant cell. 21 (6), 1762-1768 (2009).
- Jabnoune, M., Secco, D., Lecampion, C., Robaglia, C., Shu, Q., Poirier, Y. A Rice cis-Natural Antisense RNA Acts as a Translational Enhancer for Its Cognate mRNA and Contributes to Phosphate Homeostasis and Plant Fitness. Plant cell. 25 (10), 4166-4182 (2013).
- Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. Methods Enzymol. 470 (10), Elsevier Inc. (2010).
- Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis. PNAS. 111 (1), 203-212 (2013).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
