Introduction
Die Proteinsynthese ist ein wesentlicher und energetisch kostspieliger Prozess in allen 1 - Zellen. Zuallererst Zellen müssen Energie in der Herstellung der Translationsmaschinerie, die Ribosomen investieren. Zum Beispiel erzeugt eine teilungsaktiven Hefezelle so viel wie 2000 Ribosomen pro Minute. Eine solche Produktion erfordert bis 60% der Gesamttranskriptionsaktivität und bis zu 90% der Gesamt Spleißen Aktivität der Zelle 2. Zusätzlich wird Energie für die Synthese von Aminosäuren, Aminoacyl-tRNA und Peptidbindungen erforderlich. In Pflanzen, das Hinzufügen einer Aminosäure einer Peptidkette Kosten 4,5-5,9 Moleküle ATP 3. Daher ist es nicht verwunderlich, dass die Translation von mRNA zu Protein ein wichtiger Ort der Regulierung, vor allem, wenn es mit wechselnden Umweltbedingungen fertig zu werden.
Die Einleitung Schritt der Übersetzung, dass die Assoziation einer mRNA mit dem Ribosom ist, ist das Hauptziel der RegulierungÜbersetzung 4. Als Folge der Regulation der Translation sowie andere post-transkriptionale regulatorische Schritte können nur 40% der Variationen in Proteinkonzentration von mRNA Menge 5,6 erläutert. So gibt die Studie der Gesamt-mRNA relativ schlechte Informationen über Protein Hülle und Fülle. Auf der anderen Seite gibt der Verband der mRNA mit Ribosomen besseren Einblick in die Proteinmenge durch den Zugang zu diesen in Translation beteiligt mRNAs zu geben. Aktiv werden übersetzt mRNAs mit mehreren Ribosomen in Strukturen genannt Polysomen assoziiert. Im Gegensatz dazu wird schlecht übersetzt mRNAs mit nur einem Ribosom (monosome) zugeordnet werden. Folglich kann die Translations Status einer mRNA durch Überwachung seiner Verbindung mit Ribosomen 7 ausgewertet werden.
Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Polysomen aus 6 Tage alten Arabidopsis thaliana Keimlinge, die anschließende Isolierung von RNA und die Analyse der Ergebnisse. Polysomes und monosomes werden durch einen Saccharose-Dichtegradienten getrennt. Gradienten werden in sechs Fraktionen gesammelt. Einige der Fraktionen werden vereinigt drei zu erhalten gut getrennten Fraktionen: Polysomen, monosomes und die Leichtfraktion (im Folgenden als Überstand), die enthält die freien 60S und 40S ribosomalen Untereinheiten und mRNAs, die nicht mit Ribosomen assoziiert. Globale Translationsaktivität kann durch Erzeugen eines Polysomen / monosome Verhältnis geschätzt werden, die durch Integration der Fläche unter der Kurve bestimmt wird, und durch die Polysomen Profilen verglichen wird. mRNAs und Proteine werden dann aus den verschiedenen Fraktionen und zur Analyse mittels RT-PCR, qRT-PCR, Northern Blot, Microarray, Western-Blot oder Proteomik extrahiert. Dieses Protokoll wurde für andere Pflanzen und Geweben validiert.
Das Gerät benötigt, um dieses Protokoll zu erfüllen sind häufig in den meisten Labors gefunden: Es besteht keine Notwendigkeit für einen Gradienten ausgestattet. Einfrieren jede Schicht bevor die nächste Zugabe verhinderns aus einem Mix oder Störung der Schichten. Kein Schlauch piercer für Gradienten Sammlung verwendet, die durch Eintauchen eines Glaskapillarrohres in dem Gradienten erreicht werden kann. Daher bleiben die teuren Ultrazentrifugenröhrchen unbeschädigt und wiederverwendet oft werden kann. Zusammen macht dies das vorliegende Protokoll eine einfache und billige Methode für Polysoms Profilierung.
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Protocol
1. Herstellung von 20 bis 50% (w / v) Saccharosegradienten
Anmerkung: Die Gradienten sind aus 4 Schichten von Saccharose (50%, 35% und 2 Schichten aus 20%) in 13,2 ml Ultrazentrifugenröhrchen. Unserer Erfahrung nach in zwei getrennten Schichten, die die 20% Saccharose Gießen verbessert die Qualität der Polysoms Zubereitungen.
- Bereiten Sie die Stammlösungen. Stellen Sie sicher, dass alle Lösungen RNAse und DNAse frei.
- Bereiten 10X Salzlösung: 400 mM Tris-HCl pH 8,4, 200 mM KCl und 100 mM MgCl 2.
- Bereiten Sie 2 M Saccharose-Lösung: Für 200 ml, lösen sich 137 g Saccharose in 1X Salzlösung.
- Verdünnen Sie die Saccharose-Lösung in Salzlösung, wie in Tabelle 1 beschrieben, um die Steigungen vorzubereiten. Die Volumina beziehen sich auf sechs Steigungen.
| Endgültige Saccharosekonzentration | Sucrose 2M (ml) | Salzlösung 1X (ml) | Finale Vol. (ml) |
| 50% | 8.8 | 3.2 | 12 |
| 35% | 12.9 | 12.1 | 25 |
| 20% | 7.4 | 17.6 | 25 |
| 20% | 5.8 | 14.2 | 20 |
Tabelle 1. Verdünnungen der Saccharose - Lösung sechs Steigungen vorzubereiten.
- Gießen Sie die Schichten gemäß Tabelle 2.
| Sucrose Schicht | 50% | 35% | 20% | 20% |
| Vol. (Ml) | 1,85 | 3,65 | 3.65 | 1,35 |
Tabelle 2. Volumen von Saccharoselösung pro Schicht.
- Nach jeder Schicht Gießen, halten Sie die Röhrchen in einem -40 ° C oder -80 ° C Gefrierschrank bis zur vollständigen Einfrieren, bevor die nächste Schicht Saccharose Zugabe. Das Einfrieren ist in der Regel nach 2 Stunden bei -40 ° C erreicht, sondern warten etwa 6 Stunden, bevor die nächste Schicht wird empfohlen, zu gießen. Die letzten 20% Schicht kann frisch des Experiments am Tag eingefroren oder hinzugefügt werden.
Hinweis: jede Schicht Einfrieren bevor Sie die nächste Zugabe von jeder Vermischung oder Störung der Schichten verhindert. Gradienten können in einem -40 ° C oder -80 ° C Gefrierschrank für mindestens sechs Monate aufbewahrt werden. - Wenn sie nicht bereits geschehen ist, fügen Sie den Gradienten am Tag des Experiments die letzten 20% Schicht. Dann lassen Sie die Steigungen in einem kalten Raum auftauen oder einen Kühlschrank.
2. Herstellung von Cytosolextrakten
Hinweis: Wir empfmit zwei Steigungen pro biologischen Probe zu beenden. 300 mg ist die optimale Menge an Pflanzenmaterial zwei Steigungen vorzubereiten , wenn sie mit 6 Tage alten Arabidopsis thaliana Keimlingen arbeiten. Wenn es mit weniger translational aktiven Geweben arbeiten, kann die Menge an Pflanzenmaterial erhöht werden, bis zu 600 mg.
- Ernte 6 Tage alten Sämlinge wachsen auf ½ Murashige und Skoog 8 - Medium mit 1% Saccharose oder gleichwertigen Medien ergänzt durch das Tiefgefrieren in flüssigem Stickstoff
- Grind Pflanzenmaterial in einem vorgekühlten Mörser und Stößel mit flüssigem Stickstoff.
- Man wiegt 300 mg pulverisiertes Material in einem vorgekühlten Waagschale. Führen Sie diesen Schritt schnell Auftauen der Probe zu vermeiden.
Hinweis: Halten Sie die gefrorenen Proben für nicht mehr als eine Woche in einem -80 ° C Gefrierschrank. - Hinzufügen 2,4 ml vorgekühltem Polysomen - Puffer (Salt Solution 4X, 5,26 mM EGTA, 0,5% (v / v) Octylphenoxy - poly (ethylenoxy) ethanol, verzweigt, 50 μg.ml -1 Cycloheximid, 50 μg.ml 1Chloramphenicol) und homogenisieren, indem sie mit der Pipettenspitze vermischt wird. Übertragen in zwei 1,5-ml-Röhrchen. Arbeiten Sie schnell die Proben, um zu verhindern Erwärmung.
- Zentrifuge bei 16.000 xg für 15 min bei 4 ° C in einer Mikrozentrifuge zur Pelletierung Schutt.
Hinweis: Um die RNA-Abbau zu verhindern, halten immer die Proben bei 4 ° C, verwenden RNase / DNase frei Lösungen und arbeiten in RNase / DNase freien Bedingungen. Heparin kann in die Polysomen - Puffer zugegeben werden, bis zu einer Endkonzentration von 300 μg.ml -1, RNA - Schutz zu verbessern. Da jedoch Heparin mit nachgeschalteter Analyse stören kann, wird es durch Ausführen einer Lithiumchloridfällung anstelle von Ethanolfällung (siehe Anmerkung 4.7) während der RNA-Fällungsschritt entfernt werden.
3. Polysomen Profilieren
- Sorgfältig pipettieren den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Wenn Pflanzenfragmente pipettiert wurden, wiederholen Sie Schritt 2.5. Laden Sie den Überstand auf der Oberseite des Gradienten durch sanft pipetting auf die Seitenwand des Röhrchens in einem konstanten Strom. Verwenden Sie einen Gradienten für jede 1,5-ml-Röhrchen.
- Transfer zum vorgekühlten Eimer und Zentrifuge bei 175.000 xg für 2 h 45 min bei 4 ° C, in einer Ultrazentrifuge (zB 32.000 Umdrehungen pro Minute bei einem SW41-Rotor verwendet wird).
- Stellen Sie den Gradienten Sammelsystem auf , als in Figur 1 beschrieben ist . Die UV - Küvette hat einen 1 mm Weglänge.
Abbildung 1. Gradient Sammelsystem. Die UV - Küvette wird durch Polyvinylchlorid Schlauch auf eine Glaskapillare verbunden, die auf dem Boden des Gradienten abfällt. Die Steigung schreitet durch das System dank einer Schlauchpumpe. OD 260 wird kontinuierlich gelesen und 2 ml - Fraktionen werden gesammelt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version zu sehendiese Figur.
- Stellen Sie den Fraktionssammler auf RT und setzen Sie das Karussell mit einer Geschwindigkeit, die die Sammlung von 2 ml Fraktionen ermöglichen. Verwenden Sie vorgekühlten Sammelröhrchen.
- Sammeln Sie die Fraktionen von unten eine Glaskapillare von Polyvinylchlorid Schlauch mit dem Gradienten Sammelsystem verbunden nach oben mit. Mit einem Kunststoffparaffinfilm die Verbindung zwischen dem Polyvinylchlorid-Rohr und der Glaskapillare zu sichern.
- Die Extinktion bei 260 nm von der Unterseite zur Oberseite des Gradienten. Wenn der gesamte Gradienten gesammelt wird, legen Sie die Sammelröhrchen auf Eis vor der RNA-Extraktion.
4. RNA-Extraktion
- Pool der Fraktionen aus zwei Gradienten gesammelt, in 50 ml Zentrifugenröhrchen mit einer Kappe bedeckt, wie folgt:
Polysomen: Fraktionen 1 bis 3 (12 ml)
Monosomes: Fraktion 4 (4 ml)
Überstand: Fraktionen 5 und 6 (8 ml) - Zu jeder Fraktion, fügen Sie 1 vol. 8M Guanidin-Hydrochlorid,50 & mgr; g Acrylträger und 1,5 Vol. Isopropanol.
Hinweis: Acryl Träger lineares Acrylamid, als Co-Fällmittel verwendet, um die Rückgewinnung von Nukleinsäuren während Alkoholfällung zu verbessern. - Mischen Sie durch die Rohre Umkehren und O / N bei -20 ° C auszufallen.
- Zentrifuge bei 175.000 × g für 1 Stunde bei 4 ° C in einer Ultrazentrifuge (32.000 rpm in einem SW32 Rotor). Wenn das Fällungsschritt in einem Rohr durchgeführt wird, die nicht kompatibel mit Ultrazentrifugation ist, zu einem geeigneten Rohr.
- Überstand verwerfen und lösen Sie das Pellet in 200 & mgr; l RNAse-freiem TE-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5-1 mM EDTA). Übertragen auf ein frisches 1,5-ml-Röhrchen.
- Extrahieren RNA durch Zugabe von 1 vol. Wasser gesättigtem Phenol (pH 6,6) und 1 Vol. Chloroform: Isoamylalkohol (24: 1). Gründlich mischen. Zentrifuge bei 15.000 xg für 20 min bei 4 ° C. Übertragen Sie die wässrige Phase in ein neues 1,5-ml-Röhrchen.
Anmerkung: Säure Phenol (pH 4.5) kann verwendet werden, um DNA-Kontamination zu minimieren. - Ausfällen RNA von 1/10 Vol Zugabe. 3 M Natriumacetat und 3 vol. 100% Ethanol. Lassen Sie Fällung bei -80 ° C für 20 min oder O / N bei -20 ° C. Zentrifuge bei 15.000 xg für 15 min bei 4 ° C.
Hinweis: Wenn in der Polysomen - Puffer (vgl Note 2.5), führen ein Lithiumchlorid (LiCl) Fällung anstelle von Ethanolfällung unter Verwendung von Heparin richtig jede Spur von Heparin zu entfernen , die 9 mit nachgeschalteter Analyse stören könnten. Nach der Extraktion hinzufügen LiCl zu einer Endkonzentration von 2,5 M. Niederschlag Lassen Sie für 30 Minuten bei -20 ° C oder O / N bei 4 ° C. Zentrifuge bei 15.000 xg für 15 min bei 4 ° C. - Waschen Sie das Pellet mit 500 ul 75% Ethanol. Air das Pellet trocknen und in 30 ul TE-Puffer lösen. Beurteilen RNA Qualität durch Elektrophorese auf einem RNAse frei 1,2% Agarosegel (100 V, 15 min) oder durch Kapillarelektrophorese Methoden.
5. Datenanalyse
- Export-Rohdaten in eine Grafik und Datenanalyse-Software.
Hinweis: Wie in 2A und B gezeigt, geben die Rohprofile qualitative Informationen: die Anzahl der Polysoms Spitzen, die die Höhe des monosome Spitze, und das Vorhandensein einer Schulter entsprechend den freien Ribosomen - Untereinheiten zu sehen ist. - Merge Profile Vergleich der Profile zwischen den Proben zu ermöglichen. indem zusätzliche Datenpunkte zu Beginn der Kurven Verwenden Sie den Bildschirmleser Werkzeug, um den X-Wert des monosome Spitze für jede Probe zu bestimmen und die monosome Gipfel auszurichten. Identifizieren Sie den tiefsten Punkt der Kurve und bestimmen dessen Y-Wert (mit dem Screenreader-Tool). Stellen Sie den tiefsten Punkt Y-Wert auf 0, indem Sie den "Set Spalten Wert" -Funktion.
- Bestimmen Sie den Polysomen / monosomes Verhältnis , indem die Fläche unter der Kurve von Rohprofile (3C) zu integrieren. Verwenden Sie die Datenauswahlwerkzeug die Grenze des Gebiets zu definieren, zu integrieren. Dann die Integration verwenden Funktion (Analysis-Mathematik).
- Normalisierendie Kurven an den monosome Spitze durch alle Datenpunkte einer Kurve von der Y-Wert des Gipfels des monosome Spitzenteilung (bestimmt den Screenreader-Tool). Wählen Sie die Spalte, dann unter Analysis-Mathematik, wählen Sie Normalisieren und wählen Sie die "geteilt durch einen bestimmten Wert" Methoden. Dieser Schritt ermöglicht einen Vergleich der relativen Pegel von Polysomen (Abbildung 3D).
Abbildung 2. Repräsentative Polysoms Profile. Arabidopsis thaliana Wildtyp (wt, Ökotyp Col-0) und mutierten Keimlinge wurden für sechs Tage auf ½ Murashige und Skoog - Medium unter langen Tag Photoperiode gezüchtet (16 Stunden Licht, 8 Stunden Dunkelheit). A: roh Polysoms Profile wt Sämlinge. B: roh Polysoms Profile aus dem mutierten Sämlinge. C: Die Bestimmung des Prozentsatzes von Polysomen und monosomes durch Integration der Fläche unter der Kurve D: Polysomen Profiles zum monosome Spitze normalisiert. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Representative Results
In der Literatur sind Polysomen Profile oft aus der leichten Fraktion in die Schwerfraktion als Ergebnis der Art und Weise gezeigt sind, die Gradienten gesammelt, also von oben nach unten. Da in dem beschriebenen Protokoll hier die Gradienten von unten nach oben gesammelt werden, mit der schweren Fraktion (die Polysomen) und gehen die Profile zeigen wir auf die leichte Fraktion (freie Ribosomen - Untereinheiten und RNAs) (2A) beginnen. Wir sammeln dann jeden Gradienten in sechs 2-ml-Fraktionen, aber auch kleinere Fraktionen können gesammelt werden, wenn eine detailliertere Analyse der Polysoms Inhalt durchgeführt werden muss.
Zusammenführen und die Normierung der Kurven auf die monosome Peak (2D) ermöglicht den Vergleich von Profilen aus verschiedenen Linien oder Wachstumsbedingungen. Sie liefert Informationen über die relative Menge von Polysomen unabhängig von der Höhe der Initiation. Eine weitere Möglichkeit, eineAlysieren die Profile ist die Fläche unter der Kurve zu berechnen, so kann man die relative Menge an mRNA bestimmen mit zugehörigem entweder den monosomes oder den Polysomen (Abbildung 2C). Dieses Verhältnis ist spezifisch für eine Pflanze und Wachstumsbedingungen. Jedoch kann dieser Ansatz nicht in dem Fall von schlecht translatorisch aktiven Geweben relevant sein.
Wir haben diese Methode für A verwendet thaliana ganze Sämlinge, junge und alte Rosetten sowie für N. benthamiana (3C), S. lycopersicum (Abbildung 3E) und O. sativa Blätter (3D). Die Profilform hängt von den Wachstumsbedingungen, Pflanzenalter und den analysierten Geweben. Hier haben wir A. thaliana 6 Tage alten Keimlingen. In diesem Stadium ist die Translationsaktivität hoch ist , und das Profil zeigt , gut geformte Spitzen (2A und B). Dies ist auch der Fall,wenn A. thaliana Blumen verwendet (Abbildung 3A). Bei der Verwendung von 4 Wochen alt A. thaliana Rosetten (3B), enthalten die Proben meist voll entwickelten Erwachsenen lässt , wo Zellen teilen sich nicht. Daher ist die Gesamtmenge an Polysomen und monosomes niedriger. Das Profil zeigt weniger, aber immer noch gut Polysoms Spitzen geformt. Neben dem monosome Spitze zeigt die Schulter, um die große Menge an freiem 60S ribosomalen Untereinheiten. Mit anderen Art von Pflanzen oder Geweben können die Polysoms Peaks können kaum sichtbar. Dies ist der Fall , wenn sie 30 Tage alt O. Verwendung sativa Blätter (3D). Selbst wenn die Menge an mRNAs in Translation beteiligt ist sehr niedrig (kein Polysomen peak kann auf das Profil zu sehen), das Vorhandensein des monosome peak zeigt an, dass die Fraktionierung richtig durchgeführt wurde und daß mRNAs kann weiter aus der Fraktion für eine weitere Analyse entnommen werden . Die Qualität der extrahierten RNA-Qualität wird durch Agarose-Gelelektrophorese beurteilt (
Abbildung 3. Polysomen Profile aus verschiedenen Pflanzenmaterial und Arten. (A) Arabidopsis thaliana Blumen (300 mg), (B) Arabidopsis thaliana 4 Wochen alt Rosetten (600 mg), (C) Nicotiana benthamiana (junge Blätter von 40 Tage alt kurzen Tageswachsene Pflanzen - 300mg), (D) Oryza sativa ( Blätter 30 Tage alten Pflanzen - 300 mg), (E) Solanum lycopersicum (junge Blätter von 35 Tage alt kurzen Tageswachsene Pflanzen - 300 mg). Die monosome Peaks sind durch Pfeile angedeutet ist.iles / ftp_upload / 54231 / 54231fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
. (- 15 min 100V) Abbildung 4. Beurteilung der RNA - Qualität RNA aus den angegebenen Fraktionen wurden geladen auf einem 1,2% Agarosegel und durch Elektrophorese (500 ng von Sprossen von 6 Tage alten Arabidopsis thaliana Keimlingen extrahiert). Cytosolic (25S und 18S) rRNA angegeben werden durch Pfeilspitzen und Chloroplasten (23S und 16S) rRNA durch eine Klammer. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Französisch nationalen Forschungsagentur (ANR-14-CE02-0010) unterstützt. Wir danken Dr. Benjamin Field und Dr. Elodie Lanet für das kritische Lesen des Manuskripts. Wir danken Herrn Michel Terese für seine Hilfe bei Videobearbeitung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer - 13.2 ml | Beckman Coulter | 331372 | |
| Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer - 38.5 ml | Beckman Coulter | 326823 | |
| Glass capillary tube | Drummond Scientific | 1-000-1000 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima series | |
| Ultracentrifuge Rotor SW41 | Beckman Coulter | 331362 | |
| Ultracentrifuge Rotor SW32 | Beckman Coulter | 369650 | |
| Peristaltic pump | Any | ||
| Tygon R3607 polyvinyl chloride tubing | Fisher Scientific | 070534-22 | Polyvinyl chloride tubing, 2.29 mm |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-Rad | 731-8120 | |
| UV cuvette | Hellma | 170.700-QS | Quartz flow-through cuvette |
| UV Spectrophotometer | Varian | Cary50 | Read every 0.0125 sec |
| All chemicals | Any | Use only Molecular Biology Grade | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| Rnase-Free water | Any | ||
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 10083251 | |
| Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol, branched (Nonidet P40) | Euromedex | UN3500 | |
| Linear acrylamide (acryl carrier) | ThermoFischer scientific | AM9520 | RNA precipitation carrier |
| OriginPro 8 | OriginLab | Analysis software |
References
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