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Biology

संयंत्र polysome रूपरेखा के लिए एक आसान तरीका

Published: August 28, 2016 doi: 10.3791/54231
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3,4, 5,6, 1,2,3, 1,2,3
1Laboratoire de Génétique et Biophysique des Plantes, Aix-Marseille Université, 2UMR 7265 Biologie Végétale & Microbiologie Environnementales, CNRS, 3BIAM, CEA, 4Department of Biology, Biocenter, University of Copenhagen, 5Laboratoire de Chimie Bactérienne, 6CNRS, LCB UMR 7283, Aix Marseille Université

Introduction

प्रोटीन संश्लेषण सभी कोशिकाओं 1 में एक आवश्यक और उर्जा महंगी प्रक्रिया है। सबसे पहले, कोशिकाओं अनुवाद मशीनरी, राइबोसोम के उत्पादन में ऊर्जा निवेश करना चाहिए। उदाहरण के लिए एक सक्रिय रूप से विभाजित खमीर सेल प्रति मिनट के रूप में ज्यादा के रूप में 2,000 राइबोसोम पैदा करता है। इस तरह की एक उत्पादन की कुल ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि का 60% करने के लिए और सेल 2 की कुल splicing गतिविधि के 90% अप करने की आवश्यकता है। इसके अलावा, ऊर्जा अमीनो एसिड, अमीनोएसिल-tRNA और पेप्टाइड बांडों के संश्लेषण के लिए आवश्यक है। पौधों में, एटीपी 3 के 4.5 5.9 करने के अणुओं से एक पेप्टाइड श्रृंखला की लागत के लिए एक एमिनो एसिड जोड़ने। इसलिए, यह है कि विनियमन के एक प्रमुख स्थल है प्रोटीन के लिए mRNA की बात है, खासकर जब यह पर्यावरण की स्थिति को बदलने के साथ काम करने के लिए आता है आश्चर्य की बात नहीं है।

अनुवाद की दीक्षा कदम है, राइबोसोम के साथ एक mRNA की एसोसिएशन है कि, के नियमन का मुख्य लक्ष्य हैअनुवाद 4। अनुवाद के नियमन का एक परिणाम के रूप में अच्छी तरह के रूप में अन्य के बाद विनियामक कदम के रूप में, प्रोटीन एकाग्रता में बदलाव का केवल 40% mRNA बहुतायत 5,6 से समझाया जा सकता है। इस प्रकार, कुल mRNA के अध्ययन प्रोटीन बहुतायत के बारे में अपेक्षाकृत गरीब जानकारी देता है। दूसरी ओर, राइबोसोम के साथ mRNA के सहयोग से उन अनुवाद में शामिल mRNAs के लिए उपयोग देकर प्रोटीन बहुतायत में बेहतर जानकारी देता है। सक्रिय रूप से अनुवाद mRNAs संरचनाओं polysomes बुलाया में कई राइबोसोम के साथ जुड़े रहे हैं। इसके विपरीत, खराब अनुवाद mRNAs केवल एक राइबोसोम (monosome) के साथ संबद्ध किया जाएगा। नतीजतन, एक mRNA के translational स्थिति राइबोसोम 7 के साथ अपने सहयोग की निगरानी के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल छह दिन पुराने Arabidopsis thaliana अंकुर, आरएनए के बाद के अलगाव से polysomes के अलगाव, और परिणाम का विश्लेषण बताता है। पोlysomes और monosomes एक सुक्रोज घनत्व ढाल के माध्यम से अलग हो रहे हैं। ढ़ाल छह भागों में एकत्र कर रहे हैं। polysomes, monosomes और प्रकाश अंश (इसके बाद बुलाया सतह पर तैरनेवाला) है, जो नि: शुल्क 60 और 40S ribosomal सब यूनिटों और mRNAs कि राइबोसोम के साथ जुड़े नहीं हैं: अंशों से कुछ अच्छी तरह से तीन अलग भागों प्राप्त करने के लिए जमा कर रहे हैं। वैश्विक अनुवाद गतिविधि एक polysome / monosome अनुपात है, जो वक्र के तहत क्षेत्र के एकीकरण के द्वारा निर्धारित किया जाता पैदा करने से अनुमान लगाया जा सकता है, और polysomes प्रोफाइल की तुलना द्वारा। mRNAs और प्रोटीन तो विभिन्न भागों से निकाले और आरटी पीसीआर, QRT- पीसीआर, उत्तरी धब्बा, माइक्रोएरे, पश्चिमी धब्बा या प्रोटिओमिक्स द्वारा विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है। इस प्रोटोकॉल अन्य पौधों और ऊतकों के लिए मान्य किया गया है।

उपकरण इस प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक आमतौर पर ज्यादातर प्रयोगशालाओं में पाए जाते हैं: एक ढाल निर्माता के लिए कोई जरूरत नहीं है। अगले एक को रोकने के जोड़ने से पहले प्रत्येक परत बर्फ़ीलीकिसी भी मिश्रण या परतों की अशांति से है। कोई ट्यूब बेधनेवाला ढाल संग्रह जो ढाल में एक गिलास केशिका ट्यूब के विसर्जन के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है के लिए प्रयोग किया जाता है। इसलिए, महंगा ultracentrifuge ट्यूबों undamaged बनी रहती है और कई बार फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है। सामूहिक रूप से, यह वर्तमान प्रोटोकॉल polysome रूपरेखा के लिए एक आसान और सस्ते विधि बनाता है।

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Protocol

1. 20 से 50% (w / v) सुक्रोज ढ़ाल की तैयारी

नोट: ढ़ाल एक 13.2 मिलीलीटर ultracentrifuge ट्यूब में सुक्रोज के 4 परतों (50%, 35% और 20% के 2 परतों) के बने होते हैं। हमारे अनुभव में दो अलग-अलग परतों में 20% sucrose डालने का कार्य बहुत polysome तैयारी की गुणवत्ता में सुधार।

  1. स्टॉक समाधान तैयार करें। सुनिश्चित करें कि सभी समाधान RNase और DNase स्वतंत्र हैं।
    1. 400 मिमी Tris एचसीएल पीएच 8.4, 200 मिमी KCl और 100 मिमी 2 MgCl: 10x साल्ट समाधान तैयार है।
    2. 200 मिलीलीटर के लिए 1x नमक के घोल में सुक्रोज की 137 ग्राम भंग: तैयार 2 एम sucrose के समाधान।
  2. तालिका 1 में वर्णित के रूप में, ढ़ाल तैयार करने के लिए, नमक के घोल में सुक्रोज समाधान पतला। दी मात्रा में छह ढ़ाल के लिए कर रहे हैं।
अंतिम सुक्रोज एकाग्रता सुक्रोज 2एम (एमएल) नमक के घोल 1X (एमएल) अंतिम वॉल्यूम। (एमएल)
50% 8.8 3.2 12
35% 12.9 12.1 25
20% 7.4 17.6 25
20% 5.8 14.2 20

तालिका 1 sucrose के समाधान के dilutions छह ढ़ाल तैयार करने के लिए।

  1. प्रति 2 टेबल के रूप में परतों डालो।
सुक्रोज परत 50% 35% 20% 20%
वॉल्यूम। (एमएल) 1.85 3.65 3.65 1.35

तालिका 2 परत प्रति सूक्रोज समाधान की मात्रा।

  1. प्रत्येक परत डालने का कार्य करने के बाद, अगले सुक्रोज परत जोड़ने से पहले पूरा ठंड जब तक एक -40 डिग्री सेल्सियस में ट्यूबों रखने के लिए या -80 सेल्सियस फ्रीजर। बर्फ़ीली आमतौर पर -40 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के बाद हासिल की है, लेकिन अगले परत गिरने से पहले के बारे में 6 घंटा इंतजार कर की सिफारिश की है। पिछले 20% परत जमे हुए या प्रयोग के दिन पर हौसले से जोड़ा जा सकता है।
    नोट: अगले एक जोड़ने से पहले प्रत्येक परत बर्फ़ीली किसी भी मिश्रण या परतों की अशांति से रोकता है। ढ़ाल कम से कम छह महीने के लिए एक -40 डिग्री सेल्सियस में रखा जा सकता है या -80 सेल्सियस फ्रीजर।
  2. यदि यह पहले से ही नहीं किया गया है, प्रयोग के दिन पर ढ़ाल के लिए पिछले 20% परत जोड़ें। फिर, ढ़ाल एक ठंडे कमरे या फ्रिज में पिघलना करते हैं।

2. साइटोसोलिक अर्क की तैयारी

नोट: हम recommजैविक नमूने प्रति दो ढ़ाल का उपयोग कर खत्म होता है। 300 मिलीग्राम जब 6 दिन पुरानी Arabidopsis thaliana पौध के साथ काम कर रहे दो ढ़ाल तैयार करने के लिए संयंत्र सामग्री की अधिकतम राशि है। जब कम translationally सक्रिय ऊतकों के साथ काम कर रहा है, संयंत्र सामग्री की मात्रा 600 मिलीग्राम तक बढ़ाया जा सकता है।

  1. हार्वेस्ट छह दिन पुरानी पौध आधा Murashige और Skoog पर हो 8 मध्यम तरल नाइट्रोजन में जल्दी ठंड से 1% सूक्रोज या समकक्ष मीडिया के साथ पूरक
  2. एक precooled मोर्टार और तरल नाइट्रोजन के साथ मूसल में पीस संयंत्र सामग्री।
  3. एक precooled वजन डिश में पाउडर सामग्री के 300 मिलीग्राम वजन। नमूने के विगलन से बचने के लिए जल्दी से इस कदम प्रदर्शन।
    ध्यान दें: एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में कोई अधिक से अधिक एक सप्ताह के लिए जमे हुए नमूने रखें।
  4. (नमक समाधान 4X, 5.26 मिमी EGTA, 0.5% (वी / वी) Octylphenoxy पाली (ethyleneoxy) इथेनॉल, precooled polysome बफर के 2.4 मिलीलीटर branched, 50 μg.ml -1 cycloheximide, जोड़े 50 μg.ml 1chloramphenicol) और विंदुक टिप के साथ मिश्रण से homogenize। दो 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरण। जल्दी से काम वार्मिंग से नमूने को रोकने के लिए।
  5. एक microcentrifuge में 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 16,000 XG पर अपकेंद्रित्र मलबे गोली।
    नोट: आरएनए गिरावट को रोकने के लिए, हमेशा 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने रखने, RNase / DNase मुक्त परिस्थितियों में RNase / DNase मुक्त समाधान और काम का उपयोग करें। हेपरिन आरएनए सुरक्षा बढ़ाने के लिए polysome बफर करने के लिए जोड़ा जा सकता है, 300 μg.ml -1 के अंतिम एकाग्रता के लिए। हालांकि, हेपरिन बहाव के विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं के बाद से, यह लिथियम क्लोराइड तेज़ी इथेनॉल (सीएफ टिप्पणी 4.7) के बजाय प्रदर्शन से आरएनए वर्षा चरण के दौरान हटा दिया जाना पड़ेगा।

3. polysome रूपरेखा

  1. ध्यान से गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला पिपेट। संयंत्र के टुकड़े pipetted किया गया है, 2.5 कदम दोहराएँ। धीरे pipettin से ढाल के शीर्ष पर सतह पर तैरनेवाला लोडजी एक निरंतर प्रवाह में ट्यूब के sidewall पर। प्रत्येक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब के लिए एक ढाल का प्रयोग करें।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटा 45 मिनट के लिए 175,000 XG पर बाल्टी और सेंट्रीफ्यूज precooled करने के लिए, एक ultracentrifuge में स्थानांतरण (जैसे 32,000 आरपीएम जब एक SW41 रोटर का उपयोग)।
  3. चित्रा 1 में वर्णित के रूप में सेट अप ढाल संग्रह प्रणाली। यूवी क्युवेट एक 1 मिमी pathlength है।

आकृति 1
चित्रा 1. ढाल संग्रह प्रणाली। यूवी क्युवेट एक गिलास केशिका ट्यूब कि ढाल के नीचे करने के लिए उतरता को क्लोराइड ट्यूबिंग से जुड़ा हुआ है। ढाल एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप करने के लिए प्रणाली धन्यवाद के माध्यम से प्रगति। आयुध डिपो के 260 लगातार पढ़ा जाता है और 2 मिलीलीटर अंशों एकत्र कर रहे हैं। का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा।

  1. आरटी के अंश कलेक्टर को समायोजित करें, और एक गति है कि 2 मिलीलीटर अंशों के संग्रह की अनुमति देगा में हिंडोला निर्धारित किया है। पूर्व-ठंडा संग्रह ट्यूबों।
  2. ढाल संग्रह प्रणाली के लिए क्लोराइड ट्यूबिंग से जुड़े एक गिलास केशिका ट्यूब का उपयोग कर नीचे से ऊपर अंशों लीजिए। क्लोराइड ट्यूबिंग और गिलास केशिका ट्यूब के बीच कनेक्शन को सुरक्षित करने के लिए एक प्लास्टिक की फिल्म आयल का प्रयोग करें।
  3. ढाल के शीर्ष करने के लिए नीचे से 260 एनएम पर absorbance पढ़ें। जब पूरे ढाल एकत्र किया जाता है, शाही सेना निकासी से पहले जगह बर्फ पर संग्रह ट्यूबों।

4. शाही सेना निकालना

  1. दो ढ़ाल से एकत्र भिन्न, अपकेंद्रित्र ट्यूब छाया हुआ 50 मिलीलीटर में पूल, इस प्रकार है:
    Polysomes: अंशों 1 से 3 (12 एमएल)
    Monosomes: अंश 4 (4 मिलीलीटर)
    सतह पर तैरनेवाला: अंशों 5 और 6 (8 एमएल)
  2. प्रत्येक अंश करने के लिए, 1 खंड जोड़ें। 8M guanidine हाइड्रोक्लोराइड,50 ग्राम acryl वाहक और 1.5 वॉल्यूम। isopropanol।
    नोट: Acryl वाहक रेखीय एक्रिलामाइड, शराब वर्षा के दौरान न्यूक्लिक एसिड की वसूली में सुधार करने के लिए एक coprecipitant के रूप में प्रयोग किया जाता है।
  3. नलियों inverting द्वारा मिक्स और -20 डिग्री सेल्सियस पर वेग हे / एन।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे, एक ultracentrifuge में (एक SW32 रोटर में 32,000 आरपीएम) के लिए 175,000 XG पर अपकेंद्रित्र। वर्षा कदम के लिए एक ट्यूब जो ultracentrifugation साथ संगत नहीं है में किया जाता है, तो एक उपयुक्त ट्यूब को हस्तांतरण।
  5. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 200 μl RNase मुक्त ते बफर (10 मिमी Tris एचसीएल पीएच 7.5 - 1 मिमी EDTA) में गोली भंग। एक ताजा 1.5 मिलीलीटर ट्यूब पर स्थानांतरण।
  6. 1 खंड जोड़कर शाही सेना निकालें। पानी से संतृप्त फिनोल (पीएच 6.6) और 1 वॉल्यूम। क्लोरोफॉर्म: isoamyl शराब (24: 1)। सख्ती मिश्रण। 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 15,000 XG पर अपकेंद्रित्र। एक नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब जलीय चरण हस्तांतरण।
    नोट: एसिड फिनोल (4.5 पीएच) आदेश डीएनए प्रदूषण को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  7. 1/10 खंड जोड़कर वेग आरएनए। 3 एम सोडियम एसीटेट और 3 वॉल्यूम। 100% इथेनॉल। 20 मिनट या हे / -20 डिग्री सेल्सियस पर एन के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर वर्षा की अनुमति दें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 15,000 XG पर अपकेंद्रित्र।
    नोट: यदि polysome बफर (सीएफ टिप्पणी 2.5) में हेपरिन का उपयोग कर, एक लिथियम क्लोराइड (LiCl) वर्षा के बजाय प्रदर्शन इथेनॉल का ठीक से हेपरिन के किसी भी ट्रेस कि बहाव विश्लेषण 9 के साथ हस्तक्षेप कर सकता है हटा दें। निष्कर्षण के बाद, LiCl 2.5 एम के अंतिम एकाग्रता के लिए 30 मिनट के लिए वर्षा की अनुमति दें -20 डिग्री सेल्सियस या हे / एन में 4 डिग्री सेल्सियस पर जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 15,000 XG पर अपकेंद्रित्र।
  8. 500 μl 75% इथेनॉल के साथ गोली धो लें। एयर गोली सूखी और 30 μl ते बफर में भंग। एक RNase मुक्त 1.2% agarose जेल (100V, 15 मिनट) पर या केशिका वैद्युतकणसंचलन तरीकों से वैद्युतकणसंचलन द्वारा शाही सेना गुणवत्ता का आकलन करें।

5. डेटा विश्लेषण

  1. एक ग्राफिक और डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर निर्यात करने के लिए कच्चे डेटा।
    ध्यान दें: के रूप में चित्रा 2A और बी में दिखाया गया है, कच्चे प्रोफाइल गुणात्मक जानकारी दे: देखा जा सकता है कि polysome चोटियों की संख्या, monosome चोटी की ऊंचाई, और एक कंधे मुक्त राइबोसोम सब यूनिटों के लिए इसी की उपस्थिति।
  2. प्रोफाइल मर्ज नमूनों के बीच प्रोफाइल की तुलना की अनुमति है। प्रत्येक नमूना के लिए monosome चोटी के एक्स मूल्य निर्धारित करने के लिए स्क्रीन रीडर उपकरण का उपयोग करें और घटता की शुरुआत में अतिरिक्त डेटा बिंदुओं को हटाने के द्वारा monosome चोटियों संरेखित। वक्र के निम्नतम बिंदु को पहचानें और उसके Y मूल्य (स्क्रीन रीडर उपकरण का उपयोग) का निर्धारण। "सेट कॉलम मूल्य" समारोह का उपयोग करके 0 करने के निम्नतम बिंदु Y मूल्य निर्धारित करें।
  3. कच्चे प्रोफाइल (चित्रा 3 सी) से वक्र के तहत क्षेत्र को एकीकृत करके polysomes / monosomes अनुपात निर्धारित करते हैं। क्षेत्र की सीमा एकीकृत किया जा करने के लिए परिभाषित करने के लिए डेटा चयनकर्ता उपकरण का प्रयोग करें। तब एकीकृत समारोह (विश्लेषण-गणित) का उपयोग करें।
  4. मानक के अनुसारmonosome चोटी के शिखर सम्मेलन के वाई मूल्य द्वारा एक वक्र के सभी डेटा बिंदुओं को विभाजित करके monosome शिखर पर घटता (स्क्रीन रीडर उपकरण का उपयोग निर्धारित)। स्तंभ का चयन करें, तो विश्लेषण-गणित के तहत, मानक के अनुसार चयन करें और "एक निर्धारित मूल्य से विभाजित" तरीकों चुनें। यह कदम polysomes के रिश्तेदार स्तर (चित्रा 3 डी) की तुलना की अनुमति देता है।

चित्र 2
चित्रा 2. प्रतिनिधि polysome प्रोफाइल। Arabidopsis thaliana जंगली प्रकार (WT, ecotype कर्नल-0) और उत्परिवर्ती पौध लंबे दिन के Photoperiods (16 घंटा प्रकाश, 8 घंटा अंधेरे) के तहत आधा Murashige और Skoog माध्यम पर छह दिनों के लिए बड़े हो रहे थे। एक: WT पौध से कच्चे polysome प्रोफाइल। बी: उत्परिवर्ती पौध से कच्चे polysome प्रोफाइल। सी: वक्र डी के तहत क्षेत्र के एकीकरण के द्वारा polysomes और monosomes के प्रतिशत का निर्धारण: polysome PROFIलेस monosome पीक करने के लिए सामान्यीकृत। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Representative Results

साहित्य में, polysome प्रोफाइल अक्सर रास्ता ढ़ाल एकत्र कर रहे हैं का एक परिणाम के रूप में भारी अंश के लिए प्रकाश अंश से दिखाए जाते हैं, यानी ऊपर से नीचे तक। चूंकि यहां वर्णित प्रोटोकॉल में ढ़ाल ऊपर से नीचे से एकत्र कर रहे हैं, प्रोफाइल हम बताते भारी अंश (polysomes) के साथ शुरू और प्रकाश अंश (मुक्त राइबोसोम सब यूनिटों और आरएनए) (2A चित्रा) के पास जाओ। हम तो छह 2 मिलीलीटर भागों में प्रत्येक ढाल एकत्रित करते हैं, लेकिन छोटे अंशों एकत्र किया जा सकता है, तो polysome सामग्री की एक अधिक विस्तृत विश्लेषण किया जाना है।

विलय और monosome शिखर (चित्रा 2 डी) के लिए घटता सामान्य अलग लाइनों या विकास की स्थिति से प्रोफाइल की तुलना की अनुमति देता है। यह दीक्षा के स्तर की स्वतंत्र रूप से polysomes के रिश्तेदार राशि के बारे में जानकारी प्रदान करता है। एक करने के लिए एक और तरीकाप्रोफाइल nalyze वक्र के अंतर्गत क्षेत्र की गणना करने के लिए, इस प्रकार, एक या तो monosomes या polysomes (चित्रा 2 सी) के साथ जुड़े mRNA के रिश्तेदार मात्रा का निर्धारण कर सकते हैं। यह अनुपात एक संयंत्र और विकास की स्थिति के लिए विशिष्ट है। हालांकि, इस दृष्टिकोण खराब translationally सक्रिय ऊतकों के मामले में प्रासंगिक नहीं हो सकता है।

हम ए के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया है थालिअना पूरे अंकुर, जवान और बूढ़े धब्बे, साथ ही एन के रूप में benthamiana (चित्रा 3 सी), एस lycopersicum (चित्रा 3E) और ओ पौधा पत्तियों (चित्रा 3 डी)। प्रोफ़ाइल आकार विकास की स्थिति, संयंत्र उम्र और ऊतकों का विश्लेषण पर निर्भर करता है। यहाँ हम ए का इस्तेमाल किया छह दिन पुरानी पौध थालिअना। इस स्तर पर, translational गतिविधि अधिक है, और प्रोफ़ाइल में अच्छी तरह से पता चलता आकार का चोटियों (चित्रा 2A और बी)। यह भी मामला हैजब ए थालिअना फूल (चित्रा 3 ए) का इस्तेमाल किया जाता है। 4 सप्ताह पुरानी ए का उपयोग करते हैं थालिअना धब्बे (चित्रा 3 बी), नमूने ज्यादातर शामिल पूरी तरह से विकसित वयस्क छोड़ देता है, जहां कोशिकाओं के विभाजन नहीं है। इसलिए, polysomes और monosomes की कुल राशि कम है। प्रोफ़ाइल कम है, लेकिन अभी भी अच्छी तरह से आकार polysome चोटियों से पता चलता है। monosome चोटी के आगे, कंधे मुक्त 60 ribosomal सब यूनिटों की बड़ी राशि से पता चलता है। पौधों या ऊतकों के अन्य प्रकार के साथ, polysome चोटियों मुश्किल से दिखाई हो सकता है। यह मामला है जब 30 दिन पुरानी ओ का उपयोग कर पौधा पत्तियों (चित्रा 3 डी)। यहां तक ​​कि जब अनुवाद में शामिल mRNAs की राशि बहुत कम है (कोई polysome चोटी प्रोफ़ाइल पर देखा जा सकता है), monosome चोटी की उपस्थिति इंगित करता है कि विभाजन ठीक से किया गया था और उस mRNAs आगे आगे के विश्लेषण के लिए अंश से निकाला जा सकता है । निकाले शाही सेना की गुणवत्ता की गुणवत्ता agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा मूल्यांकन किया है ( ओंग> चित्रा 4)। 25S और 18S साइटोसोलिक ribosomal शाही सेना जेल पर स्पष्ट रूप से दिखाई जानी चाहिए। लोअर बैंड chloroplastic ribosomal शाही सेना को इसी भी दिखाई दे रहा है, जब शाही सेना को हरी ऊतकों 10 से निकाले जाते हैं होना चाहिए।

चित्र तीन
चित्रा 3. विभिन्न संयंत्र सामग्री और प्रजातियों से polysome प्रोफाइल। (ए) Arabidopsis thaliana फूल (300 मिग्रा), (बी) Arabidopsis thaliana 4 सप्ताह पुराने धब्बे (600mg), (सी) निकोटियाना benthamiana (40 दिन पुरानी छोटी दिन-बड़े पौधों के युवा पत्तियों - 300mg), (डी) धान ( 30 दिनों के पुराने पौधों की पत्तियों - 300mg), (ई) सोलेनम lycopersicum (35 दिन पुरानी छोटी दिन-बड़े पौधों के युवा पत्तियों - 300mg)। monosome चोटियों तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं।Iles / ftp_upload / 54231 / 54231fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
। (- 15 मिनट 100V) चित्रा 4. शाही सेना गुणवत्ता का आकलन आरएनए संकेत दिया अंशों से एक 1.2% agarose जेल पर भरी हुई है और वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग हो गए थे (500 6 दिन पुरानी Arabidopsis thaliana पौध की शूटिंग से निकाले एनजी)। साइटोसोलिक (25S और 18s) rRNA तीर और chloroplastic (23S और 16S) rRNA एक वर्ग द्वारा संकेत कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Acknowledgments

इस काम फ्रेंच राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (ANR-14-CE02-0010) द्वारा समर्थित किया गया। हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉ बेंजामिन फील्ड और डॉ Elodie Lanet धन्यवाद। हम वीडियो संपादन के साथ उनकी मदद के लिए श्री मिशेल Terese धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer - 13.2 ml Beckman Coulter 331372
Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer - 38.5 ml Beckman Coulter 326823
Glass capillary tube Drummond Scientific 1-000-1000
Ultracentrifuge  Beckman Coulter Optima series
Ultracentrifuge Rotor SW41 Beckman Coulter 331362
Ultracentrifuge Rotor SW32 Beckman Coulter 369650
Peristaltic pump Any
Tygon R3607 polyvinyl chloride tubing  Fisher Scientific 070534-22 Polyvinyl chloride tubing, 2.29 mm 
Fraction collector Model 2110 Bio-Rad 731-8120
UV cuvette Hellma 170.700-QS Quartz flow-through cuvette
UV Spectrophotometer Varian Cary50 Read every 0.0125 sec
All chemicals Any Use only Molecular Biology Grade
Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS) Sigma-Aldrich M5524
Rnase-Free water Any
Petri Dishes Fisher Scientific 10083251 
Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol, branched (Nonidet P40) Euromedex UN3500
Linear acrylamide (acryl carrier) ThermoFischer scientific AM9520 RNA precipitation carrier
OriginPro 8 OriginLab Analysis software

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References

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प्लांट बायोलॉजी अंक 114 अनुवाद polysomes आरएनए सूक्रोज ढाल विभाजन पौधों, सोलेनम lycopersicum
संयंत्र polysome रूपरेखा के लिए एक आसान तरीका
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Lecampion, C., Floris, M., Fantino,… More

Lecampion, C., Floris, M., Fantino, J. R., Robaglia, C., Laloi, C. An Easy Method for Plant Polysome Profiling. J. Vis. Exp. (114), e54231, doi:10.3791/54231 (2016).

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