Introduction
La sintesi proteica è un processo essenziale e energeticamente costosa in tutte le cellule 1. Prima di tutto, le cellule devono investire energie nella produzione delle macchine di traduzione, i ribosomi. Per esempio una cellula di lievito che divide attivamente produce fino a 2.000 ribosomi al minuto. Tale produzione richiede fino al 60% del totale attività trascrizionale e fino al 90% dell'attività splicing totale della cella 2. Inoltre, l'energia è necessaria per la sintesi di amminoacidi,-tRNA e legami peptidici. Nelle piante, l'aggiunta di un aminoacido ad un costo catena peptidica da 4,5 a 5,9 molecole di ATP 3. Pertanto, non è sorprendente che la traduzione di mRNA di proteina è un importante sito di regolazione, in particolare quando si tratta di trattare con mutevoli condizioni ambientali.
Il passo inizio della traduzione, che è l'associazione di un mRNA con il ribosoma, è l'obiettivo principale del regolamento ditraduzione 4. Come conseguenza della regolazione della traduzione nonché altri passaggi normativi post-trascrizionale, solo il 40% delle variazioni della concentrazione di proteine può essere spiegato con mRNA abbondanza 5,6. Così, lo studio di mRNA totale fornisce informazioni relativamente scarsa su l'abbondanza di proteine. D'altra parte, l'associazione di mRNA con ribosomi dà una migliore comprensione abbondanza di proteine, dando accesso a tali mRNA coinvolti nella traduzione. mRNA attivamente tradotti sono associati a diversi ribosomi in strutture chiamate polisomi. Al contrario, mRNA mal tradotti saranno associati con una sola ribosoma (monosome). Di conseguenza, lo stato traduzionale di mRNA può essere valutata monitorando la sua associazione con ribosomi 7.
Questo protocollo descrive l'isolamento di polisomi da sei giorni piantine Arabidopsis thaliana, il successivo isolamento di RNA, e l'analisi dei risultati. Polysomes e monosomes sono separati attraverso un gradiente di densità di saccarosio. Le sfumature sono raccolti in sei frazioni. Alcune delle frazioni viene riunito per ottenere tre frazioni ben separati: polisomi, monosomes e la frazione leggera (di seguito denominato surnatante), che contiene le libere 60 e 40S subunità ribosomiale e mRNA che non sono associati con i ribosomi. attività di traduzione globale può essere stimato generando un rapporto segnale / rumore monosome polysome, che è determinata dalla integrazione dell'area sotto la curva, e confrontando i profili polisomi. mRNA e le proteine vengono poi estratte da diverse frazioni e utilizzati per l'analisi mediante RT-PCR, qRT-PCR, Northern blot, microarray, macchia occidentale o la proteomica. Questo protocollo è stato convalidato per altre piante e tessuti.
Il materiale necessario per effettuare questo protocollo si trovano comunemente nella maggior parte dei laboratori: Non vi è alcuna necessità di un creatore di gradiente. Congelamento ogni strato prima di aggiungere il successivo prevenires da qualsiasi miscela o disturbo degli strati. N perforatore tubo è utilizzato per la raccolta di gradiente che può essere raggiunto mediante immersione di un tubo capillare di vetro nel gradiente. Pertanto, i tubi ultracentrifuga costose rimangono integre e possono essere riutilizzati più volte. Collettivamente, questo rende il presente protocollo un metodo semplice ed economico per il profiling polysome.
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Protocol
1. Preparazione del 20 al 50% (w / v) di saccarosio gradienti
Nota: I gradienti sono fatti di strati 4 di saccarosio (50%, 35% e 2 strati di 20%) in un tubo ultracentrifuga 13,2 ml. Nella nostra esperienza, versando il saccarosio del 20% in due strati separati migliora notevolmente la qualità delle preparazioni polysome.
- Preparare le soluzioni madre. Assicurarsi che tutte le soluzioni sono RNAsi e DNAsi gratuito.
- Preparare 10X soluzione salina: 400 mm Tris-HCl pH 8.4, 200 mm e 100 mm KCl MgCl 2.
- Preparare 2 M saccarosio Soluzione: Per 200 ml, sciogliere 137 g di saccarosio in 1X soluzione salina.
- Diluire la soluzione di saccarosio in soluzione salina, come descritto nella Tabella 1, per preparare i gradienti. I volumi indicati sono per sei pendenze.
| La concentrazione di saccarosio finale | saccarosio 2M (ml) | Sale soluzione 1X (ml) | Vol finale. (ml) |
| 50% | 8.8 | 3.2 | 12 |
| 35% | 12.9 | 12.1 | 25 |
| 20% | 7.4 | 17.6 | 25 |
| 20% | 5.8 | 14.2 | 20 |
Tabella 1. Le diluizioni della soluzione di saccarosio per preparare sei gradienti.
- Versare gli strati come da Tabella 2.
| strato di saccarosio | 50% | 35% | 20% | 20% |
| Vol. (Ml) | 1.85 | 3.65 | 3.65 | 1.35 |
Tabella 2. Volume di soluzione di saccarosio per strato.
- Dopo aver versato ogni strato, tenere i tubi in un -40 ° C o -80 ° C fino a completa freezer congelamento prima di aggiungere il successivo strato di saccarosio. Il congelamento viene solitamente raggiunta dopo 2 ore a -40 ° C, ma si consiglia di attendere circa 6 ore prima di versare lo strato successivo. L'ultimo strato 20% può essere congelato o aggiunta di fresco il giorno dell'esperimento.
Nota: congelamento ogni strato prima di aggiungere il successivo impedisce qualsiasi mescolanza o disturbo degli strati. Gradienti possono essere conservati in una -40 ° C o -80 ° C freezer per almeno sei mesi. - Se non è già stato fatto, aggiungere l'ultimo strato 20% ai gradienti il giorno dell'esperimento. Poi, lasciare che i gradienti scongelare in una stanza fredda o di un frigorifero.
2. Preparazione di citosoliche Estratti
Nota: Raccomfinire utilizzando due gradienti per campione biologico. 300 mg è la quantità ottimale di materiale vegetale per preparare due gradienti quando si lavora con 6 giorni di età piantine Arabidopsis thaliana. Quando si lavora con tessuti meno traduzionale attivi, la quantità di materiale vegetale può essere aumentata fino a 600 mg.
- Harvest sei giorni vecchie piantine coltivate in ½ Murashige e Skoog 8 di media integrato con 1% di saccarosio o mezzi equivalenti dal rapido congelamento in azoto liquido
- materiale vegetale macinare in un mortaio e pestello pre-raffreddata con azoto liquido.
- Pesare 300 mg di materiale in polvere in un piatto di pesatura preraffreddato. Eseguire questo passaggio rapidamente per evitare lo scongelamento del campione.
Nota: Mantenere i campioni congelati per non più di una settimana in un congelatore C -80 °. - Aggiungere 2,4 ml di tampone polysome pre-raffreddata (Salt Solution 4X, 5,26 mM EGTA, 0,5% (v / v) Octylphenoxy poli (etilenossi) etanolo, ramificati, 50 μg.ml -1 cicloesimide, 50 μg.ml 1cloramfenicolo) e omogeneizzare mescolando con la punta della pipetta. Trasferire in due provette da 1,5 ml. Lavorare velocemente per evitare che i campioni da riscaldamento.
- Centrifugare a 16.000 xg per 15 min a 4 ° C in una microcentrifuga a pellet detriti.
Nota: per evitare la degradazione dell'RNA, tenere sempre i campioni a 4 ° C, usare soluzioni libere RNasi / DNasi e il lavoro in condizioni di libero RNasi / DNasi. Eparina può essere aggiunto al buffer polysome, ad una concentrazione finale di 300 μg.ml -1, per migliorare la protezione RNA. Tuttavia, poiché l'eparina può interferire con l'analisi valle, dovrà essere rimosso durante la fase di precipitazione RNA eseguendo litio precipitazione cloruro invece di precipitazione con etanolo (cfr nota 4.7).
3. polysome Profiling
- pipetta con attenzione il surnatante senza disturbare il pellet. Se i frammenti vegetali sono stati pipettati, ripetere il punto 2.5. Caricare il surnatante sopra del gradiente da pipettin delicatamenteg sulla parete laterale del tubo in un flusso costante. Utilizzare una pendenza per ogni provetta da 1,5 ml.
- Trasferimento preraffreddato secchi e centrifugare a 175.000 xg per 2 ore 45 min a 4 ° C, in un'ultracentrifuga (es 32.000 rpm utilizzando un rotore SW41).
- Impostare il sistema di raccolta gradiente come descritto nella figura 1. La cuvetta UV ha un cammino ottico 1 mm.
Figura 1. sistema di raccolta Gradiente. La cuvetta UV è collegato da polivinil cloruro di tubo ad un tubo capillare di vetro che scende verso il fondo del gradiente. Il gradiente procede attraverso il sistema attraverso una pompa peristaltica. OD 260 è continuamente letto e 2 ml frazioni vengono raccolte. Clicca qui per vedere una versione più grandequesta figura.
- Regolare il raccoglitore di frazioni di RT, e impostare il carosello ad una velocità che permetterà la raccolta di 2 ml frazioni. Utilizzare tubi pre-raffreddato di raccolta.
- Raccogliere le frazioni dal basso verso l'alto utilizzando un tubo capillare di vetro collegato da tubi di cloruro di polivinile per il sistema di raccolta gradiente. Utilizzare una pellicola di paraffina in plastica per assicurare il collegamento tra il tubo di cloruro di polivinile e il tubo capillare di vetro.
- Leggere l'assorbanza a 260 nm dal basso verso l'alto del gradiente. Quando l'intero gradiente viene raccolto, posizionare i tubi di raccolta sul ghiaccio prima estrazione di RNA.
4. RNA Estrazione
- Pool frazioni raccolte da due gradienti, in 50 ml con tappo provette da centrifuga, come segue:
Polisomi: frazioni da 1 a 3 (12 ml)
Monosomes: frazione 4 (4 ml)
Surnatante: frazioni 5 e 6 (8 ml) - Per ogni frazione, aggiungere 1 vol. 8M guanidina cloridrato,50 mcg vettore acrilico e 1,5 vol. isopropanolo.
Nota: Acrilico vettore è acrilammide lineare, usato come coprecipitant per migliorare il recupero di acidi nucleici durante la precipitazione alcool. - Miscelare invertendo i tubi e precipitare O / N a -20 ° C.
- Centrifugare a 175.000 xg per 1 ora a 4 ° C, in un'ultracentrifuga (32.000 rpm in un rotore SW32). Se la fase di precipitazione viene eseguita in un tubo che non è compatibile con ultracentrifugazione, trasferire ad un tubo adatto.
- Gettare il surnatante e sciogliere il precipitato in 200 microlitri di buffer TE RNasi-free (10 mM Tris-HCl pH 7,5-1 mM EDTA). Trasferire in una nuova provetta da 1,5 ml.
- Estratto di RNA con l'aggiunta di 1 vol. acqua fenolo saturo (pH 6,6) e 1 vol. cloroformio: alcool isoamilico (24: 1). Mescolare energicamente. Centrifugare a 15.000 xg per 20 min a 4 ° C. Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta da 1,5 ml.
Nota: fenolo acido (pH 4.5) può essere utilizzato per ridurre al minimo la contaminazione del DNA. - Precipitato RNA con l'aggiunta di 1/10 vol. 3 M acetato di sodio e 3 vol. 100% di etanolo. Consentire precipitazioni a -80 ° C per 20 minuti o O / N a -20 ° C. Centrifugare a 15.000 xg per 15 min a 4 ° C.
Nota: Se si usa eparina nel buffer polysome (cfr nota 2.5), eseguire un cloruro di litio (LiCl) la precipitazione invece di precipitazione in etanolo per rimuovere correttamente ogni traccia di eparina che possa interferire con l'analisi a valle 9. Dopo l'estrazione, aggiungere LiCl ad una concentrazione finale di 2,5 M. Lasciar precipitazione per 30 minuti a -20 ° C o O / N a 4 ° C. Centrifugare a 15.000 xg per 15 min a 4 ° C. - Lavare il pellet con 500 microlitri 75% di etanolo. Far asciugare il pellet e sciogliere in 30 microlitri di buffer TE. Valutare la qualità di RNA mediante elettroforesi su un RNasi gratis 1,2% gel (100V, 15 min) o con metodi elettroforesi capillare.
Analisi 5. I dati
- Esportazione dati grezzi ad un software grafico e l'analisi dei dati.
Nota: Come mostrato in Figura 2A e B, i profili grezzi forniscono informazioni qualitative: il numero di picchi polysome che può essere visto, l'altezza del picco monosome, e la presenza di una spalla corrispondente alle subunità ribosomi liberi. - Unire i profili per permettere il confronto dei profili tra i campioni. Utilizzare lo strumento lettore di schermo per determinare il valore X del picco monosome per ogni campione e allineare i picchi monosome rimuovendo punti dati supplementari all'inizio delle curve. Identificare il punto più basso della curva e determinare il valore Y (utilizzando lo strumento di lettore di schermo). Impostare il valore Y punto più basso a 0 utilizzando la funzione "Imposta valore colonne".
- Determinare il rapporto polisomi / monosomes integrando l'area sotto la curva di profili grezzi (Figura 3C). Utilizzare lo strumento di selezione dati per definire il bordo dell'area da integrare. Quindi utilizzare la funzione di integrare (Analisi-matematica).
- Normalizzarele curve a picco monosome dividendo tutti i punti dati di una curva per il valore Y del vertice del picco monosome (determinati utilizzando lo strumento di lettura dello schermo). Selezionare la colonna, poi sotto analisi-matematica, selezionare Normalizza e scegliere le "divise da un valore specificato" metodi. Questo passaggio consente il confronto del livello relativo di polisomi (Figura 3D).
Figura 2. Profili polysome rappresentativi. Arabidopsis thaliana wild-type (WT, ecotipo Col-0) e piantine mutanti sono state coltivate per sei giorni in ½ Murashige e medie Skoog sotto fotoperiodi giorno lunghe (luce 16 ore, 8 ore scure). A: profili polysome prime provenienti da piante WT. B: profili polysome prime provenienti da piante mutanti. C: Determinazione della percentuale di polisomi e monosomes dalla integrazione dell'area sotto la curva D: profi polysomeles normalizzata al picco monosome. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Representative Results
In letteratura, profili polysome sono spesso mostrati dalla frazione leggera alla frazione pesante come una conseguenza del modo gradienti vengono raccolti, cioè dalla parte superiore alla parte inferiore. Poiché nel protocollo descritto qui le pendenze sono raccolti dal basso verso l'alto, i profili mostriamo iniziano con la frazione pesante (i polisomi) e andare alla frazione leggera (subunità libera ribosoma e RNA) (Figura 2A). Abbiamo poi raccogliere ogni sfumatura in sei 2 ml frazioni, ma le frazioni più piccole possono essere raccolti se un'analisi più dettagliata dei contenuti polysome deve essere effettuata.
La fusione e normalizzare le curve a picco monosome (Figura 2D) consente il confronto dei profili di linee diverse o condizioni di crescita. Questo fornisce informazioni sulla quantità relativa di polisomi indipendentemente dal livello di iniziazione. Un altro modo per unnalyze i profili è calcolare l'area sotto la curva, pertanto, si può determinare la quantità relativa di mRNA associata oa le monosomes oi polisomi (Figura 2C). Questo rapporto è specifico per un condizioni dell'impianto e di crescita. Tuttavia, questo approccio non può essere rilevante nel caso di tessuti traduzionale attivi scarsamente.
Abbiamo usato questo metodo per A. le piante intere thaliana, rosette giovani e vecchi, così come per N. benthamiana (Figura 3C), S. lycopersicum (Figura 3E) e O. foglie sativa (Figura 3D). La forma del profilo dipende dalle condizioni di crescita, età della pianta e tessuti analizzati. Qui abbiamo usato A. thaliana sei giorni vecchie piantine. In questa fase, l'attività traduzionale è alto, e il profilo mostra ben picchi sagomati (Figura 2A e B). Questo è anche il casoquando A. thaliana fiori sono utilizzati (Figura 3A). Quando si utilizzano 4 settimane di vita A. thaliana rosette (figura 3b), i campioni contengono per lo più adulto completamente sviluppato lascia in cui le cellule non si dividono. Quindi, l'importo complessivo di polisomi e monosomes è più basso. Il profilo mostra un minor numero, ma ancora ben a forma di picchi polysome. Accanto al picco monosome, la spalla mostra la grande quantità di 60S liberi subunità ribosomiale. Con altri tipi di piante o tessuti, i picchi polysome possono essere appena visibile. Questo è il caso quando si utilizzano 30 giorni O. foglie sativa (Figura 3D). Anche quando la quantità di mRNA coinvolti nella traduzione è molto bassa (nessun picco polysome può essere visto sul profilo), la presenza del picco monosome indica che il frazionamento stata eseguita correttamente e che mRNA possono essere ulteriormente estratte dalla frazione per ulteriori analisi . La qualità della qualità RNA estratto viene valutata mediante elettroforesi su gel di agarosio (
Figura 3. Profili polysome da materiale vegetale diversi e specie. (A) fiori Arabidopsis thaliana (300mg), (B) Arabidopsis thaliana 4 settimane di vita rosette (600mg), (C) Nicotiana benthamiana (foglie giovani di 40 giorni di vita breve di un giorno cresciuto piante - 300mg), (D) Oryza sativa ( foglie di 30 giorni vecchi impianti - 300mg), (E) Solanum lycopersicum (foglie giovani di 35 giorni di vita breve di un giorno cresciuto piante - 300mg). I picchi monosome sono indicati da frecce.iles / ftp_upload / 54231 / 54231fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
. Figura 4. Valutazione della qualità RNA RNA (500 ng estratti da germogli di 6 giorni vecchie piantine di Arabidopsis thaliana) provenienti dalle frazioni indicate sono stati caricati su un gel di agarosio 1,2% e separati mediante elettroforesi (100V - 15 min). Citosolico (25S e 18S) rRNA sono indicati da frecce e cloroplastico (23S e 16S) rRNA da una staffa. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dall'Agenzia Nazionale della Ricerca francese (ANR-14-CE02-0010). Ringraziamo il dottor Benjamin campo e il Dr. Elodie Lanet per la lettura critica del manoscritto. Ringraziamo il Sig Michel Terese per il suo aiuto con il video editing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer - 13.2 ml | Beckman Coulter | 331372 | |
| Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer - 38.5 ml | Beckman Coulter | 326823 | |
| Glass capillary tube | Drummond Scientific | 1-000-1000 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima series | |
| Ultracentrifuge Rotor SW41 | Beckman Coulter | 331362 | |
| Ultracentrifuge Rotor SW32 | Beckman Coulter | 369650 | |
| Peristaltic pump | Any | ||
| Tygon R3607 polyvinyl chloride tubing | Fisher Scientific | 070534-22 | Polyvinyl chloride tubing, 2.29 mm |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-Rad | 731-8120 | |
| UV cuvette | Hellma | 170.700-QS | Quartz flow-through cuvette |
| UV Spectrophotometer | Varian | Cary50 | Read every 0.0125 sec |
| All chemicals | Any | Use only Molecular Biology Grade | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| Rnase-Free water | Any | ||
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 10083251 | |
| Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol, branched (Nonidet P40) | Euromedex | UN3500 | |
| Linear acrylamide (acryl carrier) | ThermoFischer scientific | AM9520 | RNA precipitation carrier |
| OriginPro 8 | OriginLab | Analysis software |
References
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