Introduction
Proteinsyntese er en viktig og energimessig kostbar prosess i alle celler 1. Først av alt må investere celler energi i produksjonen av oversettelsen maskineri, ribosomene. For eksempel et aktivt delende gjærcelle som produserer så mye som 2000 ribosomer pr minutt. En slik produksjon krever opp til 60% av den totale transkripsjonen aktivitet og opp til 90% av den totale aktivitet spleising av cellen 2. I tillegg er energien som kreves for syntesen av aminosyrer, aminoacyl-tRNA og peptidbindinger. I planter, tilsetning av en aminosyre til en peptidkjede koster fra 4,5 til 5,9 molekyler av ATP 3. Derfor er det ikke overraskende at translasjonen av mRNA til protein er et hovedsete for regulering, særlig når det gjelder å håndtere endrede miljøforhold.
Innvielsen trinn i oversettelsen, som er foreningen av et mRNA med ribosomet, er det viktigste målet for reguleringen avoversettelse fire. Som en konsekvens av regulering av translasjon, så vel som andre post-transkripsjonelle regulatoriske trinn, kan bare 40% av variasjonen i proteinkonsentrasjon forklares ved mRNA-overflod 5,6. Dermed studiet av total mRNA gir relativt dårlig informasjon om protein overflod. På den annen side, foreningen av mRNA med ribosomer gir bedre innsikt i protein overflod ved å gi tilgang til disse mRNA involvert i oversettelsen. Aktivt oversatte mRNA er forbundet med flere ribosomer i strukturer kalt polysomes. Omvendt vil dårlig oversatte mRNA være forbundet med bare en ribosom (monosome). Følgelig kan den translatoriske status for et mRNA bli evaluert ved å overvåke sin tilknytning til ribosomer 7.
Denne protokollen beskriver isoleringen av polysomes fra seks dager gamle Arabidopsis thaliana planter, den etterfølgende isolering av RNA, og analyse av resultatene. Polysomes og monosomes skilles gjennom en sukrose tettshetsgradient. Gradienter er samlet inn i seks fraksjoner. Noen av fraksjonene slås sammen for å oppnå tre godt separerte fraksjoner: polysomes, monosomes og lettfraksjonen (heretter kalt supernatant), som inneholder frie 60S og 40S ribosomale subenheter og mRNA som ikke er forbundet med ribosomer. Global oversettelse aktivitet kan estimeres ved å generere et polysome / monosome-forhold, som bestemmes ved integrering av arealet under kurven, og ved å sammenligne polysomes profiler. mRNA og proteiner blir så trukket ut fra de forskjellige fraksjoner og anvendt for analyse ved hjelp av RT-PCR, QRT-PCR, Northern blot, mikromatriser, western blot eller proteomikk. Denne protokollen er validert for andre planter og vev.
Utstyret som kreves for å utføre denne protokollen er ofte funnet i de fleste laboratorier: Det er ikke behov for en gradient maker. Frysing hvert lag før du legger den neste hindres fra en blanding eller forstyrrelse av lagene. Ingen rør gjennomtrenger benyttes for samling gradient som kan oppnås ved neddykking av et glass kapillarrør i gradienten. Derfor er de kostbare ultrasentrifuge-rør forbli uskadet og kan brukes om igjen mange ganger. Samlet gjør dette til den nåværende protokollen en enkel og billig metode for polysome profilering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av 20 til 50% (w / v) sukrosegradienter
Merk: gradienter er laget av 4 lag sukrose (50%, 35% og 2 lag med 20%) i en 13,2 ml ultrasentrifuge tube. I vår erfaring, helle 20% sukrose i to separate lag forbedrer kvaliteten på polysome forberedelser.
- Forbered lager løsninger. Sørg for at alle løsninger er RNase og DNAse gratis.
- Forbered 10X Salt Solution: 400 mM Tris-HCl pH 8,4, 200 mM KCI og 100 mM MgCl2.
- Forbered to M Sukrose Løsning: For 200 ml, oppløse 137 g sukrose i 1X Salt Solution.
- Fortynn sukroseløsning i saltoppløsning, som beskrevet i tabell 1, for å fremstille gradienter. Volumene er gitt for seks stigninger.
| Endelig sukrose konsentrasjon | sukrose 2M (ml) | Saltoppløsning (1X ml) | Endelig Vol. (ml) |
| 50% | 8.8 | 3.2 | 12 |
| 35% | 12.9 | 12.1 | 25 |
| 20% | 7.4 | 17.6 | 25 |
| 20% | 5.8 | 14.2 | 20 |
Tabell 1. Fortynninger av Sukrose Løsning å forberede seks stigninger.
- Hell lagene som per tabell 2.
| sukrose lag | 50% | 35% | 20% | 20% |
| Vol. (Ml) | 1,85 | 3,65 | 3.65 | 1,35 |
Tabell 2. Volum av sukrose løsning per lag.
- Etter å strømme hvert lag, holde rørene i et -40 ° C eller -80 ° C fryser inntil fullstendig frysing før tilsetning av det neste lag sukrose. Frysing blir vanligvis oppnådd etter 2 timer ved -40 ° C, men venter på omtrent 6 timer før helling av neste lag anbefales. De siste 20% sjiktet kan fryses eller tilsettes ferskt på dagen for eksperimentet.
Merk: Frysing hvert lag før tilsetning av den neste forhindrer fra en hvilken som helst blanding eller forstyrrelse av lagene. Gradienter kan holdes i en -40 ° C eller -80 ° C fryser i minst seks måneder. - Dersom det ikke allerede er gjort, legger de siste 20% sjiktet til gradientene på dagen for eksperimentet. Deretter la gradienter tine opp i et kaldt rom eller et kjøleskap.
2. Utarbeidelse av cytosoliske Ekstrakter
Merk: Vi anbefalende med to stigninger per biologisk prøve. 300 mg er den optimale mengden av plantemateriale for å forberede to gradienter når du arbeider med 6 dager gamle vårskrinneblom frøplanter. Når du arbeider med mindre translatorisk aktive vev, kan mengden av plantemateriale økes opp til 600 mg.
- Slakte seks dager gamle frøplanter dyrket på ½ Murashige og Skoog 8 medium supplert med 1% sukrose eller tilsvarende medier ved hurtig frysing i flytende nitrogen
- Grind plantemateriale i en forhåndskjølt morter med flytende nitrogen.
- Vei 300 mg pulverisert materiale i en forkjølt veiing parabolen. Utføre dette trinnet raskt for å unngå tining av prøven.
Merk: Hold frosne prøvene for ikke mer enn en uke i en -80 ° C fryser. - Legg 2,4 ml forkjølt polysome buffer (Salt Solution 4X, 5,26 mM EGTA, 0,5% (v / v) Octylphenoxy poly (etylenoksy) etanol, forgrenede, 50 μg.ml -1 cykloheksimid, 50 μg.ml 1kloramfenikol) og homogeniseres ved blanding med pipettespissen. Overfør til to 1,5 ml rør. Arbeid raskt for å hindre at prøvene fra oppvarming.
- Sentrifuger ved 16000 x g i 15 min ved 4 ° C i en mikrosentrifuge for å pelletisere rusk.
Merk: For å forhindre RNA degradering, alltid holde prøvene ved 4 ° C, bruker RNase / DNase frie løsninger og arbeid i RNase / DNase frie forhold. Heparin kan bli lagt til polysome buffer, til en sluttkonsentrasjon på 300 μg.ml -1, for å forbedre RNA beskyttelse. Men siden heparin kan forstyrre nedstrøms analyse, vil den måtte bli fjernet i løpet av RNA utfellingstrinnet ved å utføre litiumklorid utfelling i stedet for etanolfelling (se note 4,7).
3. Polysome Profilering
- pipette forsiktig supernatanten uten å forstyrre pelleten. Hvis plantefragmenter har blitt pipettert, gjenta trinn 2.5. Last supernatanten på toppen av gradienten ved forsiktig pipetting på sideveggen av røret i en konstant strøm. Bruk en gradient for hver 1,5 ml tube.
- Overføring til foravkjølt bøtter og sentrifuger ved 175 000 xg i 2 timer 45 minutter ved 4 ° C i en ultrasentrifuge (f.eks 32000 rpm ved bruk av en SW41 rotor).
- Sett opp gradient innsamlingssystemet som beskrevet i figur 1. UV Kyvetten har en 1 mm veilengde.
Figur 1. Gradient oppsamlingssystem. UV Kyvetten er forbundet med polyvinylklorid slangen til et glass kapillarrør som går ned til bunnen av gradienten. Stigningen utvikler seg gjennom systemet takket være en peristaltisk pumpe. OD 260 er kontinuerlig lese og 2 ml fraksjoner samles. Klikk her for å se en større versjon avdette tallet.
- Juster fraksjonssamleren til romtemperatur og satt karusellen med en hastighet som vil tillate innsamling av 2 ml fraksjoner. Bruk forhåndskjølte samling rør.
- Samle fraksjonene fra bunn til topp ved bruk av et glass kapillarrør forbundet ved hjelp av polyvinylklorid slangen til gradienten oppsamlingssystem. Bruke en plastfilm parafin for å sikre forbindelsen mellom polyvinylklorid røret og glass kapillarrør.
- Les absorbansen ved 260 nm fra bunnen til toppen av gradienten. Når hele gradient samles, plasserer oppsamlingsrørene på isen før RNA ekstraksjon.
4. RNA Utvinning
- Pool fraksjonene samlet fra to graderinger, i 50 ml avkortet sentrifugerør, som følger:
Polysomes: Fraksjonene 1 til 3 (12 ml)
Monosomes: Fraksjon 4 (4 ml)
Supernatant: Fraksjonene 5 og 6 (8 ml) - Til hver fraksjon, legg en vol. 8M guanidinhydroklorid,50 mikrogram akryl transportør og 1,5 vol. isopropanol.
Merk: Acryl bæreren er lineær akrylamid, anvendes som en coprecipitant for å øke utvinningen av nukleinsyrer ved alkoholutfelling. - Bland ved å snu rørene og utfelle O / N ved -20 ° C.
- Sentrifuger ved 175 000 xg i 1 time ved 4 ° C i en ultrasentrifuge (32 000 rpm i en SW32 rotor). Hvis felletrinn blir utført i et rør som ikke er forenlig med ultrasentrifugering, overføring til et egnet rør.
- Fjern supernatant og oppløse pelleten i 200 pl RNase-fritt TE-buffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5 til 1 mM EDTA). Overføring til en frisk 1,5 ml tube.
- Ekstrahere RNA ved tilsetning av 1 vol. vannmettet fenol (pH 6,6) og 1 vol. kloroform: isoamylalkohol (24: 1). Bland kraftig. Sentrifuger ved 15000 x g i 20 min ved 4 ° C. Overfør den vandige fase i et nytt 1,5 ml rør.
Merk: Syre fenol (pH 4,5) kan brukes for å redusere DNA-kontaminering. - Fremskynde RNA ved å legge til 1/10 vol. 3 M natriumacetat og 3 vol. 100% etanol. Tillate utfelling ved -80 ° C i 20 minutter eller O / N ved -20 ° C. Sentrifuger ved 15000 x g i 15 min ved 4 ° C.
Merk: Hvis du bruker heparin i polysome buffer (jf note 2.5), utføre et lithium klorid (LiCl) nedbør i stedet for etanol nedbør til riktig fjerne ethvert spor av heparin som kan forstyrre nedstrømsanalyse 9. Etter ekstraksjon legge LiCl til en sluttkonsentrasjon på 2,5 M. tillate utfelling i 30 minutter ved -20 ° C eller O / N ved 4 ° C. Sentrifuger ved 15000 x g i 15 min ved 4 ° C. - Vask pelleten med 500 mL 75% etanol. Air tørke pellet og oppløses i 30 ul TE buffer. Bedømme RNA kvalitet ved elektroforese på en RNAse fri 1,2% agarose-gel (100 V, 15 min), eller ved kapillær elektroforese metoder.
5. Data Analysis
- Eksport rådata til en grafisk og dataanalyse programvare.
Notat: Som vist i figur 2A og B, kan de rå profilene gir kvalitativ informasjon: antall polysome topper som kan sees, høyden på monosome topp, og nærværet av en skulder som svarer til de frie ribosom-subenheter. - Slå sammen profiler for å tillate sammenligning av profiler mellom prøvene. Bruk skjermleser verktøyet for å bestemme X verdien av monosome topp for hver prøve og justere monosome toppene ved å fjerne ekstra datapunkter i begynnelsen av kurvene. Identifisere det laveste punktet av kurven og bestemme dets Y-verdi (ved hjelp av skjermleser verktøyet). Sett det laveste punktet Y-verdien til 0 ved å bruke "settkolonnene verdi" -funksjon.
- Bestem polysomes / monosomes forholdet ved å integrere arealet under kurven fra rå profiler (Figur 3C). Bruke datavelgeren verktøyet for å definere grensen av området som skal integreres. Bruk deretter integrere funksjonen (analyse-matematikk).
- normal~~POS=TRUNCkurvene til monosome peak ved å dele alle datapunktene i en kurve ved Y-verdien for toppen av monosome peak (fastsatt ved bruk av skjermleser verktøyet). Velg kolonnen, deretter under Analysis-matematikk, velg Normal og velge "delt av en angitt verdi" metoder. Dette trinnet kan sammenligne det relative nivået av polysomes (figur 3D).
Figur 2. Representative polysome profiler. Arabidopsis thaliana villtype (wt, ecotype Col-0) og mutante frøplanter ble dyrket i seks dager på ½ Murashige og Skoog medium under lang dag fotoperioder (16 timer lys, 8 timers mørke). A: rå polysome profiler fra wt frøplanter. B: rå polysome profiler fra mutant frøplanter. C: Bestemmelse av prosentandelen av polysomes og monosomes ved integrering av arealet under kurven D: Polysome profiles normalisert til monosome topp. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I litteraturen blir polysome profilene ofte vist fra den lette fraksjonen av den tunge fraksjonen som et resultat av måten gradientene blir samlet inn, det vil si fra toppen til bunnen. Siden i protokollen beskrevet her gradienter er samlet fra bunnen til toppen, profilene vi viser starte med den tunge fraksjonen (de polysomes) og gå til den lette fraksjonen (gratis ribosom subenheter og RNA) (figur 2A). Vi samler deretter hver gradient i seks 2 ml fraksjoner, men mindre fraksjoner kan samles opp hvis en mer detaljert analyse av polysome innhold må utføres.
Sammenslåing og normalisering av kurvene til monosome topp (figur 2D) tillater sammenligning av profiler fra forskjellige linjer eller vekstbetingelser. Dette gir informasjon om den relative mengden av polysomes uavhengig av nivået på innvielsen. En annen måte til ennalyze profilene er å beregne arealet under kurven, således kan man bestemme den relative mengde av mRNA forbundet med enten monosomes eller polysomes (figur 2C). Dette forholdet er spesifikk for en plante og vekstvilkår. Imidlertid kan denne fremgangsmåten ikke være relevant i tilfelle av dårlig translatorisk aktive vev.
Vi har brukt denne metoden til A. thaliana hele frøplanter, unge og gamle rosetter, samt for N. benthamiana (figur 3C), S. lycopersicum (figur 3E) og O. sativa blader (Figur 3D). Profilformen er avhengig av vekstbetingelsene, plantealder og vev analysert. Her har vi brukt A. thaliana seks dager gamle frøplanter. På dette stadium er det translasjonelle aktivitet høy, og profilen viser vel formede topper (figur 2A og B). Dette er også tilfelletnår A. thaliana blomster brukes (figur 3A). Ved bruk av 4 uker gammel A. thaliana rosetter (Figur 3B), prøvene stort sett inneholde fullt utviklet voksen blader der cellene ikke dele. Derfor er den totale mengden av polysomes og monosomes er lavere. Profilen viser færre, men fortsatt godt formet polysome topper. Ved siden av monosome topp, viser skulder den store mengden av frie 60S ribosomale underenhetene. Med andre slags planter eller vev, kan polysome toppene være knapt synlig. Dette er tilfelle ved bruk av 30 dager gamle O. sativa blader (Figur 3D). Selv når mengden av mRNA som er involvert i oversettelse er meget lavt (ingen polysome topp kan sees på profilen), nærværet av monosome topp angir at fraksjoneringen er riktig gjort, og at mRNA kan bli ytterligere ekstrahert fra fraksjonen for videre analyse . Kvaliteten av ekstrahert RNA kvalitet bedømmes ved hjelp av agarose-gel-elektroforese (
Figur 3. Polysome profiler fra forskjellige plantemateriale og plantearter. (A) vårskrinneblom blomster (300mg), (B) vårskrinneblom 4 uker gamle rosetter (600mg), (C) Nicotiana benthamiana (unge blader av 40 dager gamle kort dag dyrket planter - 300mg), (D) Oryza sativa ( blader av 30 dager gamle planter - 300mg), (E) Solanum lycopersicum (unge bladene av 35 dager gamle kort dag dyrket planter - 300mg). De monosome toppene er angitt med piler.iles / ftp_upload / 54231 / 54231fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
. Figur 4. Vurdering av RNA kvalitet RNA (500 ng hentet fra skudd på 6 dager gamle vårskrinneblom stiklinger) fra de angitte fraksjoner ble lastet på en 1,2% agarosegel og atskilt med elektroforese (100V - 15 min). Cytosolic (25S og 18S) rRNA er indikert med piler og chloroplastic (23S og 16S) rRNA av en brakett. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av den franske National Research Agency (ANR-14-CE02-0010). Vi takker Dr Benjamin Field og Dr. Elodie Lanet for kritisk lesing av manuskriptet. Vi takker Mr. Michel Terese for hans hjelp med videoredigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer - 13.2 ml | Beckman Coulter | 331372 | |
| Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer - 38.5 ml | Beckman Coulter | 326823 | |
| Glass capillary tube | Drummond Scientific | 1-000-1000 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima series | |
| Ultracentrifuge Rotor SW41 | Beckman Coulter | 331362 | |
| Ultracentrifuge Rotor SW32 | Beckman Coulter | 369650 | |
| Peristaltic pump | Any | ||
| Tygon R3607 polyvinyl chloride tubing | Fisher Scientific | 070534-22 | Polyvinyl chloride tubing, 2.29 mm |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-Rad | 731-8120 | |
| UV cuvette | Hellma | 170.700-QS | Quartz flow-through cuvette |
| UV Spectrophotometer | Varian | Cary50 | Read every 0.0125 sec |
| All chemicals | Any | Use only Molecular Biology Grade | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| Rnase-Free water | Any | ||
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 10083251 | |
| Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol, branched (Nonidet P40) | Euromedex | UN3500 | |
| Linear acrylamide (acryl carrier) | ThermoFischer scientific | AM9520 | RNA precipitation carrier |
| OriginPro 8 | OriginLab | Analysis software |
References
- Nelson, C. J., Millar, A. H.
- Warner, J. R. The economics of ribosome biosynthesis in yeast. Trends Biochem Sci. 24 (11), 437-440 (1999).
- Amthor, J. S. The McCree-de Wit-Penning de Vries-Thornley Respiration Paradigms: 30 Years Later. Ann Bot. 86 (1), 1-20 (2000).
- Preiss, T., W Hentze, M. Starting the protein synthesis machine: eukaryotic translation initiation. BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 25 (12), 1201-1211 (2003).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2013).
- Baerenfaller, K., et al. Genome-scale proteomics reveals Arabidopsis thaliana gene models and proteome dynamics. Science. 320 (5878), 938-941 (2008).
- Zanetti, E., Chang, I., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. Immunopurification of Polyribosomal Complexes of Arabidopsis for Global Analysis of Gene Expression. Plant physiol. 138 (2), 624-635 (2005).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. A. Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments. RNA. 13 (3), 414-421 (2007).
- Arabidopsis protocols. Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J. , Methods in molecular biology; 323. Clifton, N.J. (2006).
- Piques, M., et al. Ribosome and transcript copy numbers, polysome occupancy and enzyme dynamics in Arabidopsis. Mol syst biol. 5 (314), 314 (2009).
- Morita, M., Alain, T., Topisirovic, I., Sonenberg, N.
- Yángüez, E., Castro-Sanz, A. B., Fernández-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress. PloS One. 8 (8), (2013).
- Sormani, R., et al. Sublethal cadmium intoxication in Arabidopsis thaliana impacts translation at multiple levels. Cell Physiol. 52 (2), 436-447 (2011).
- Lanet, E., et al. Biochemical evidence for translational repression by Arabidopsis microRNAs. Plant cell. 21 (6), 1762-1768 (2009).
- Jabnoune, M., Secco, D., Lecampion, C., Robaglia, C., Shu, Q., Poirier, Y. A Rice cis-Natural Antisense RNA Acts as a Translational Enhancer for Its Cognate mRNA and Contributes to Phosphate Homeostasis and Plant Fitness. Plant cell. 25 (10), 4166-4182 (2013).
- Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. Methods Enzymol. 470 (10), Elsevier Inc. (2010).
- Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis. PNAS. 111 (1), 203-212 (2013).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
