Introduction
Синтез белка является одним из важнейших и энергетически дорогостоящий процесс во всех клетках 1. Во-первых, клетки должны вкладывать энергию в производстве переводческой техники, рибосом. Например активно деления клетки дрожжей производит целых 2000 рибосомы в минуту. Такое производство требует до 60% от общей транскрипционной активности и до 90% от общей сплайсинга активности клетки 2. Кроме того, энергия необходима для синтеза аминокислот, аминоацил-тРНК и пептидных связей. В растениях, при добавлении одной аминокислоты в пептидной цепи расходов от 4,5 до 5,9 молекул АТФ 3. Поэтому не удивительно, что перевод мРНК в белок является основным местом регулирования, в частности, когда речь идет о борьбе с изменением условий окружающей среды.
Стадия инициирования перевода, то есть объединение мРНК с рибосомой, является основной целью регулированияперевод 4. В результате регулирования перевода, а также других пост-транскрипционных регуляторных мер, только 40% от изменений в концентрации белка можно объяснить мРНК обилии 5,6. Таким образом, изучение общей мРНК дает относительно плохую информацию о белковой изобилии. С другой стороны, объединение мРНК с рибосомами дает лучшее понимание белка изобилия, давая доступ к этим участвующих в мРНК перевода. Активно переводные мРНК связаны с несколькими рибосомами в структурах, называемых полисом. И наоборот, плохо переводятся мРНК будет связан только с одной рибосомой (monosome). Следовательно, трансляционный статус мРНК может быть оценена путем мониторинга его ассоциации с рибосомами 7.
Этот протокол описывает выделение полисом от шести дней Резуховидка Таля рассады, последующим выделением РНК, а также анализ полученных результатов. Polysomes и monosomes разделены с помощью градиента плотности сахарозы. Градиенты собирают на шесть фракций. Некоторые из фракции объединяют, чтобы получить три хорошо разделенных фракций: полисом, monosomes и легкой фракции (далее называется супернатанта), который содержит свободные 60S и 40S рибосомных субъединиц и мРНК, которые не связаны с рибосомами. Глобальная активность перевода может быть оценена путем генерации / соотношение monosome полисом, которая определяется интегрированием площади под кривой, и путем сравнения профилей полисом. мРНК и белки, затем извлекают из различных фракций и использовали для анализа с помощью ОТ-ПЦР, QRT-ПЦР, нозерн-блоттинга, микрочипов, вестерн-блоттинга или протеомики. Этот протокол был одобрен для других растений и тканей.
Оборудование, необходимое для выполнения этого протокола, как правило, в большинстве лабораторий: Там нет необходимости для градиентной производителя. Замораживание каждый слой перед добавлением следующий предотвратитьs из любого сочетания или нарушение слоев. Ни одна трубка пробойник не используется для градиентной сбора, которое может быть достигнуто путем погружения стеклянной капиллярной трубки в градиенте. Таким образом, дорогостоящие ультрацентрифуг трубки остаются неповрежденными и могут быть повторно использованы много раз. В совокупности это делает настоящий Протокол легкий и дешевый способ для профилирования полисом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Приготовление 20 до 50% (вес / объем) сахарозы Градиенты
Примечание: градиенты состоят из 4-х слоев сахарозы (50%, 35% и 2-х слоев 20%) в 13,2 мл ультрацентрифуге трубки. По нашему опыту, выливая 20% сахарозы в двух отдельных слоев значительно улучшает качество полисом препаратов.
- Готовят растворы. Убедитесь в том, что все решения РНКазы и ДНКазы бесплатно.
- Подготовить 10X солевой раствор: 400 мМ Трис-HCl рН 8,4, 200 мМ KCl и 100 мМ MgCl 2.
- Подготовьте 2 М раствор сахарозы: Для 200 мл, растворяют 137 г сахарозы в 1X солевом растворе.
- Разбавляют раствор сахарозы в солевом растворе, как описано в таблице 1, чтобы подготовить градиенты. Объемы приведены для шести градиентов.
| Конечная концентрация сахарозы | Сахароза 2М (мл) | Солевой раствор 1X (мл) | Final Vol. (мл) |
| 50% | 8,8 | 3.2 | 12 |
| 35% | 12,9 | 12.1 | 25 |
| 20% | 7.4 | 17.6 | 25 |
| 20% | 5.8 | 14.2 | 20 |
Таблица 1. Разведения сахарозу раствора , чтобы подготовить шесть градиентов.
- Залить слои в соответствии с таблицей 2.
| Сахароза слой | 50% | 35% | 20% | 20% |
| Том (Мл) | 1,85 | 3,65 | 3.65 | 1,35 |
Таблица 2. Объем раствора сахарозы на слой.
- После заливки каждого слоя, держите пробирки в -40 ° C или -80 ° C морозильнике до полного замерзания перед добавлением следующего слоя сахарозы. Замораживание обычно достигается через 2 ч при -40 ° С, но дать просохнуть примерно 6 ч перед заливкой следующего слоя рекомендуется. Последние 20% слой может быть заморожен или добавлены свежеприготовленные на день эксперимента.
Примечание: Замораживание каждый слой перед добавлением следующего одного предотвращает от любого смешивания или нарушения слоев. Градиенты могут храниться в -40 ° C или -80 ° C морозильнике в течение не менее шести месяцев. - Если это еще не сделано, добавьте последние 20% слой градиентов на день эксперимента. Тогда, пусть градиенты оттаивать в холодной комнате или холодильником.
2. Получение цитозольных экстрактов
Примечание: Мы рекомв конечном использованием двух градиентов за биологического образца. 300 мг , это оптимальное количество растительного материала для подготовки двух градиентов при работе с 6 дней Резуховидка Таля саженцев. При работе с меньшим количеством поступательно активных тканей, количество растительного материала, может быть увеличена до 600 мг.
- Урожай Шестидневной сеянцы , выращенные на ½ Мурашига и Скуга 8 среде с добавлением 1% сахарозы или эквивалентного средств массовой информации путем быстрого замораживания в жидком азоте
- Измельчить растительный материал в предварительно охлажденный ступки и пестика с жидким азотом.
- Взвесьте 300 мг порошкообразного материала в предварительно охлажденном чашу весов. Выполните этот шаг быстро, чтобы избежать размораживания образца.
Примечание: Хранить замороженные образцы не более чем на одну неделю в C морозильной камере -80 °. - Добавить 2,4 мл предварительно охлажденной буфера полисом (солевой раствор 4Х, 5,26 мМ EGTA, 0,5% (об / об) октилфенокси поли (этиленокси) этанол, разветвленным, 50 μg.ml -1 циклогексимид, 50 μg.ml 1хлорамфеникол) и гомогенизируют путем смешивания с наконечником пипетки. Перевести на две 1,5 мл пробирки. Работают быстро, чтобы предотвратить образцы от потепления.
- Центрифуга при 16000 х г в течение 15 мин при 4 ° С в микроцентрифуге для осаждения обломков.
Примечание: Для предотвращения деградации РНК, всегда держать образцы при температуре 4 ° C, используйте РНКазы / ДНКазы решений и работы в РНКазы / ДНКазы условиях. Гепарин может быть добавлен в буфер полисом, до конечной концентрации 300 μg.ml -1, для усиления защиты РНК. Тем не менее, так как гепарин может препятствовать вниз по течению анализа, должны быть удалены в ходе РНК-стадии осаждения путем выполнения литиевую осаждение хлорида вместо осаждения этанолом (см примечание 4.7).
3. полисом профилирование
- Тщательно пипеткой супернатант, не нарушая гранул. Если фрагменты растений были пипеткой, повторите шаг 2.5. Загрузите супернатанта на верхней части градиента, осторожно pipettinг на боковой стенке трубы в постоянном потоке. Используйте один градиент для каждого 1,5 мл трубки.
- Переход к предварительно охлажденному ведра и центрифуге при 175000 х г в течение 2 ч 45 мин при температуре 4 ° С, в ультрацентрифуге (например, 32 000 оборотов в минуту при использовании ротора SW41).
- Настройка градиента системы сбора , как описано на рисунке 1. УФ кювета имеет 1 мм длины пути.
Рисунок 1. Градиент Система сбора. УФ - кювета соединяется поливинилового трубки хлорида в капиллярной трубке стекла , который нисходит в нижней части градиента. Градиент прогрессирует через систему благодаря перистальтического насоса. OD 260 непрерывно читать и 2 мл фракции собирают. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версиюэта фигура.
- Отрегулируйте коллектор фракций до комнатной температуры и установите карусель со скоростью, которая позволит обеспечить сбор 2 мл фракции. Используйте предварительно охлажденные пробирки для сбора.
- Собирают фракции, снизу вверх с помощью стеклянной капиллярной трубки, соединенные трубкой поливинилхлоридной к градиентной системы сбора. С помощью пластиковой парафиновой пленки, чтобы обеспечить соединение между трубкой поливинилхлоридной и стеклянной капиллярной трубки.
- Измерить оптическую плотность при 260 нм от дна до верхней части градиента. Когда весь градиент собирают, поместите пробирки для сбора на льду до экстракции РНК.
4. Экстракция РНК
- Объединяют фракции, собранные из двух градиентов в 50 мл центрифужные пробирки крышками, следующим образом:
Полисом: фракции от 1 до 3 (12 мл)
Monosomes: фракция 4 (4 мл)
Супернатанта: Фракции 5 и 6 (8 мл) - Для каждой фракции, добавьте 1 об. 8M гуанидин гидрохлорид,50 мкг акрила носитель и 1,5 т. изопропиловый спирт.
Примечание: Акрил носитель представляет собой линейный акриламид, используемый в качестве соосадителя для улучшения восстановления нуклеиновых кислот во время осаждения спиртом. - Смешайте переворачиванием пробирки и осадить O / N при -20 ° С.
- Центрифуга на 175000 мкг в течение 1 ч при 4 ° С, в ультрацентрифуге (32000 оборотов в минуту в роторе SW32). Если стадию осаждения проводят в трубе, не совместимого с ультрацентрифугирования, переносят в подходящую трубу.
- Удалите супернатант и растворить осадок в 200 мкл РНКазы ТЕ-буфера (10 мМ Трис-HCl, рН 7,5 - 1 мМ ЭДТА). Передача в свежую 1,5 мл трубки.
- Извлечение РНК путем добавления 1 об. насыщенный водой фенола (рН 6,6) и 1 об. хлороформ: изоамиловый спирт (24: 1). Смешайте энергично. Центрифуга при 15000 х г в течение 20 мин при температуре 4 ° С. Перенести водную фазу к новой 1,5 мл трубки.
Примечание: Кислотный фенол (рН 4,5) может быть использован для того, чтобы сводить к минимуму загрязнение ДНК. - Осаждени РНК путем добавления 1/10 об. 3 М ацетата натрия и 3 об. 100% -ного этилового спирта. Разрешить осаждение при -80 ° С в течение 20 мин или O / N при -20 ° С. Центрифуга при 15000 х г в течение 15 мин при температуре 4 ° С.
Примечание: При использовании гепарин в полисом буфере (см примечание 2.5), выполнить хлорид лития (LiCl) осаждение вместо осаждения этанолом правильно удалить любые следы гепарина , которые могли бы помешать ходу анализа 9. После экстракции, добавляют LiCl до конечной концентрации 2,5 М. Разрешить осаждение в течение 30 мин при -20 ° C или O / N при 4 ° С. Центрифуга при 15000 х г в течение 15 мин при температуре 4 ° С. - Вымойте гранул с 500 мкл 75% этанола. Воздух сухой осадок и растворяют в 30 мкл ТЕ-буфера. Оценка качества РНК с помощью электрофореза на РНКазы 1,2% -ном агарозном геле (100В, 15 мин), либо методами капиллярного электрофореза.
5. Анализ данных
- Экспорт необработанных данных в графическом и анализа данных программного обеспечения.
Заметка: Как показано на рисунке 2А и В, исходные профили дают качественную информацию: число пиков полисом , который можно увидеть, высота пика monosome, а также наличие плеча , соответствующих свободных рибосом субъединиц. - Слияние профилей для возможности сравнения профилей между образцами. Используйте инструмент для чтения с экрана, чтобы определить значение X пика monosome для каждого образца и выровнять пики monosome путем удаления дополнительных точек данных в начале кривых. Определить самую нижнюю точку кривой и определить ее значение Y (с помощью инструмента чтения с экрана). Установите самую низкую точку значение Y на 0, используя функцию "набор столбцов значение".
- Определить отношение полисом / monosomes интегрированием площади под кривой от сырьевых профилей (рис 3C). С помощью инструмента выбора данных для определения границы области быть интегрированы. Затем с помощью функции интеграции (анализ-математический факультет).
- нормироватькривые к пику monosome путем деления всех точек данных на кривой на величину Y на вершине пика monosome (определяется с помощью инструмента чтения с экрана). Выберите столбец, затем в разделе Analysis-математики, выберите Normalize и выбрать "Разделенные по заданному значению" методы. Этот шаг позволяет проводить сравнение относительного уровня полисом (Рисунок 3D).
Рисунок 2. Типичные профили полисом. Резуховидка Таля дикого типа (вес, экотипа Col-0) и мутантные рассаду выращивали в течение шести дней на ½ Мурашига и Скуга под длинный день фотопериодах (16 ч света, 8 ч темноты). A: сырые полисом профили из вес проростков. B: необработанные профили полисом из мутантных проростков. С: Определение процентного содержания полисом и monosomes интегрированием площади под кривой D: полисом Profiле нормализованы к пику monosome. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В литературе, полисом профили часто показывают из легкой фракции в тяжелой фракции, в результате пути градиенты собираются, то есть от верха до низа. Так как в протоколе , описанном здесь градиенты собраны от дна к вершине, профили мы показываем начать с тяжелой фракции (полисом) и перейти к легкой фракции (свободный рибосом субъединиц и РНК) (рис 2А). Затем мы собираем каждый градиент в шести 2 мл фракции, но более мелкие фракции могут быть собраны, если более детальный анализ содержания полисом должен быть выполнен.
Слияние и нормализации кривых к пику monosome (рис 2D) позволяет сравнивать профили из разных линий или условий роста. Это обеспечивает информацию об относительном количестве полисом независимо от уровня возбуждения. Другой способ кnalyze профили, чтобы вычислить площадь под кривой, таким образом, можно определить относительное количество мРНК , связанной либо с monosomes или полисом (фиг.2с). Это отношение является характерным для растений и условий роста. Однако такой подход не может быть актуальным в случае плохо поступательно активных тканей.
Мы использовали этот метод для А. thaliana целые сеянцы, молодые и старые розетки, а также для N. benthamiana (3С), С. Lycopersicum (рис 3E) и O. Sativa листья (рис. 3D) Форма профиля зависит от условий роста, возраста растений и тканей проанализированы. Здесь мы использовали А. thaliana шесть дней сеянцы. На данном этапе, поступательная активность высока, а профиль хорошо показывает фасонных пики (фиг.2А и В). Это также случайкогда А. thaliana цветы используются (рисунок 3а). При использовании 4 недель А. thaliana розетки (рис 3B), образцы содержат в основном полностью развитые взрослые листья , где клетки не делятся. Следовательно, общее количество полисом и monosomes ниже. Профиль показывает меньше, но все же хорошо сформированные пики полисом. Рядом с пиком monosome, плечо показывает большое количество свободных 60S субъединицами рибосом. С помощью другого вида растений или тканей, пики полисом могут быть едва заметны. Это тот случай , при использовании 30 дней O. Sativa листья (рис. 3D) Даже когда количество мРНК участвует в переводе очень низкий (отсутствует пик полисом можно увидеть на профиле), наличие пика monosome указывает на то, что фракционирование сделано надлежащим образом и что мРНК могут быть дополнительно извлечены из фракции для дальнейшего анализа , Качество извлеченной качества РНК оценивали с помощью электрофореза в агарозном геле (
Рисунок 3. полисом профили из различных материалов и видов растений. (A) Резуховидка Таля цветы (300 мг), (B) Резуховидка Таля 4 недели розетками (600 мг), (C) Nicotiana benthamiana (молодые листья 40 дней короткий день выращенных растений - 300 мг), (D) Oryza Sativa ( листья 30 дней старые растения - 300 мг), (Е) Solanum Lycopersicum (молодые листья 35 дней старые короткий день выращенных растений - 300 мг). Пики monosome обозначены стрелками.Iles / ftp_upload / 54231 / 54231fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
. Рисунок 4. Оценка качества РНК РНК (500 нг извлеченный из побегов 6 дней старых Резуховидка Таля посадочного материала ) из указанных фракций были загружены на агарозном геле 1,2% и разделяли с помощью электрофореза (100В - 15 мин). Цитозольные (25S и 18S) рРНК обозначаются Наконечники и хлорпластического (23S и 16S) рРНК кронштейном. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным исследовательским агентством французского (ANR-14-CE02-0010). Мы благодарим доктора Бенджамина Field и доктор Элоди LANET за критическое прочтение рукописи. Мы благодарим г-на Мишеля Терезу за его помощь при редактировании видео.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer - 13.2 ml | Beckman Coulter | 331372 | |
| Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer - 38.5 ml | Beckman Coulter | 326823 | |
| Glass capillary tube | Drummond Scientific | 1-000-1000 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima series | |
| Ultracentrifuge Rotor SW41 | Beckman Coulter | 331362 | |
| Ultracentrifuge Rotor SW32 | Beckman Coulter | 369650 | |
| Peristaltic pump | Any | ||
| Tygon R3607 polyvinyl chloride tubing | Fisher Scientific | 070534-22 | Polyvinyl chloride tubing, 2.29 mm |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-Rad | 731-8120 | |
| UV cuvette | Hellma | 170.700-QS | Quartz flow-through cuvette |
| UV Spectrophotometer | Varian | Cary50 | Read every 0.0125 sec |
| All chemicals | Any | Use only Molecular Biology Grade | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| Rnase-Free water | Any | ||
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 10083251 | |
| Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol, branched (Nonidet P40) | Euromedex | UN3500 | |
| Linear acrylamide (acryl carrier) | ThermoFischer scientific | AM9520 | RNA precipitation carrier |
| OriginPro 8 | OriginLab | Analysis software |
References
- Nelson, C. J., Millar, A. H.
- Warner, J. R. The economics of ribosome biosynthesis in yeast. Trends Biochem Sci. 24 (11), 437-440 (1999).
- Amthor, J. S. The McCree-de Wit-Penning de Vries-Thornley Respiration Paradigms: 30 Years Later. Ann Bot. 86 (1), 1-20 (2000).
- Preiss, T., W Hentze, M. Starting the protein synthesis machine: eukaryotic translation initiation. BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 25 (12), 1201-1211 (2003).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2013).
- Baerenfaller, K., et al. Genome-scale proteomics reveals Arabidopsis thaliana gene models and proteome dynamics. Science. 320 (5878), 938-941 (2008).
- Zanetti, E., Chang, I., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. Immunopurification of Polyribosomal Complexes of Arabidopsis for Global Analysis of Gene Expression. Plant physiol. 138 (2), 624-635 (2005).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. A. Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments. RNA. 13 (3), 414-421 (2007).
- Arabidopsis protocols. Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J. , Methods in molecular biology; 323. Clifton, N.J. (2006).
- Piques, M., et al. Ribosome and transcript copy numbers, polysome occupancy and enzyme dynamics in Arabidopsis. Mol syst biol. 5 (314), 314 (2009).
- Morita, M., Alain, T., Topisirovic, I., Sonenberg, N.
- Yángüez, E., Castro-Sanz, A. B., Fernández-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress. PloS One. 8 (8), (2013).
- Sormani, R., et al. Sublethal cadmium intoxication in Arabidopsis thaliana impacts translation at multiple levels. Cell Physiol. 52 (2), 436-447 (2011).
- Lanet, E., et al. Biochemical evidence for translational repression by Arabidopsis microRNAs. Plant cell. 21 (6), 1762-1768 (2009).
- Jabnoune, M., Secco, D., Lecampion, C., Robaglia, C., Shu, Q., Poirier, Y. A Rice cis-Natural Antisense RNA Acts as a Translational Enhancer for Its Cognate mRNA and Contributes to Phosphate Homeostasis and Plant Fitness. Plant cell. 25 (10), 4166-4182 (2013).
- Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. Methods Enzymol. 470 (10), Elsevier Inc. (2010).
- Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis. PNAS. 111 (1), 203-212 (2013).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
