Introduction
Proteinsyntes är en viktig och energiskt kostsam process i alla celler 1. Först av allt, måste celler såväl energi i produktionen av översättningsmaskiner, ribosomerna. Till exempel en aktivt dela jästcellen producerar så mycket som 2000 ribosomer per minut. En sådan produktion kräver upp till 60% av den totala transkriptionsaktivitet och upp till 90% av den totala skarvnings aktiviteten hos cellen 2. Dessutom krävs energi för syntes av aminosyror, aminoacyl-tRNA och peptidbindningar. I växter och att addera en aminosyra till en peptidkedja kostnader från 4,5 till 5,9 molekyler ATP 3. Därför är det inte förvånande att översättningen av mRNA till protein är en viktig plats för reglering, i synnerhet när det gäller att hantera förändrade miljöförhållanden.
Den inledande steget översättning, som är en sammanslutning av ett mRNA med ribosomen, är det främsta målet för regleringen avöversättning 4. Som en konsekvens av regleringen av översättning samt andra post-transkriptionella regulatoriska steg, kan bara 40% av variationerna i proteinkoncentration förklaras av mRNA överflöd 5,6. Således, studiet av den totala mRNA ger relativt dålig information om protein överflöd. Å andra sidan, en sammanslutning av mRNA med ribosomer ger bättre inblick i protein överflöd genom att ge tillgång till dessa mRNA är inblandade i översättningen. Aktivt översatta mRNA är förknippade med flera ribosomer i strukturer som kallas polysomer. Omvänt kommer dåligt översatta mRNA vara associerad med endast en ribosomen (monosome). Följaktligen kan den translation status av ett mRNA utvärderas genom att övervaka dess association med ribosomer 7.
Detta protokoll beskriver isoleringen av polysomer från sex dagar gamla Arabidopsis thaliana plantor, den efterföljande isoleringen av RNA, och analysen av resultaten. polysomes och monosomes separeras genom en sackarosdensitetsgradient. Gradienter samlas i sex fraktioner. Några av de fraktioner slås samman för att erhålla tre väl åtskilda fraktioner: polysomer, monosomes och den lätta fraktionen (nedan kallad supernatant), som innehåller den fria 60S och 40S ribosomala subenheter och mRNA som inte är förknippade med ribosomer. Global översättningsverksamhet kan uppskattas genom att generera en polysom / monosome förhållande, som bestäms genom integrering av arean under kurvan, och genom att jämföra polysomer profiler. mRNA och proteiner extraheras sedan från de olika fraktionerna och användes för analys av RT-PCR, QRT-PCR, Northern blot, microarray, western blöt eller proteomik. Detta protokoll har godkänts för andra växter och vävnader.
Den utrustning som krävs för att utföra detta protokoll är vanligt förekommande i de flesta laboratorier: Det finns inget behov av en gradient maker. Frysning varje lager innan du lägger nästa förhindras från någon blandning eller störningar av skikten. Ingen röret piercer används för gradient samling som kan uppnås genom nedsänkning av en glas kapillärrör i gradienten. Därför dyra ultracentrifugrör förblir oskadad och kan återanvändas många gånger. Sammantaget gör detta det nuvarande protokollet en enkel och billig metod för polysom profilering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av 20 till 50% (vikt / volym) sackarosgradienter
Notera: De gradienter är gjorda av 4 lager av sackaros (50%, 35% och 2 skikt av 20%) i ett 13,2 ml ultracentrifugrör. I vår erfarenhet, att hälla 20% sackaros i två separata skikt avsevärt förbättrar kvaliteten på polysom preparat.
- Bereda stamlösningarna. Se till att alla lösningar är RNas och DNAs gratis.
- Förbereda 10X Salt Solution: 400 mM Tris-HCl pH 8,4, 200 mM KCl och 100 mM MgCl2.
- Förbered två M sackaroslösning: För 200 ml, lös 137 g sackaros i 1X saltlösning.
- Späd sackaroslösningen i Salt Solution, som beskrivs i tabell 1, för framställning av gradienter. De volymer som anges är för sex lutningar.
| Slutlig sackaroskoncentration | sackaros 2M (ml) | Saltlösningen 1X (ml) | Slutlig Vol. (ml) |
| 50% | 8,8 | 3,2 | 12 |
| 35% | 12,9 | 12,1 | 25 |
| 20% | 7,4 | 17,6 | 25 |
| 20% | 5,8 | 14,2 | 20 |
Tabell 1. Spädningar av sackaroslösningen för att förbereda sex lutningar.
- Pour skikten enligt tabell 2.
| sackaros skikt | 50% | 35% | 20% | 20% |
| Vol. (Ml) | 1,85 | 3,65 | 3,65 | 1,35 |
Tabell 2. Volym av sackaroslösning per lager.
- Efter att ha hällt varje skikt, hålla rören i en -40 ° C eller -80 ° C frys tills fullständig frysning före tillsättning av nästa sackaros skiktet. Frysning uppnås vanligen efter 2 h vid -40 ° C, men väntar på ungefär 6 h innan den hälldes nästa skikt rekommenderas. Den sista 20% skikt kan frysas eller tillsättas färskt på dagen för experimentet.
Obs: Frysning varje lager innan du lägger nästa förhindrar från någon blandning eller störning av skikten. Gradienter kan hållas i en -40 ° C eller -80 ° C frys under minst sex månader. - Om det inte redan har gjorts, föra in det sista 20% skiktet till gradienterna på dagen för experimentet. Då, låt gradienterna tina upp i ett kylrum eller kylskåp.
2. Framställning av cytosolextrakt
Obs: Vi empfavsluta med två gradienter per biologiskt prov. 300 mg är den optimala mängden av växtmaterial för att framställa två gradienter när man arbetar med 6 dagar gamla Arabidopsis thaliana plantor. När man arbetar med mindre translationellt aktiva vävnader, kan ökas mängden av växtmaterial upp till 600 mg.
- Skörd sex dagar gamla plantor odlade på ½ Murashige och Skoog 8-medium kompletterat med 1% sackaros eller motsvarande media genom djupfrysning i flytande kväve
- Grind växtmaterial i en förkyld mortel och mortelstöt med flytande kväve.
- Väg 300 mg av pulvermaterial i en i förväg kyld vågskål. Utför detta steg snabbt för att undvika upptining av provet.
Obs: Håll frysta prover för mer än en vecka i en -80 ° C frys. - Lägga 2,4 ml av i förväg kyld polysom buffert (Salt Solution 4X, 5,26 mM EGTA, 0,5% (vol / vol) Oktylfenoxi poly (etylenoxi) etanol, grenade, 50 μg.ml -1 cykloheximid, 50 μg.ml 1kloramfenikol) och homogenisera genom blandning med pipettspetsen. Överför i två 1,5 ml rör. Arbeta snabbt för att förhindra att proverna från uppvärmning.
- Centrifugera vid 16.000 xg under 15 min vid 4 ° C i en mikrocentrifug för att pelletera debris.
Obs! För att förhindra RNA nedbrytning, alltid hålla proverna vid 4 ° C, använd RNas / DNas fria lösningar och arbete i RNas / DNas fria förhållanden. Heparin kan sättas till polysom buffert, till en slutlig koncentration av 300 μg.ml -1, för att förbättra RNA skydd. Eftersom heparin kan störa nedströms analys, måste den tas bort under RNA utfällningssteg genom att utföra litiumklorid fällning i stället för etanolfällning (se not 4.7).
3. polysom Profilering
- Försiktigt pipettera supernatanten utan att störa pelleten. Om växtfragment har pipetterats, upprepa steg 2,5. Ladda supernatanten på toppen av gradienten genom att försiktigt pipetting på sidoväggen av röret i en ständig ström. Använda en gradient för varje 1,5 ml rör.
- Överföra till i förväg kyld hinkar och centrifugera vid 175.000 xg under 2 h 45 min vid 4 ° C, i en ultracentrifug (t ex 32000 varv per minut vid användning av en SW41-rotor).
- Inrättat gradienten insamlingssystemet såsom beskrivs i figur 1. UV-kyvett har en 1 mm spårlängd.
Figur 1. Gradient insamlingssystem. Den UV-kyvett är ansluten med polyvinylklorid slang till ett glaskapillärrör som går ned till botten av gradienten. Gradienten fortskrider genom systemet tack vare en peristaltisk pump. OD 260 kontinuerligt läsa och 2 ml fraktioner uppsamlas. Klicka här för att se en större version avdenna siffra.
- Justera fraktionssamlaren till RT, och ställa karusellen med en hastighet som gör det möjligt att samla in 2 ml fraktioner. Använd förkyld uppsamlingsrör.
- Samla de fraktioner från botten till toppen med hjälp av ett glaskapillärrör ansluten med polyvinylklorid slang till gradienten insamlingssystem. Använda en plastparaffinfilm för att säkra anslutningen mellan polyvinylkloriden slangen och glaskapillärrör.
- Läs av absorbansen vid 260 nm från botten till toppen av gradienten. När hela gradienten samlas, placera uppsamlingsrören på is före RNA-extraktion.
4. RNA-extraktion
- Pool fraktionerna som samlats in från två gradienter, i 50 ml tillslutna centrifugrör, enligt följande:
Polysomer: fraktionerna 1 till 3 (12 ml)
Monosomes: fraktion 4 (4 ml)
Supernatant: fraktionerna 5 och 6 (8 ml) - Till varje fraktion, tillsätt 1 vol. 8M guanidinhydroklorid,50 | j, g akryl bärare och 1,5 vol. isopropanol.
Obs: Akryl bärare är linjär akrylamid, som används som en samutfällare att förbättra återvinningen av nukleinsyror under alkoholutfällning. - Blanda genom att vända rören och utfälla O / N vid -20 ° C.
- Centrifugera vid 175.000 xg under 1 h vid 4 ° C, i en ultracentrifug (32000 rpm i en SW32-rotor). Om utfällningssteget utföres i ett rör, som inte är kompatibel med ultracentrifugering, överföring till ett lämpligt rör.
- Kassera supernatanten och lös pelleten i 200 | j, l RNas-fritt TE-buffert (10 mM Tris-HCl pH 7,5-1 mM EDTA). Överföring till ett nytt 1,5 ml rör.
- Utdrag RNA genom att tillsätta en volym. vattenmättad fenol (pH 6,6) och 1 vol. kloroform: isoamylalkohol (24: 1). Blanda kraftigt. Centrifugera vid 15.000 xg under 20 min vid 4 ° C. Överför vattenfasen till ett nytt 1,5 ml rör.
Obs: Syra fenol (pH 4,5) kan användas för att minimera DNA-kontaminering. - Fällning RNA genom att tillsätta 1/10 volym. 3 M natriumacetat och 3 vol. 100% etanol. Medge utfällning vid -80 ° C under 20 min eller O / N vid -20 ° C. Centrifugera vid 15.000 xg under 15 min vid 4 ° C.
Obs: Om du använder heparin i polysom buffert (jfr not 2.5), utföra en litiumklorid (LiCl) utfällning istället för etanolutfällning för att korrekt ta bort alla spår av heparin som kan störa efterföljande analys 9. Efter extraktion, tillsätt LiCl till en slutlig koncentration av 2,5 M. Tillåt utfällning under 30 min vid -20 ° C eller O / N vid 4 ° C. Centrifugera vid 15.000 xg under 15 min vid 4 ° C. - Tvätta pelleten med 500 | j, l 75% etanol. Lufttorka pelleten och lös i 30 ^ il TE-buffert. Bedöma RNA kvalitet genom elektrofores på en RNAse fri 1,2% agarosgel (100V, 15 min) eller genom kapillär elektroforesmetoder.
5. Dataanalys
- Exportera rådata till ett grafiskt och dataanalys programvara.
Notera: Såsom visas i figur 2A och B, de råa profilerna ger kvalitativ information: antalet polysom toppar som kan ses, höjden på monosome topp, och närvaron av en ansats som motsvarar de fria ribosom subenheter. - Merge profiler för att möjliggöra jämförelser av profilerna mellan proven. Använd skärmläsare verktyg för att bestämma X-värdet för monosome topp för varje prov och anpassa monosome toppar genom att ta bort extra datapunkter i början av kurvorna. Identifiera den lägsta punkten på kurvan och bestämma dess Y-värde (med hjälp av skärmläsaren verktyget). Ställ den lägsta punkten Y-värdet till 0 genom att använda "set kolumner värde" -funktion.
- Bestäm förhållandet polysomer / monosomes genom att integrera arean under kurvan från råa profiler (figur 3C). Använd verktyg dataväljaren för att definiera gränsen av det område som skall integreras. Använd sedan integrera funktionen (Analys-Matematik).
- Normaliserakurvorna till monosome toppen genom att dela alla punkter av en kurva av Y-värdet för toppen av monosome toppdata (bestämd med hjälp av skärmen läsaren verktyg). Markera kolumnen, sedan under analys-matematik, välj normalisera och välja "dividerat med ett angivet värde" metoder. Detta steg möjliggör jämförelser av den relativa nivån av polysomer (Figur 3D).
Figur 2. Representativa polysom profiler. Arabidopsis thaliana vildtyp (wt, ekotyp Col-0) och muterade plantor odlades under sex dagar på ½ Murashige och Skoog medium under lång dag fotoperioder (16 timmar ljus, 8 h mörker). A: råa polysom profiler från wt plantor. B: råa polysom profiler från muterade plantor. C: Fastställande av procentandelen polysomer och monosomes genom integrering av arean under kurvan D: polysom profiles normaliseras mot monosome topp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I litteraturen är polysom profiler ofta visade från den lätta fraktionen till den tunga fraktionen som en följd av det sätt på vilket gradienter samlas in, det vill säga från toppen till botten. Eftersom i det protokoll som beskrivs här gradienterna samlas från botten till toppen, profilerna vi visar börja med den tunga fraktionen (de polysomer) och gå till den lätta fraktionen (gratis ribosomen subenheter och RNA) (Figur 2A). Vi sedan samla varje gradient i sex 2 ml fraktioner, men mindre delar kan samlas om en mer detaljerad analys av polysom innehåll måste genomföras.
Sammanslagning och normalisera kurvorna till monosome topp (Figur 2D) gör det möjligt att jämföra profiler från olika linjer eller odlingsbetingelser. Detta ger information om den relativa mängden av polysomer oberoende av nivå om inledande. Ett annat sätt att ennalyze profilerna är att beräkna arean under kurvan, alltså kan man bestämma den relativa mängden av mRNA i samband med antingen monosomes eller polysomer (Figur 2C). Detta förhållande är specifika för en växt och odlingsbetingelser. Dock kan detta tillvägagångssätt inte vara relevant när det gäller dåligt translationellt aktiva vävnader.
Vi har använt denna metod för A. thaliana hela plantor, unga och gamla rosetter, liksom för N. benthamiana (figur 3C), S. lycopersicum (figur 3E) och O. sativa blad (Figur 3D). Profilformen beror på tillväxtbetingelserna, växtens ålder och vävnaderna som analyserats. Här har vi använt A. thaliana sex dagar gamla plantor. I detta skede är det translationella aktiviteten hög, och profilen visar väl formade toppar (Figur 2A och B). Detta är också falletnär A. thaliana blommor används (figur 3A). Vid användning av 4 veckor gamla A. thaliana rosetter (figur 3B), proverna innehåller mestadels fullt utvecklad vuxen lämnar där cellerna inte dela sig. Därför är det totala beloppet av polysomer och monosomes lägre. Profilen visar färre, men fortfarande väl formade polysom toppar. Bredvid monosome topp, visar axeln den stora mängden fria 60S ribosomala subenheter. Med andra typer av växter eller vävnader kan polysom toppar vara knappt synliga. Detta är fallet vid användning av 30 dagar gamla O. sativa blad (Figur 3D). Även då mängden av mRNA involverad i translation är mycket låg (ingen polysom topp kan ses på profilen), närvaron av monosome toppen indikerar att fraktionerades på rätt sätt samt att mRNA kan extraheras ytterligare från fraktionen för vidare analys . Kvaliteten av extraherat RNA kvaliteten utvärderas genom agarosgelelektrofores (
Figur 3. polysom profiler från olika växtmaterial och arter. (A) Arabidopsis thaliana blommor (300 mg), (B) Arabidopsis thaliana 4 veckor gamla rosetter (600 mg), (C) Nicotiana benthamiana (unga blad av 40 dagar gamla kort dag odlade växter - 300mg), (D) Oryza sativa ( blad av 30 dagar gamla växter - 300mg), (E) Solanum lycopersicum (unga blad 35 dagar gamla kort dag odlade växter - 300mg). De monosome topparna är indikerade med pilar.iles / ftp_upload / 54231 / 54231fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
. Figur 4. Bedömning av RNA kvalitet RNA (500 ng extraherad från skott av 6 dagar gamla Arabidopsis thaliana plantor) från de indikerade fraktionerna laddades på en 1,2% agarosgel och separerade genom elektrofores (100 V - 15 min). Cytosoliska (25S och 18S) rRNA indikeras av pilspetsar och kloroplast (23S och 16S) rRNA från en konsol. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av den franska nationella forskningsinstitut (ANR-14-CE02-0010). Vi tackar Dr Benjamin Field och Dr Elodie Lanet för kritisk läsning av manuskriptet. Vi tackar Michel Terese för hans hjälp med videoredigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer - 13.2 ml | Beckman Coulter | 331372 | |
| Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer - 38.5 ml | Beckman Coulter | 326823 | |
| Glass capillary tube | Drummond Scientific | 1-000-1000 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima series | |
| Ultracentrifuge Rotor SW41 | Beckman Coulter | 331362 | |
| Ultracentrifuge Rotor SW32 | Beckman Coulter | 369650 | |
| Peristaltic pump | Any | ||
| Tygon R3607 polyvinyl chloride tubing | Fisher Scientific | 070534-22 | Polyvinyl chloride tubing, 2.29 mm |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-Rad | 731-8120 | |
| UV cuvette | Hellma | 170.700-QS | Quartz flow-through cuvette |
| UV Spectrophotometer | Varian | Cary50 | Read every 0.0125 sec |
| All chemicals | Any | Use only Molecular Biology Grade | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| Rnase-Free water | Any | ||
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 10083251 | |
| Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol, branched (Nonidet P40) | Euromedex | UN3500 | |
| Linear acrylamide (acryl carrier) | ThermoFischer scientific | AM9520 | RNA precipitation carrier |
| OriginPro 8 | OriginLab | Analysis software |
References
- Nelson, C. J., Millar, A. H.
- Warner, J. R. The economics of ribosome biosynthesis in yeast. Trends Biochem Sci. 24 (11), 437-440 (1999).
- Amthor, J. S. The McCree-de Wit-Penning de Vries-Thornley Respiration Paradigms: 30 Years Later. Ann Bot. 86 (1), 1-20 (2000).
- Preiss, T., W Hentze, M. Starting the protein synthesis machine: eukaryotic translation initiation. BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 25 (12), 1201-1211 (2003).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2013).
- Baerenfaller, K., et al. Genome-scale proteomics reveals Arabidopsis thaliana gene models and proteome dynamics. Science. 320 (5878), 938-941 (2008).
- Zanetti, E., Chang, I., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. Immunopurification of Polyribosomal Complexes of Arabidopsis for Global Analysis of Gene Expression. Plant physiol. 138 (2), 624-635 (2005).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. A. Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments. RNA. 13 (3), 414-421 (2007).
- Arabidopsis protocols. Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J. , Methods in molecular biology; 323. Clifton, N.J. (2006).
- Piques, M., et al. Ribosome and transcript copy numbers, polysome occupancy and enzyme dynamics in Arabidopsis. Mol syst biol. 5 (314), 314 (2009).
- Morita, M., Alain, T., Topisirovic, I., Sonenberg, N.
- Yángüez, E., Castro-Sanz, A. B., Fernández-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress. PloS One. 8 (8), (2013).
- Sormani, R., et al. Sublethal cadmium intoxication in Arabidopsis thaliana impacts translation at multiple levels. Cell Physiol. 52 (2), 436-447 (2011).
- Lanet, E., et al. Biochemical evidence for translational repression by Arabidopsis microRNAs. Plant cell. 21 (6), 1762-1768 (2009).
- Jabnoune, M., Secco, D., Lecampion, C., Robaglia, C., Shu, Q., Poirier, Y. A Rice cis-Natural Antisense RNA Acts as a Translational Enhancer for Its Cognate mRNA and Contributes to Phosphate Homeostasis and Plant Fitness. Plant cell. 25 (10), 4166-4182 (2013).
- Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. Methods Enzymol. 470 (10), Elsevier Inc. (2010).
- Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis. PNAS. 111 (1), 203-212 (2013).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
