This paper presents a sensitive method called Circle-Seq for purifying extrachromosomal circular DNA (eccDNA). The method encompasses column purification, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification and high-throughput sequencing. Circle-Seq is applicable to genome-scale screening of eukaryotic eccDNA and studying genome instability and copy-number variation.
Extrachromosomal परिपत्र DNAs (eccDNAs) Saccharomyces cerevisiae में आम आनुवंशिक तत्व हैं और साथ ही साथ अन्य eukaryotes में रिपोर्ट कर रहे हैं। EccDNAs और बहुकोशिकीय जीवों में दैहिक कोशिकाओं के बीच कोशिकीय eukaryotes के विकास के लिए आनुवंशिक परिवर्तन करने के लिए योगदान करते हैं। eccDNA का पता लगाने के लिए संवेदनशील तरीकों को स्पष्ट करने के लिए कैसे इन तत्वों जीनोम स्थिरता और कैसे पर्यावरण और जैविक कारकों कोशिकाओं में अपने गठन को प्रेरित को प्रभावित जरूरत है। यह वीडियो एक संवेदनशील eccDNA-शुद्धि सर्किल Seq बुलाया विधि प्रस्तुत करता है। विधि परिपत्र डीएनए, शेष रेखीय गुणसूत्र डीएनए, eccDNA के रोलिंग सर्कल प्रवर्धन, गहरी अनुक्रमण, और मानचित्रण के हटाने के स्तंभ शुद्धि शामिल हैं। व्यापक exonuclease उपचार के लिए पर्याप्त रैखिक गुणसूत्र डीएनए के क्षरण के लिए आवश्यक था। द्वारा रोलिंग सर्कल प्रवर्धन कदमine से ऊंचाई:। सामान्य; "> φ 29 पोलीमर्स रैखिक डीएनए के ऊपर परिपत्र डीएनए के लिए समृद्ध 10 10 कोशिकाओं के तीन एस cerevisiae CEN.PK आबादी पर सर्किल Seq विधि के मान्यकरण आकारों में eccDNA प्रोफाइल के सैकड़ों 1 kilobase से बड़ा का पता चला । ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30, HXT6, दोनों S288c और CEN.PK पता चलता है कि डीएनए circularization इन स्थलों पर प्रकारों के बीच संरक्षित है में परिपत्र डीएनए पर HXT7 जीनों। संक्षेप में दोहराया निष्कर्षों, सर्किल-Seq विधि व्यापक है eukaryotes में रूप में अच्छी तरह के रूप में विशिष्ट eccDNA प्रकार का पता लगाने के लिए eccDNA के लिए जीनोम पैमाने स्क्रीनिंग के लिए प्रयोज्यता।
जल्दी या क्षणिक गुणसूत्र प्रवर्धन का पता लगाने मुश्किल है क्योंकि यह कोशिकाओं की बड़ी आबादी में एकल डीएनए अणु में परिवर्तन की पहचान करने की आवश्यकता है। गुणसूत्र कॉपी संख्या रूपों (CNVs) आम तौर पर उनकी स्थापना के बाद अच्छी तरह से पता चला रहे हैं, व्यवस्था है कि बदलाव 1,2 उत्पन्न के सबूत के रूप में केवल अंतिम CNV संरचना को छोड़कर। का पता लगाने और CNV गठन के पहले चरण में extrachromosomal परिपत्र डीएनए (eccDNA) जीनोमिक rearrangements में चल रही प्रक्रियाओं को स्पष्ट हो सकता है ठीक हो।
इससे पहले, नए सिरे से eccDNA की खोज इलेक्ट्रॉन micrographs 3, metaphase गुणसूत्रों 4, या दो आयामी जेल वैद्युतकणसंचलन 5 की Giemsa धुंधला द्वारा किया गया था। इन विधियों परिपत्र डीएनए के अनुक्रम के बारे में बहुत कम या कोई जानकारी प्रदान करते हैं। इस तरह के दक्षिणी सीटू hybridizatio में 6.7, उलटा पीसीआर 8 या प्रतिदीप्ति सोख्ता के रूप में लक्षित तकनीकn 9 केवल विशिष्ट eccDNA तत्वों के बारे में सबूत प्रदान करते हैं। इन तरीकों में से कोई भी एक सेल की आबादी में सभी मौजूदा eccDNA प्रकार के अनुक्रम प्रदान करते हैं।
कोशिकाओं का एक पूल में जीनोमिक विचलन जीनोम अनुक्रमण और / या खपरैल का छत सरणियों 10,11 के द्वारा होती जा सकता है। एक विलोपन या पारंपरिक डीएनए शुद्धि तरीकों से प्रवर्धन का पता लगाने के लिए जरूरी है कि आम तौर पर एक उत्परिवर्तित एलील सेल की आबादी 12,13 के कम से कम 0.1-1% प्रतिनिधित्व करते हैं। Acentric eccDNAs centromeres की कमी और नकल पर डीएनए संश्लेषण की क्षमता का अभाव होने के कारण एक सेल संस्कृति में और भी अधिक क्षणिक होने की उम्मीद कर रहे हैं। इस प्रकार, के बाद से सबसे eccDNAs शायद कम मात्रा में हैं और उनके दृश्यों जीनोम जैसे लगते हैं, वैकल्पिक डीएनए निष्कर्षण तरीकों eccDNAs पता लगाने के लिए आवश्यक हैं।
कई परिपत्र डीएनए शोधन तकनीक क्रोमोसोम और डीएनए परिपत्र के बीच मतभेद का फायदा उठाने के संरचनात्मक। उदाहरण के लिए, उच्च गति के लिए ultracentrifugसीज़ियम क्लोराइड ढ़ाल में व्यावहारिक मानव हेला कैंसर कोशिका लाइन 14 से 350-3000 basepairs (बीपी) बड़े eccDNAs को अलग-थलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है। हालांकि, उच्च वेग supercoiled परिपत्र डीएनए संरचना की रीढ़ तोड़ने या निक सकते हैं, अवसादन वेग 15 और eccDNA उपज फेरबदल। दत्ता और सहकर्मियों नए सिरे से, माउस ऊतकों से और साथ ही मानव कोशिकाओं 16,17 चिकन की संस्कृतियों और से परिपत्र डीएनए के जीनोम पैमाने पहचान के लिए एक विधि विकसित की है। उनकी पद्धति सुक्रोज प्लाज्मिड शुद्धि और एंजाइमी प्रतिक्रियाओं और डीएनए एक्सट्रेक्शन के कई दौर के द्वारा पीछा ultracentrifugation द्वारा homogenized ऊतक से नाभिक की निकासी है। उनके प्रोटोकॉल मुख्य रूप से 200-400 बीपी eccDNAs, कहा जाता है microDNAs को पहचानती है। दत्ता और सहकर्मियों को भी Saccharomyces cerevisiae से microDNAs की शुद्धि का प्रयास किया लेकिन इस खमीर प्रजातियों 16 से microDNA रिकॉर्ड करने में असमर्थ थे।
हम के लिए एक उपन्यास तरीका विकसित किया हैखमीर से eccDNA की नए सिरे से पता लगाने के सर्किल Seq बुलाया। इस विधि को काफी बड़े पूरे जीन ले जाने के लिए और 86 kilobase (केबी) माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए (mtDNA) के रूप में के रूप में बड़े परिपत्र डीएनए अणु के लिए जीनोम पैमाने पर सर्वेक्षण के लिए सक्षम बनाता है। सर्किल-Seq विधि एक अच्छी तरह से स्थापित प्रोकार्योटिक प्लाज्मिड शोधन विधि 18,19 से विकसित किया गया था, यूकेरियोटिक खमीर कोशिकाओं के लिए अनुकूलित और गहरी अनुक्रमण के साथ संयुक्त। सर्किल-Seq दृष्टिकोण, 1756 विभिन्न eccDNAs, सभी से बड़ा 1 केबी का उपयोग करना, दस एस से पता चला रहे थे cerevisiae S288c 20 आबादी। एक आकार कट-ऑफ eccDNA कि काफी बड़ी पूरे जीन ले जाने के लिए थे पर ध्यान केंद्रित करने के लिए चुना गया था। सर्किल-Seq अत्यधिक संवेदनशील था; यह कोशिकाओं 20 के हजारों के भीतर एक ही eccDNA का पता चला। वर्तमान अध्ययन में, सर्किल Seq को अलग और एक और एस के तीन जैविक प्रतिकृति से 294 eccDNAs की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था cerevisiae खमीर तनाव, CEN.PK. आंकड़ों से पता चलता है कि eccDNA एक आम आनुवंशिक Eleme हैएस में एनटी cerevisiae उपभेदों।
सर्किल-Seq विधि अनुक्रम स्तर के संकल्प के साथ खमीर कोशिकाओं से eccDNA के जीनोम पैमाने का पता लगाने के लिए अनुमति देता है। विधि एक हल्के eccDNA शुद्धि कि गहन भंवर या pipetting की आवश्यकता नहीं है और eccDNA टूटना है कि बाद के चरण में exonuclease पाचन के लिए नेतृत्व करेंगे सीमित करने गंभीरता से स्तंभ जुदाई का उपयोग करता है। विधि के इन सुविधाओं बड़े eccDNAs कि जीन दृश्यों को शामिल पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है। सर्किल-Seq पूर्ण जीन (डेटासेट 1) सहित कई eccDNAs का पता चला। यह भी 86 केबी खमीर mitochondrial डीएनए का पता चला। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल बड़े परिपत्र डीएनए तत्वों की शुद्धि की सुविधा। एक न्यूनतम करने के लिए डीएनए निष्कर्षण कदम की संख्या को ध्यान में रखते eccDNA नुकसान के जोखिम को कम कर देता है और उपज अधिकतम हो। नियंत्रण के लिए परिणामों के आधार पर नुकीला में plasmids, सर्किल-Seq अत्यधिक संवेदनशील है, 2500 कोशिकाओं से एक परिपत्र डीएनए का पता लगाने। इसके अलावा, इस तरह के 2μ के रूप में प्रचुर मात्रा में अंतर्जात plasmids हटाने; प्लाज्मिड या mitochondrial डीएनए में काफी संवेदनशीलता को बढ़ाने सकता है। खमीर संस्कृतियों से 2μ का इलाज 30 में वर्णित किया गया है। वैकल्पिक रूप से, 2μ और mitochondrial डीएनए हटाने ऐसे स्वाई के रूप में एक दुर्लभ काटने endonuclease, साथ प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, प्रतिबंध एंजाइम कदम हित के अन्य eccDNAs को निशाना बनाने और कुल eccDNA उपज सीमा सकता है।
eccDNA का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण कदम के लिए एक उचित गहराई तक रैखिक डीएनए (चरण 3) और डीएनए अनुक्रमण (चरण 5) को हटाने के थे। एक सेल की आबादी से eccDNAs के बहुमत को रिकॉर्ड करने के लिए, गहरी अनुक्रमण 20 आवश्यक हो सकता है। बनती अंत अनुक्रमण, eccDNA का पता लगाने की भी अधिक से अधिक आत्मविश्वास प्रदान करना चाहिए के रूप में परिपत्र डीएनए जंक्शनों बनती अंत उपज की उम्मीद कर रहे हैं कि बेसुरेपन नक्शा पढ़ता है। इन विसंगतियों परिपत्र डीएनए संरचना की खोज का समर्थन और संभवतः एक अतिरिक्त eccDNA का पता लगाने फिल्टर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
सर्किल-seक्यू विधि तीन स्वतंत्र एस का उपयोग कर मान्य किया गया था cerevisiae CEN.PK आबादी। पता चला दृश्यों पहले eccDNAs, अंतर्जात plasmids सूचना दी और नुकीला में प्लास्मिड और ख्यात eccDNAs (डेटासेट 1) के सैकड़ों शामिल थे। इन निष्कर्षों एस से पिछले सर्किल Seq डेटासेट का समर्थन cerevisiae S288c 20। आम कई eccDNAs CEN.PK और S288c आबादी के लिए की खोज इंगित करता है कि इन लोकी एक प्रवृत्ति के रूप में परिपत्र तत्वों (चित्रा 4) के लिए मौजूद है। हम पहले से पता चला है कि [GAP1 चक्र], CEN.PK पृष्ठभूमि 8 में नाइट्रोजन सीमित शर्तों के तहत समृद्ध है, हालांकि [GAP1 चक्र] अन्य तनाव की पृष्ठभूमि में की सबूत नहीं पाया गया है। CUP1-1 RSC30, ASP3-1, COS111, और HXT6 HXT7 लोकी दोनों S288c और CEN.PK में से eccDNA के निष्कर्ष बताते हैं कि डीएनए circularization के लिए एक गड़बड़ी चोर हैखमीर उपभेदों के बीच में कार्य किया। यह अपने अस्तित्व मात्र की उच्च दर का एक प्रभाव है अगर [HXT6 / 7 चक्र], [ASP3-1 चक्र], [COS111 चक्र] और [CUP1-1 RSC30 चक्र] कोशिकाओं को या यदि चयनात्मक लाभ प्रदान दिखाए जाना बना रहता है डीएनए circularization।
साथ में ले ली, परिणामों से संकेत मिलता है कि सर्किल Seq अच्छी तरह kilobase आकार eccDNAs का पता लगाने के लिए अनुकूल है और पूरा जीन के साथ eccDNAs की पहचान के लिए फायदे हैं। सर्किल-Seq एक बेहद संवेदनशील तरीका है कि खमीर से eccDNAs के पूरे जीनोम पैमाने पर स्क्रीन के लिए सक्षम बनाता है। सर्किल-Seq विधि जीन विलोपन और amplifications पैदा करने में eccDNA की भूमिका elucidating के उद्देश्य से अनुसंधान का एक नया क्षेत्र खोल सकता है। यह देखते हुए कि डीएनए वास्तुकला और संरचना काफी हद तक उच्च eukaryotes को यूकेरियोटिक खमीर से संरक्षित कर रहे हैं, सर्किल-Seq विधि चाहिए, सिद्धांत रूप में, applicabl होसभी कोशिकाओं को ई, मामूली संशोधनों के साथ। वर्तमान में, विधि, किसी भी सीमाएं हैं, हालांकि megabase आकार eccDNAs को शुद्ध करने की क्षमता अभी तक दिखाया जा चुका है प्रकट नहीं होता है। इसके अलावा, ø29 डीएनए पोलीमरेज़, जो एक रोलिंग सर्कल प्रवर्धन विधि का उपयोग करता है 31 के उपयोग, छोटे eccDNA मात्रा का ठहराव और अधिक कठिन बना eccDNAs की दिशा में एक पूर्वाग्रह पैदा करता है। सर्किल-Seq काफी बड़े पूर्ण जीन ले जाने के लिए eccDNAs का पता लगाता है, यह मानव दैहिक कोशिकाओं से डबल मिनट परिपत्र डीएनए पर अध्ययन के लिए उपयुक्त बना रही है। जब आद्य-ओंकोजीन इन तत्वों को 32-37 पर परिलक्षित कर रहे हैं डबल मिनट कैंसर के लिए योगदान कर सकते हैं। germline कोशिकाओं में eccDNAs का अध्ययन germline उत्परिवर्तन दर को मापने और शुक्राणु की गुणवत्ता का आकलन, पशुधन में उदाहरण के लिए करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रकार, सर्किल Seq दर है जिस पर आनुवंशिक परिवर्तन प्रतिलिपि संख्या भिन्नता के रूप में उठता में अंतर्दृष्टि उपज के लिए, और रोगों के एक उपन्यास समझ है कि जीन copy- को शामिल करने के लिए नेतृत्व क्षमता हैनंबर भिन्नता 38-40।
The authors have nothing to disclose.
Thanks to Kenn D. Møller and Claus Sternberg (DTU) for technical assistance and to Tue S. Jørgensen for quantitative PCR analysis.
Bacto peptone | BD Difco | 211677 | Alternative product can be used. |
Brilliant III SYBR Green PCR Master Mix | Agilent Technologies | 600882 | For qPCR analysis. Alternative product can be used. |
Dextrose (D-glucose) | Carl Roth | HN06.4 | Alternative product can be used. |
Disruptor Beads, 0.5 mm | Scientific Industries, Inc. | SI-BG05 | Glass beads to disrupt plasma cell membranes. Alternative product can be used. |
Ethidium bromide | Carl Roth | 2218.2 | Agarose gel stain for detecting DNA/RNA. |
GeneJet plasmid miniprep kit | Thermo Fisher | K0502 | Plasmid purifcation from bacteria. Alternative product can be used |
NotI, FastDigest | Life Technologies - Thermo Fisher Scientific, USA | FD0594 | Endonuclease. Alternative product can be used. |
Plasmid Mini AX kit | A&A Biotechnology, Poland | 010-50 | Plasmid purifcation kit used to purify eccDNA. |
Plasmid-Safe ATP-dependent DNase kit | Epicentre, USA | E3105K | ATP-dependent exonuclease kit. Alternative product can be used. |
Propidium iodide | Sigma-Aldrich, USA | 81845 | Alternative product can be used. |
pUG6 plasmid | EUROSCARF, Germany | P30114 | Marker gene: loxP-PAgTEF1-kanMX-TAgTEF1-loxP. Plasmid requests: Please contact Dr. Peter Philippsen@unibas.ch |
QIAGEN genomic-tip 100/G | Qiagen, USA | 13343 | Genomic DNA purifcation from yeast. Alternative product can be used. |
REPLI-g Mini Kit protocol | Qiagen, USA | 150023 | Amplification of eccDNA by the phi29 polymerase |
Yeast extract | BD Difco | 210929 | Alternative product can be used. |
Zymolyase 100T (Lyticase, Yeast Lytic Enzyme) | Nordic BioSite, Sweden | Z1004-3 | Alternative product can be used. |
Data access to sequence files | European Nucleotide Archive | EccDNA dataset from Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D. Study accession number PRJEB9684. 2nd accession number is ERP010820. Locus tag prefix is BN2032. | |
Strains | |||
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | Genotype MATa MAL2-8c SUC2 | ||
Saccharomyces cerevisiae yeast deletion library pool | EUROSCARF, Germany | S288c BY4741 pool of 4400 viable single-gene deletion mutants disrubted by KanMX module. Genotypes MATa his3∆1 leu2∆0 met15∆0 ura3∆0 genexxx::KanMX. | |
Equipments | |||
DNA Spectrophotometer | NanoDrop 1000 Spectrophotometer, Thermo Fisher | Measuring DNA concentration. Alternative product can be used. | |
Fluorescence microscopy | Nikon Optronics Magnafire. Red excitation fluorescence filter, 663-738 nm. | Alternative product can be used. | |
Robotic library-build system | Apollo 324, IntegenX Inc. | DNA library preparation. Alternative product can be used. | |
Sequencing platform | Illumina HiSeq 2000 platform, Illumina Inc. | DNA sequencing. Alternative product can be used. | |
Ultrasonicator | Covaris LE220, microTUBE AFA Fiber tubes | Alternative product can be used. | |
Methods | |||
2% YPD media | Mix 10 g Dextrose, 10 g Yeast extract, 20 g Bacto peptone and add H2O to a total volume of 1000 ml and autoclave. | ||
Circle-Seq test on genomic DNA | Genomic DNA was purified (Qiagen) from a pool of the yeast deletion library (Euroscarf). The DNA concentration was measured by nanodrop and 30 µg genomic DNA was pipetted into two micro centrifuge tubes. One micro centrifuge tube was supplemented with 100 nanogram plasmid (pUG6). The DNA samples were purified by Circle-Seq, omitting the protocol steps 1.1-1.3 and 1.5-1.7. The eluted DNA concentrations were measured by nanodrop and the entire DNA yield from sample GD and GD+P was treated with exonuclease for a period of 29 hours. A 10% fraction was collected for phi29-amplification and PCR analysis, while the remaining DNA was subjected to 72 hour exonuclease treatment. The samples were analyzed for linear DNA content by PCR, using the ACT1 gene as chromosomal marker. A 5% fraction of each of the exonuclease treated samples was amplified by the phi29 DNA polymerase for 16 hours (Qiagen). The presence of DNA in each sample was examined by loading an equal amount (7 µl) in wells on an 0.5 µg/ml ethidium-bromide 0.9% agarose gel after running gel-electrophoresis. | ||
Mapping software | Bowtie2 aligner, John Hopkins University | Ultrafast short read alignment. Reference: Langmead B, Salzberg S. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 2012, 9:357-359. | |
Propidium iodide stain | Images of propidium iodine stained DNA were captured by fluorescence microscopy at 100x magnification (100x/1.30 oil, Nikon) in the RFP channel (red excitation fluorescence filter, 663-738 nm) using identical exposition time (5 seconds). | ||
Workflow bioinformatic system | Galaxy, Open source. | A free web-based platform for data intensive biomedical research. References: Goecks, J, Nekrutenko, A, Taylor, J and The Galaxy Team. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 2010 Aug 25;11(8):R86. Blankenberg D, Von Kuster G, Coraor N, Ananda G, Lazarus R, Mangan M, Nekrutenko A, Taylor J. "Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists". Current Protocols in Molecular Biology. 2010 Jan; Chapter 19:Unit 19.10.1-21. Giardine B, Riemer C, Hardison RC, Burhans R, Elnitski L, Shah P, Zhang Y, Blankenberg D, Albert I, Taylor J, Miller W, Kent WJ, Nekrutenko A. "Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis." Genome Research. 2005 Oct; 15(10):1451-5. |