This paper presents a sensitive method called Circle-Seq for purifying extrachromosomal circular DNA (eccDNA). The method encompasses column purification, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification and high-throughput sequencing. Circle-Seq is applicable to genome-scale screening of eukaryotic eccDNA and studying genome instability and copy-number variation.
DNAs circulares extracromossômicos (eccDNAs) são elementos genéticos comuns em Saccharomyces cerevisiae e são relatados em outros eucariotas também. EccDNAs contribuir para a variação genética entre células somáticas em organismos multicelulares e evolução das eucariotas unicelulares. métodos sensíveis para detectar eccDNA são necessários para esclarecer como esses elementos afetam a estabilidade do genoma e como fatores ambientais e biológicos induzir a sua formação em células eucarióticas. Este vídeo apresenta um método eccDNA-purificação sensível, chamado Circle-Seq. O método envolve a purificação de DNA circular, a remoção do restante DNA linear cromossômica, amplificação rolling-círculo de eccDNA, sequenciamento de profundidade, e mapeamento de coluna. tratamento exonuclease extensa foi necessária para a degradação do DNA cromossômico linear suficiente. O passo de amplificação rolling-círculoine-height:. normal; "> φ 29 polimerase enriquecido para DNA circular sobre o DNA linear de validação do método Circle-Seq em três populações de S. cerevisiae CEN.PK de 10 a 10 células detectadas centenas de perfis eccDNA em tamanhos maiores do que 1 quilobases . resultados repetidos de ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30, HXT6, HXT7 genes no DNA circular em ambos S288c e CEN.PK sugere que circularização DNA é conservado entre as estirpes nestes loci. em suma, o método Circle-Seq tem ampla aplicabilidade para rastreio de escala genoma para eccDNA em eucariotas, bem como para a detecção de tipos específicos eccDNA.
Detecção de amplificação cromossómico cedo ou transiente é difícil porque requer a identificação de alterações nas moléculas de ADN em grandes populações de células. Cromossómicas variações no número de cópias (CNVs) são geralmente bem detectado após o seu estabelecimento, deixando apenas a estrutura final CNV como prova de que o mecanismo de variação gerado a 1,2. Detecção e recuperação DNA extrachromosomal circular (eccDNA) nos estágios iniciais de formação de CNV poderia elucidar os processos em curso no rearranjos genômicos.
Anteriormente, de novo descoberta de eccDNA foi de micrografias eletrônicas 3, Giemsa de cromossomos em metáfase 4 ou eletroforese bidimensional 5. Estes métodos oferecem pouca ou nenhuma informação sobre a sequência do DNA circular. Técnicas visados como o Southern blotting 6,7, inverse PCR 8, ou de fluorescência em hybridizatio situn 9 fornecer provas apenas cerca elementos eccDNA específicos. Nenhum destes métodos proporcionam a sequência de todos os tipos eccDNA existentes numa população de células.
Divergência genómico em uma associação de células pode ser caracterizado por sequenciação do genoma e / ou matrizes ladrilhos 10,11. Detecção de uma deleção ou amplificação por métodos de purificação de ADN convencionais geralmente requer que um alelo mutado representam, pelo menos, 0,1-1% da população de células 12,13. Acentric eccDNAs se espera que sejam ainda mais transiente em uma cultura de células, devido à sua falta de centrómeros e potencial ausência da síntese de ADN em replicação. Assim, desde que a maioria eccDNAs presumivelmente estão em quantidades baixas e as suas sequências de se parecer com o genoma, métodos de extracção de ADN alternativos são necessários para detectar eccDNAs.
Várias técnicas de purificação de ADN circular explorar as diferenças estruturais entre os cromossomas e ADN circular. Por exemplo, ultracentrifug de alta velocidadeção em gradientes de césio-cloreto é usado para isolar 350-3000 pares de bases (pb) a partir de grandes eccDNAs a linha celular de cancro humano HeLa 14. No entanto, a alta velocidade pode quebrar ou entalhe da espinha dorsal das estruturas circulares de DNA super-enrolados, alterando a velocidade de sedimentação 15 e no rendimento eccDNA. Dutta e colaboradores desenvolveram um método para de novo, a identificação escala genoma de ADN circular a partir de tecidos de ratinho, bem como a partir de culturas de células humanas e de galinha 16,17. Seu método é a extração de núcleos de tecido homogeneizado por ultracentrifugação sacarose seguida de purificação de plasmídeos e várias rodadas de reações enzimáticas e extrações de DNA. Seu protocolo identifica principalmente 200-400 eccDNAs pb, chamados microDNAs. Dutta e colegas de trabalho também tentou a purificação de microDNAs de Saccharomyces cerevisiae, mas não foram capazes de gravar microDNA desta espécie de levedura 16.
Desenvolvemos um novo método para adetecção de novo de eccDNA de fungo chamado Círculo-Seq. Este método permite pesquisas escala genoma para moléculas circulares de DNA, grandes o suficiente para transportar genes inteiros e tão grande como o DNA 86 quilobases (kb) mitocondrial (mtDNA). O método de círculo-Seq foi desenvolvido a partir de um método de purificação de plasmídeo procarióticos bem estabelecida 18,19, optimizado para as células de levedura e eucariotas combinado com sequenciação profunda. Utilizando a abordagem Círculo-Seq, 1756 eccDNAs diferentes, todo maior do que 1 kb, foram detectados a partir de dez S. cerevisiae S288c populações 20. Um tamanho de corte foi escolhido para se concentrar em eccDNA que eram grandes o suficiente para transportar genes inteiros. Circle-Seq foi altamente sensível; ele detectou um único eccDNA dentro de milhares de células 20. No estudo atual, Circle-Seq foi usado para isolar e identificar 294 eccDNAs de três repetições biológicas de outro S. cerevisiae cepa de levedura, CEN.PK. Os dados revelam que eccDNA é um eleme genética comumnt em S. cerevisiae.
O método Circle-Seq permite a detecção escala genoma de eccDNA a partir de células de levedura com resolução de nível sequência. O método é uma purificação eccDNA leve que não requer vórtice intensiva ou pipetagem e usa a separação da coluna pela força da gravidade para limitar eccDNA ruptura que levaria a digestão de exonuclease no passo subsequente. Estas características do método pode ser crucial para a detecção de grandes eccDNAs que contêm sequências de genes. Circle-Seq detectado numerosas eccDNAs incluindo genes completos (Conjunto de Dados 1). Ele também detectou a 86 kb levedura DNA mitocondrial. Assim, esse protocolo facilita a purificação de grandes elementos circulares de DNA. Mantendo o número de passos de extracção de ADN para um mínimo reduz o risco de perda eccDNA e maximiza o rendimento. Com base nos resultados de controlo, cravado-em plasmídeos, Círculo-Seq é altamente sensível, a detecção de um único ADN circular de 2.500 células. Além disso, a remoção de plasmídeos endógenos abundantes tais como 2μ; plasmídeo ou ADN mitocondrial pode melhorar significativamente a sensibilidade. Cura de 2μ a partir de culturas de levedura foi descrito 30. Alternativamente, 2μ e remoção do DNA mitocondrial pode ser alcançada com uma endonuclease rara de corte, tais como SwaI. No entanto, o passo enzima de restrição poderia ter como alvo outras eccDNAs de interesse e limitar o rendimento total eccDNA.
As etapas críticas para a detecção eccDNA foram remoção de ADN linear (passo 3) e sequenciação de DNA (passo 5) a uma profundidade adequada. Para gravar a maioria dos eccDNAs a partir de uma população de células, sequenciamento de profundidade pode ser necessária 20. sequenciamento-end emparelhado deve fornecer uma confiança ainda maior de detecção eccDNA, como se espera junções circulares de DNA para produzir emparelhado-end lê esse mapa discordantemente. Estas discrepâncias suporta a descoberta de estruturas de ADN circular e pode, potencialmente, ser utilizado como um filtro de detecção de eccDNA adicional.
O Círculo-Semétodo q foi validado utilizando três S. independente populações cerevisiae CEN.PK. Sequências detectadas incluído anteriormente relatado eccDNAs, plasmídeos endógenos e cravado-in plasmídeos e centenas de eccDNAs putativos (Conjunto de Dados 1). Estes resultados suportam conjuntos de dados Círculo-Seq anteriores de S. cerevisiae S288c 20. A descoberta de vários eccDNAs comuns para as populações CEN.PK S288C e indica que estes loci têm uma propensão para existir como elementos circulares (Figura 4). Temos anteriormente demonstrado que o [círculo GAP1] é enriquecido em condições limitadas de nitrogênio no fundo CEN.PK 8, embora não tenha sido encontrada evidência de [círculo GAP1] em outra estirpe fundos. Encontrar de eccDNA do CUP1-1 RSC30, ASP3-1, COS111 e HXT6 HXT7 loci tanto S288c e CEN.PK sugere que uma predisposição para a circularização do DNA é conservido entre as estirpes de levedura. Ele continua a ser mostrado se [HXT6 / 7 círculo], [círculo ASP3-1], [círculo COS111] e [círculo CUP1-1 RSC30] conferem vantagens selectivas para células ou se a sua existência é meramente um efeito de altas taxas de circularização do ADN.
Tomados em conjunto, os resultados indicam que o círculo-Seq é bem adequado para detectar eccDNAs quilobases de tamanho e tem vantagens para a identificação de genes completos com eccDNAs. Circle-Seq é um método altamente sensível que permite telas inteiras escala genoma de eccDNAs de levedura. O método Circle-Seq poderia abrir um novo campo de investigação destinada a elucidar o papel de eccDNA na geração de deleções de genes e amplificações. Dado que a arquitetura e estrutura do DNA são em grande parte conservada desde levedura eucariótica para eucariotas superiores, o método Circle-Seq deve, em princípio, ser applicablE para todas as células eucarióticas, com ligeiras modificações. Actualmente, o método não parece ter quaisquer limitações, embora a sua capacidade de purificar eccDNAs tamanho Megabase-se ainda a ser mostrado. Além disso, a utilização de O29 ADN-polimerase, que utiliza um método de amplificação de rolamento-círculo 31, cria uma tendência para as pequenas eccDNAs eccDNA tornando mais difícil a quantificação. Circle-Seq detecta eccDNAs grandes o suficiente para transportar genes completos, tornando-o adequado para estudos de DNA minutos circular dupla a partir de células somáticas humanas. Minutos duplas podem contribuir para o câncer quando proto-oncogenes são amplificados sobre esses elementos 32-37. Estudos de eccDNAs em células germinativas poderia ser usado para medir as taxas de mutação germinativa e avaliar a qualidade do esperma, por exemplo, na pecuária. Assim, Círculo-Seq tem o potencial para produzir insights sobre a taxa a que a variação genética surge sob a forma de variação do número de cópias, e levam a uma nova compreensão das doenças que envolvem contra cópia do genevariação do número 38-40.
The authors have nothing to disclose.
Thanks to Kenn D. Møller and Claus Sternberg (DTU) for technical assistance and to Tue S. Jørgensen for quantitative PCR analysis.
Bacto peptone | BD Difco | 211677 | Alternative product can be used. |
Brilliant III SYBR Green PCR Master Mix | Agilent Technologies | 600882 | For qPCR analysis. Alternative product can be used. |
Dextrose (D-glucose) | Carl Roth | HN06.4 | Alternative product can be used. |
Disruptor Beads, 0.5 mm | Scientific Industries, Inc. | SI-BG05 | Glass beads to disrupt plasma cell membranes. Alternative product can be used. |
Ethidium bromide | Carl Roth | 2218.2 | Agarose gel stain for detecting DNA/RNA. |
GeneJet plasmid miniprep kit | Thermo Fisher | K0502 | Plasmid purifcation from bacteria. Alternative product can be used |
NotI, FastDigest | Life Technologies - Thermo Fisher Scientific, USA | FD0594 | Endonuclease. Alternative product can be used. |
Plasmid Mini AX kit | A&A Biotechnology, Poland | 010-50 | Plasmid purifcation kit used to purify eccDNA. |
Plasmid-Safe ATP-dependent DNase kit | Epicentre, USA | E3105K | ATP-dependent exonuclease kit. Alternative product can be used. |
Propidium iodide | Sigma-Aldrich, USA | 81845 | Alternative product can be used. |
pUG6 plasmid | EUROSCARF, Germany | P30114 | Marker gene: loxP-PAgTEF1-kanMX-TAgTEF1-loxP. Plasmid requests: Please contact Dr. Peter Philippsen@unibas.ch |
QIAGEN genomic-tip 100/G | Qiagen, USA | 13343 | Genomic DNA purifcation from yeast. Alternative product can be used. |
REPLI-g Mini Kit protocol | Qiagen, USA | 150023 | Amplification of eccDNA by the phi29 polymerase |
Yeast extract | BD Difco | 210929 | Alternative product can be used. |
Zymolyase 100T (Lyticase, Yeast Lytic Enzyme) | Nordic BioSite, Sweden | Z1004-3 | Alternative product can be used. |
Data access to sequence files | European Nucleotide Archive | EccDNA dataset from Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D. Study accession number PRJEB9684. 2nd accession number is ERP010820. Locus tag prefix is BN2032. | |
Strains | |||
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | Genotype MATa MAL2-8c SUC2 | ||
Saccharomyces cerevisiae yeast deletion library pool | EUROSCARF, Germany | S288c BY4741 pool of 4400 viable single-gene deletion mutants disrubted by KanMX module. Genotypes MATa his3∆1 leu2∆0 met15∆0 ura3∆0 genexxx::KanMX. | |
Equipments | |||
DNA Spectrophotometer | NanoDrop 1000 Spectrophotometer, Thermo Fisher | Measuring DNA concentration. Alternative product can be used. | |
Fluorescence microscopy | Nikon Optronics Magnafire. Red excitation fluorescence filter, 663-738 nm. | Alternative product can be used. | |
Robotic library-build system | Apollo 324, IntegenX Inc. | DNA library preparation. Alternative product can be used. | |
Sequencing platform | Illumina HiSeq 2000 platform, Illumina Inc. | DNA sequencing. Alternative product can be used. | |
Ultrasonicator | Covaris LE220, microTUBE AFA Fiber tubes | Alternative product can be used. | |
Methods | |||
2% YPD media | Mix 10 g Dextrose, 10 g Yeast extract, 20 g Bacto peptone and add H2O to a total volume of 1000 ml and autoclave. | ||
Circle-Seq test on genomic DNA | Genomic DNA was purified (Qiagen) from a pool of the yeast deletion library (Euroscarf). The DNA concentration was measured by nanodrop and 30 µg genomic DNA was pipetted into two micro centrifuge tubes. One micro centrifuge tube was supplemented with 100 nanogram plasmid (pUG6). The DNA samples were purified by Circle-Seq, omitting the protocol steps 1.1-1.3 and 1.5-1.7. The eluted DNA concentrations were measured by nanodrop and the entire DNA yield from sample GD and GD+P was treated with exonuclease for a period of 29 hours. A 10% fraction was collected for phi29-amplification and PCR analysis, while the remaining DNA was subjected to 72 hour exonuclease treatment. The samples were analyzed for linear DNA content by PCR, using the ACT1 gene as chromosomal marker. A 5% fraction of each of the exonuclease treated samples was amplified by the phi29 DNA polymerase for 16 hours (Qiagen). The presence of DNA in each sample was examined by loading an equal amount (7 µl) in wells on an 0.5 µg/ml ethidium-bromide 0.9% agarose gel after running gel-electrophoresis. | ||
Mapping software | Bowtie2 aligner, John Hopkins University | Ultrafast short read alignment. Reference: Langmead B, Salzberg S. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 2012, 9:357-359. | |
Propidium iodide stain | Images of propidium iodine stained DNA were captured by fluorescence microscopy at 100x magnification (100x/1.30 oil, Nikon) in the RFP channel (red excitation fluorescence filter, 663-738 nm) using identical exposition time (5 seconds). | ||
Workflow bioinformatic system | Galaxy, Open source. | A free web-based platform for data intensive biomedical research. References: Goecks, J, Nekrutenko, A, Taylor, J and The Galaxy Team. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 2010 Aug 25;11(8):R86. Blankenberg D, Von Kuster G, Coraor N, Ananda G, Lazarus R, Mangan M, Nekrutenko A, Taylor J. "Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists". Current Protocols in Molecular Biology. 2010 Jan; Chapter 19:Unit 19.10.1-21. Giardine B, Riemer C, Hardison RC, Burhans R, Elnitski L, Shah P, Zhang Y, Blankenberg D, Albert I, Taylor J, Miller W, Kent WJ, Nekrutenko A. "Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis." Genome Research. 2005 Oct; 15(10):1451-5. |