This paper presents a sensitive method called Circle-Seq for purifying extrachromosomal circular DNA (eccDNA). The method encompasses column purification, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification and high-throughput sequencing. Circle-Seq is applicable to genome-scale screening of eukaryotic eccDNA and studying genome instability and copy-number variation.
Экстрахромосомального кольцевых ДНК (eccDNAs) являются общие генетические элементы в Saccharomyces CEREVISIAE и представлены в других эукариот , а также. EccDNAs способствуют генетической изменчивости среди соматических клеток в многоклеточных организмах и эволюции одноклеточных эукариот. Чувствительные методы обнаружения eccDNA необходимы, чтобы выяснить, как эти элементы влияют на стабильность генома и, как экологические и биологические факторы вызывают их образование в эукариотических клетках. Это видео представляет собой чувствительный метод eccDNA-очистки под названием Circle-Seq. Способ включает в себя очистку столбца кольцевой ДНК, удаление остаточного линейного хромосомной ДНК, прокатный круг усиление eccDNA, глубокое секвенирование и картирование. Обширное лечение экзонуклеазная было необходимо для достаточной линейной деградации хромосомной ДНК. Шаг прокатки круга амплификацииINE-высота:. нормальный; "> φ 29 – полимераза обогащенные для кольцевых ДНК по линейной ДНК Проверка Кольцевой-Seq методом на трех S.cerevisiae , CEN.PK популяций 10 10 клеток обнаружены сотни профилей eccDNA в размерах , размер которых превышает 1 килобаза . Повторные находки ASP3-1, COS111, cup1, RSC30, HXT6, HXT7 генов на кольцевой ДНК в обоих S288c и CEN.PK предполагает , что ДНК циркуляризации сохраняется между напряжениями на этих локусов. в сумме, Круг-Seq метод имеет широкое применимость для генома масштабного скрининга на eccDNA в эукариот, а также для выявления специфических типов eccDNA.
Обнаружение ранней или переходную хромосомной амплификации трудно, поскольку она требует идентификации изменений в отдельных молекул ДНК в больших популяциях клеток. Хромосомные вариации копирования номер (ВКК) , как правило , обнаруживаются также после их создания, оставив только окончательную структуру CNV в качестве доказательства механизма , который сгенерировал вариации 1,2. Обнаружение и восстановление экстрахромосомного кольцевую ДНК (eccDNA) в ранних стадиях формирования CNV может пролить свет происходящие процессы в геномных перестроек.
Ранее De Novo открытие eccDNA было по электронной микрофотографии 3, Гимза окрашивания метафазных хромосом 4 или двухмерного электрофореза гель 5. Эти методы дают мало или нет информации о последовательности кольцевой ДНК. Адресные методы , такие как Саузерну 6,7, обратный PCR 8, или флуоресценцию на месте hybridizatio вп 9 свидетельствуют лишь о конкретных элементах eccDNA. Ни один из этих методов не обеспечивают последовательность всех существующих типов eccDNA в клеточной популяции.
Геномная расхождение в пуле клеток можно охарактеризовать секвенирование генома и / или облицовочных массивов 10,11. Детектирование удалений или амплификации обычными способами очистки ДНК , как правило , требует , чтобы мутировавший аллель , составляют не менее 0,1-1% от клеточной популяции 12,13. Ацентрический eccDNAs, как ожидается, будет еще более переходная в культуре клеток из-за их отсутствия центромерах и потенциального отсутствия синтеза ДНК при репликации. Таким образом, так как большинство eccDNAs предположительно находятся в небольших количествах и их последовательности напоминают геном, альтернативные методы экстракции ДНК необходимы для обнаружения eccDNAs.
Несколько круговых методов очистки ДНК используют структурные различия между хромосомами и кольцевой ДНК. Например, высокоскоростной ultracentrifugвания в цезий-хлоридно градиентов используется для изоляции 350-3000 пар оснований (п.о.) большие eccDNAs из человеческого HeLa клеток рака линии 14. Тем не менее, высокая скорость может привести к поломке или ник основу суперспиральных структур кольцевых ДНК, изменяя скорость 15 оседания и выход eccDNA. Датта и его коллеги разработали метод De Novo, геном масштаба идентификации кольцевых ДНК из тканей мышей, а также из культур куриных и человеческих клеток 16,17. Их метод извлечения ядер из гомогенизированной ткани с помощью ультрацентрифугирования сахарозы с последующей очисткой плазмиды и нескольких раундов ферментативных реакций и извлечения ДНК. Их протокол в основном идентифицирует 200-400 п.о. eccDNAs, называемые microDNAs. Датта и его коллеги также пытались очистку microDNAs из Saccharomyces CEREVISIAE , но не смогли записать microDNA из этих дрожжей вида 16.
Мы разработали новый методDe Novo обнаружение eccDNA из дрожжей под названием Circle-Seq. Этот метод позволяет геном масштабных обследований для кольцевых молекул ДНК достаточно большой, чтобы нести целые гены и как крупные, как 86 килобаза (кб) митохондриальной ДНК (мтДНК). Метод Круг-Seq был разработан с хорошо налаженной прокариотической плазмиды способа очистки 18,19, оптимизированная для эукариотических клеток дрожжей и в сочетании с глубоким секвенирования. Используя Круг-Seq подход, 1756 различных eccDNAs, все больше 1 Кб, были обнаружены из десяти S. CEREVISIAE S288c популяций 20. Размер отсечка был выбран, чтобы сосредоточиться на eccDNA, которые были достаточно большими, чтобы нести целые гены. Круг-Seq был очень чувствительным; он обнаружил одну eccDNA в пределах тысяч ячеек 20. В текущем исследовании, Круг-Seq был использован для выделения и идентификации 294 eccDNAs из трех биологических повторностях другого S. CEREVISIAE штамм дрожжей, CEN.PK. Данные показывают, что eccDNA является распространенным генетическим Elemeнт в S. CEREVISIAE штаммы.
Круг-Seq метод позволяет генома масштабе обнаружение eccDNA из дрожжевых клеток с разрешением на уровне последовательности. Этот метод является легкой очистки eccDNA, который не требует интенсивного завихрения или пипетирования и использует разделение колонки под действием силы тяжести, чтобы ограничить eccDNA поломки, что приведет к экзонуклеазной пищеварения на последующей стадии. Эти признаки способа могут иметь решающее значение для обнаружения крупных eccDNAs, содержащих последовательности генов. Круг-Seq обнаружены многочисленные eccDNAs включая полные генов (Dataset 1). Он также обнаружил 86 т.п.н. дрожжевой митохондриальной ДНК. Таким образом, этот протокол облегчает очистку больших элементов кольцевых ДНК. Сохранение количества стадий экстракции ДНК к минимуму снижает риск потери eccDNA и максимизирует доходность. На основе результатов контроля, подскочили в плазмид, Круг-Seq обладает высокой чувствительностью, выявляя одну кольцевую ДНК из 2500 клеток. Кроме того, удаление обильные эндогенные плазмид, такие как 2 мкм; плазмида или митохондриальной ДНК может значительно повысить чувствительность. Отверждение 2 мкм от дрожжевых культур было описано 30. В качестве альтернативы, 2μ и митохондриальной ДНК удаление могло бы быть достигнуто с редкой режущим эндонуклеазы, такой как SwaI. Тем не менее, шаг рестриктазы могут быть ориентированы на другие eccDNAs интересов и ограничить общий выход eccDNA.
Критические шаги для обнаружения eccDNA были удаление линейной ДНК (шаг 3) и секвенирования ДНК (этап 5) на нужную глубину. Для того, чтобы записать большинство eccDNAs из клеточной популяции, глубокое секвенирование может потребоваться 20. Парноконцевое секвенирование должен обеспечить еще большую уверенность обнаружения eccDNA, как и круговые перекрестки ДНК ожидается выход парноконцевое читает эту карту вразнобой. Эти расхождения поддерживают обнаружение кольцевых структур ДНК и потенциально могут быть использованы в качестве дополнительного фильтра eccDNA обнаружения.
Круг-Seд метод был проверен путем использования трех независимых S. популяции CEREVISIAE CEN.PK. Обнаруженные последовательности включенных ранее сообщалось eccDNAs, эндогенные плазмид и шипами в плазмид и сотни предполагаемых eccDNAs (Dataset 1). Эти данные подтверждают предыдущие Круг-Seq наборов данных из S. CEREVISIAE S288c 20. Открытие нескольких eccDNAs общих для населения CEN.PK и S288c указывает на то, что эти локусы имеют склонность существовать в виде круговых элементов (рисунок 4). Ранее мы показали , что [GAP1 круг] обогащен в атмосфере азота в ограниченных условиях в CEN.PK фоне 8, хотя доказательство [GAP1 круга] в других слоев штамма не было найдено. Нахождение eccDNA от CUP1-1 RSC30, ASP3-1, COS111 и HXT6 HXT7 локусов в обоих S288c и CEN.PK предполагает , что предрасположенность к циклизации ДНК является конподается между штаммами дрожжей. Остается показать , если [HXT6 / 7 круг], [ASP3-1 круг], [COS111 круг], и [CUP1-1 RSC30 круг] придают селективные преимущества клеток или если их существование является лишь следствием высоких темпов ДНК циркуляризации.
Взятые вместе, результаты указывают на то, что круг-Seq хорошо подходит для обнаружения килобаза размера eccDNAs и имеет преимущества для идентификации eccDNAs с полными генов. Круг-Seq является очень чувствительным методом, который позволяет целого генома масштаба экраны eccDNAs из дрожжей. Круг-Seq метод может открыть новое направление исследований, направленных на выяснение роли eccDNA в формировании гена делеции и уточнениями. Учитывая, что архитектура и структура ДНК в значительной степени законсервирован от дрожжей до эукариотической высших эукариот, Круг-Seq метод должен, в принципе, быть applicablе для всех эукариотических клеток, с незначительными изменениями. В настоящее время этот метод не содержит каких-либо ограничений, хотя его способность очищать Мегабазе размера eccDNAs еще предстоит доказать. Кроме того, использование ø29 ДНК – полимеразы, который использует способ амплификации прокатка круга 31, создает уклон в сторону меньших eccDNAs делая eccDNA Количественное более трудным. Круг-Seq обнаруживает eccDNAs достаточно большой, чтобы нести полные гены, что делает его пригодным для проведения исследований по двойному минут кольцевой ДНК из соматических клеток человека. Двойные минут могут способствовать к раку , когда протоонкогены усиливаются на этих элементах 32-37. Исследования eccDNAs в клетках зародышевой линии могут быть использованы для измерения частоты мутаций зародышевой линии и оценки качества спермы, например, в животноводстве. Таким образом, Круг-Seq имеет потенциал, чтобы уступить понимание скорости, при которой возникает генетическая изменчивость в виде вариации числа копий, и привести к новому пониманию заболеваний, которые включают ген от копированияИзменение числа 38-40.
The authors have nothing to disclose.
Thanks to Kenn D. Møller and Claus Sternberg (DTU) for technical assistance and to Tue S. Jørgensen for quantitative PCR analysis.
Bacto peptone | BD Difco | 211677 | Alternative product can be used. |
Brilliant III SYBR Green PCR Master Mix | Agilent Technologies | 600882 | For qPCR analysis. Alternative product can be used. |
Dextrose (D-glucose) | Carl Roth | HN06.4 | Alternative product can be used. |
Disruptor Beads, 0.5 mm | Scientific Industries, Inc. | SI-BG05 | Glass beads to disrupt plasma cell membranes. Alternative product can be used. |
Ethidium bromide | Carl Roth | 2218.2 | Agarose gel stain for detecting DNA/RNA. |
GeneJet plasmid miniprep kit | Thermo Fisher | K0502 | Plasmid purifcation from bacteria. Alternative product can be used |
NotI, FastDigest | Life Technologies - Thermo Fisher Scientific, USA | FD0594 | Endonuclease. Alternative product can be used. |
Plasmid Mini AX kit | A&A Biotechnology, Poland | 010-50 | Plasmid purifcation kit used to purify eccDNA. |
Plasmid-Safe ATP-dependent DNase kit | Epicentre, USA | E3105K | ATP-dependent exonuclease kit. Alternative product can be used. |
Propidium iodide | Sigma-Aldrich, USA | 81845 | Alternative product can be used. |
pUG6 plasmid | EUROSCARF, Germany | P30114 | Marker gene: loxP-PAgTEF1-kanMX-TAgTEF1-loxP. Plasmid requests: Please contact Dr. Peter Philippsen@unibas.ch |
QIAGEN genomic-tip 100/G | Qiagen, USA | 13343 | Genomic DNA purifcation from yeast. Alternative product can be used. |
REPLI-g Mini Kit protocol | Qiagen, USA | 150023 | Amplification of eccDNA by the phi29 polymerase |
Yeast extract | BD Difco | 210929 | Alternative product can be used. |
Zymolyase 100T (Lyticase, Yeast Lytic Enzyme) | Nordic BioSite, Sweden | Z1004-3 | Alternative product can be used. |
Data access to sequence files | European Nucleotide Archive | EccDNA dataset from Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D. Study accession number PRJEB9684. 2nd accession number is ERP010820. Locus tag prefix is BN2032. | |
Strains | |||
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | Genotype MATa MAL2-8c SUC2 | ||
Saccharomyces cerevisiae yeast deletion library pool | EUROSCARF, Germany | S288c BY4741 pool of 4400 viable single-gene deletion mutants disrubted by KanMX module. Genotypes MATa his3∆1 leu2∆0 met15∆0 ura3∆0 genexxx::KanMX. | |
Equipments | |||
DNA Spectrophotometer | NanoDrop 1000 Spectrophotometer, Thermo Fisher | Measuring DNA concentration. Alternative product can be used. | |
Fluorescence microscopy | Nikon Optronics Magnafire. Red excitation fluorescence filter, 663-738 nm. | Alternative product can be used. | |
Robotic library-build system | Apollo 324, IntegenX Inc. | DNA library preparation. Alternative product can be used. | |
Sequencing platform | Illumina HiSeq 2000 platform, Illumina Inc. | DNA sequencing. Alternative product can be used. | |
Ultrasonicator | Covaris LE220, microTUBE AFA Fiber tubes | Alternative product can be used. | |
Methods | |||
2% YPD media | Mix 10 g Dextrose, 10 g Yeast extract, 20 g Bacto peptone and add H2O to a total volume of 1000 ml and autoclave. | ||
Circle-Seq test on genomic DNA | Genomic DNA was purified (Qiagen) from a pool of the yeast deletion library (Euroscarf). The DNA concentration was measured by nanodrop and 30 µg genomic DNA was pipetted into two micro centrifuge tubes. One micro centrifuge tube was supplemented with 100 nanogram plasmid (pUG6). The DNA samples were purified by Circle-Seq, omitting the protocol steps 1.1-1.3 and 1.5-1.7. The eluted DNA concentrations were measured by nanodrop and the entire DNA yield from sample GD and GD+P was treated with exonuclease for a period of 29 hours. A 10% fraction was collected for phi29-amplification and PCR analysis, while the remaining DNA was subjected to 72 hour exonuclease treatment. The samples were analyzed for linear DNA content by PCR, using the ACT1 gene as chromosomal marker. A 5% fraction of each of the exonuclease treated samples was amplified by the phi29 DNA polymerase for 16 hours (Qiagen). The presence of DNA in each sample was examined by loading an equal amount (7 µl) in wells on an 0.5 µg/ml ethidium-bromide 0.9% agarose gel after running gel-electrophoresis. | ||
Mapping software | Bowtie2 aligner, John Hopkins University | Ultrafast short read alignment. Reference: Langmead B, Salzberg S. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 2012, 9:357-359. | |
Propidium iodide stain | Images of propidium iodine stained DNA were captured by fluorescence microscopy at 100x magnification (100x/1.30 oil, Nikon) in the RFP channel (red excitation fluorescence filter, 663-738 nm) using identical exposition time (5 seconds). | ||
Workflow bioinformatic system | Galaxy, Open source. | A free web-based platform for data intensive biomedical research. References: Goecks, J, Nekrutenko, A, Taylor, J and The Galaxy Team. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 2010 Aug 25;11(8):R86. Blankenberg D, Von Kuster G, Coraor N, Ananda G, Lazarus R, Mangan M, Nekrutenko A, Taylor J. "Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists". Current Protocols in Molecular Biology. 2010 Jan; Chapter 19:Unit 19.10.1-21. Giardine B, Riemer C, Hardison RC, Burhans R, Elnitski L, Shah P, Zhang Y, Blankenberg D, Albert I, Taylor J, Miller W, Kent WJ, Nekrutenko A. "Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis." Genome Research. 2005 Oct; 15(10):1451-5. |