This paper presents a sensitive method called Circle-Seq for purifying extrachromosomal circular DNA (eccDNA). The method encompasses column purification, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification and high-throughput sequencing. Circle-Seq is applicable to genome-scale screening of eukaryotic eccDNA and studying genome instability and copy-number variation.
Extrakromosomala cirkulära DNA (eccDNAs) är vanliga genetiska element i Saccharomyces cerevisiae och redovisas i andra eukaryoter också. EccDNAs bidra till genetisk variation bland somatiska celler i flercelliga organismer och utvecklingen av encelliga eukaryoter. Känsliga metoder för att detektera eccDNA behövs för att klargöra hur dessa faktorer påverkar genomet stabilitet och hur miljömässiga och biologiska faktorer inducerar deras bildning i eukaryota celler. Denna video presenterar en känslig eccDNA-reningsmetod kallad Circle-Seq. Metoden omfattar kolonnrening av cirkulärt DNA, avlägsnande av återstående linjär kromosomalt DNA, rullande-cirkel förstärkning av eccDNA, djup sekvensering och kartläggning. Omfattande exonukleasbehandling krävdes för tillräcklig linjär kromosomalt DNA nedbrytning. Den rullande cirkel förstärkning stegINE-height:. normal; "> φ 29 polymeras berikat för cirkulärt DNA över linjär DNA Validering av Circle-Seq metod på tre S. cerevisiae CEN.PK populationer av 10 10 celler detekterades hundratals eccDNA profiler i storlekar större än 1 kb . Upprepade resultaten av ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30, HXT6, HXT7 gener på cirkulärt DNA i både S288C och CEN.PK tyder på att DNA cirkel är bevarad mellan stammar vid dessa loci. Sammanfattningsvis har Circle-Seq metod bred tillämpbarhet för genomet skala screening för eccDNA i eukaryoter samt för att detektera specifika eccDNA typer.
Upptäcka tidigt eller övergående kromosom förstärkning är svårt eftersom det kräver att identifiera förändringar i enstaka DNA-molekyler i stora populationer av celler. Kromosom kopietal variationer (CNVs) i allmänhet upptäcks långt efter deras etablering, vilket innebär att endast den sista CNV struktur som ett bevis på den mekanism som genererade variationen 1,2. Upptäcka och återvinna extrakromosomalt cirkulärt DNA (eccDNA) i tidigare stadier av CNV bildning kan belysa pågående processer i iska omflyttningar.
Tidigare, de novo upptäckten av eccDNA skedde genom elektronmikrofotografier 3, Giemsa-färgning av metafaskromosomer 4, eller två-dimensionell gelelektrofores 5. Dessa metoder ger lite eller ingen information om sekvensen för den cirkulära DNA. Riktade tekniker såsom Southern blotting 6,7, omvänd PCR 8, eller fluorescens in situ hybridization 9 bevisa bara om specifika eccDNA element. Ingen av dessa metoder ger den sekvens av alla befintliga eccDNA typer i en cellpopulation.
Genomisk divergens i en pool av celler kan karakteriseras av genomet sekvensering och / eller kakel matriser 10,11. Detektering av en deletion eller förstärkning av konventionella DNA reningsmetoder kräver oftast att en muterad allel representerar minst 0,1-1% av cellpopulationen 12,13. Acentrisk eccDNAs förväntas bli ännu mer övergående i en cellkultur på grund av deras brist på centromerer och potentiella frånvaro av DNA-syntes vid replikering. Således, eftersom de flesta eccDNAs förmodligen är i små mängder och deras sekvenser likna genomet, är alternativa DNA extraktionsmetoder som behövs för att upptäcka eccDNAs.
Flera cirkulära DNA reningstekniker utnyttjar de strukturella skillnaderna mellan kromosomer och cirkulärt DNA. Till exempel, höghastighets ultracentrifugation i cesium-klorid gradienter används för att isolera 350-3000 baspar (bp) stora eccDNAs från den humana HeLa cancercell linjen 14. Däremot kan hög hastighet sönder eller nick ryggraden i supertvinnade cirkulära DNA-strukturer, ändra sedimenteringshastighet 15 och eccDNA avkastning. Dutta och medarbetare utvecklat en metod för de novo, genomet skala identifiering av cirkulärt DNA från mus vävnader samt från kulturer av kyckling och mänskliga celler 16,17. Deras metod är extraktion av kärnor från homogeniserad vävnad från sackaros ultracentrifugering följt av plasmid rening och flera omgångar av enzymatiska reaktioner och DNA-extraktioner. Deras protokoll identifierar främst 200-400 bp eccDNAs, kallas microDNAs. Dutta och medarbetare försökte också rening av microDNAs från Saccharomyces cerevisiae men kunde inte spela microDNA från denna jästarter 16.
Vi har utvecklat en ny metod förde novo detektering av eccDNA från jäst kallas Circle-Seq. Denna metod gör det möjligt genom omfattande undersökningar för cirkulära DNA-molekyler som är tillräckligt stora för att bära hela gener och så stora som 86 kb (kb) mitokondrie-DNA (mtDNA). Cirkeln-Seq metoden utvecklades från en väletablerad prokaryot plasmid reningsmetod 18,19, optimerad för eukaryota jästceller och i kombination med djup sekvensering. Använda Circle-Seq tillvägagångssätt, 1756 olika eccDNAs, allt större än en kb, upptäcktes från tio S. cerevisiae S288C Populationer 20. En storlek cut-off har valt att fokusera på eccDNA som var tillräckligt stor för att bära hela gener. Circle-Seq var mycket känsliga; det upptäckt ett enda eccDNA inom tusentals celler 20. I den aktuella studien var Circle-Seq användas för att isolera och identifiera 294 eccDNAs från tre biologiska replikat av en annan S. cerevisiae jäststam, CEN.PK. Datan visar att eccDNA är en vanlig genetisk element i S. cerevisiae-stammar.
Cirkeln-Seq metod tillåter genomet skala detektering av eccDNA från jästceller med sekvens nivå upplösning. Metoden är en mild eccDNA rening som inte kräver intensiv virvel eller pipettering och använder kolonnseparation av tyngdkraften för att begränsa eccDNA brott som skulle leda till exonukleasdigestion i det efterföljande steget. Dessa särdrag hos förfarandet kan vara avgörande för att detektera stora eccDNAs som innehåller gensekvenser. Circle-Seq upptäckt många eccDNAs inklusive fullständiga gener (Dataset 1). Det upptäcks också 86-kb jäst mitokondrie-DNA. Således underlättar detta protokoll rening av stora cirkulära DNA-element. Att hålla antalet DNA-extraktionssteg till ett minimum minskar risken för eccDNA förlust och maximerar utbyte. Baserat på resultat kontroll spetsade in plasmider, är Circle-Seq mycket känslig, upptäcka en enda cirkulär DNA från 2500 celler. Dessutom, ta bort överflödande endogena plasmider såsom 2μ; plasmid eller mitokondrie-DNA kan avsevärt förbättra känsligheten. Härdning av 2μ från jästkulturer har beskrivits 30. Alternativt kan 2μ och mitokondrie-DNA avlägsnande åstadkommas med en sällsynt skär endonukleas, såsom Swal. Emellertid kan restriktionsenzymsteget rikta andra eccDNAs av intresse och begränsa den totala eccDNA avkastning.
Kritiska steg för eccDNA detektion var avlägsnande av linjärt DNA (steg 3) och DNA-sekvensering (steg 5) till ett lämpligt djup. För att spela in de flesta eccDNAs från en cellpopulation kan djupa sekvense krävas 20. Parade slut sekvensering bör ge ännu större förtroende eccDNA upptäckt, som cirkulära DNA-korsningar förväntas ge parade slut läser den kartan discordantly. Dessa skillnader stödjer upptäckten av cirkulära DNA-strukturer och kan potentiellt användas som ett extra eccDNA detekteringsfilter.
Cirkeln-Seq metod validerades med tre oberoende S. cerevisiae CEN.PK populationer. Upptäckta sekvenser ingår tidigare rapporterat eccDNAs, endogena plasmider och spetsade in plasmider och hundratals förmodade eccDNAs (Dataset 1). Dessa resultat stöder tidigare Circle-Seq datamängder från S. cerevisiae S288C 20. Upptäckten av flera eccDNAs gemensamma CEN.PK och S288C populationer tyder på att dessa loci har en benägenhet att existera som cirkulära element (Figur 4). Vi har tidigare visat att [GAP1 cirkel] berikas under kväve begränsade förhållanden i CEN.PK bakgrunden 8, även om tecken på [GAP1 cirkel] i annan stam bakgrunder inte har hittats. Konstaterande av eccDNA från CUP1-1 RSC30, ASP3-1, COS111 och HXT6 HXT7 loci i både S288C och CEN.PK tyder på att ett anlag för DNA circularization är conserveras mellan jäststammarna. Det återstår att visa om [HXT6 / 7 cirkel], [ASP3-1 cirkel], [COS111 cirkel] och [CUP1-1 RSC30 cirkel] ger selektiva fördelar till celler eller om deras existens är bara en effekt av höga DNA cirkularisering.
Sammantaget tyder resultaten på att Circle-Seq är väl lämpad för att detektera kilostora eccDNAs och har fördelar för att identifiera eccDNAs med kompletta gener. Circle-Seq är en mycket känslig metod som möjliggör hela genomet skala skärmar eccDNAs från jäst. Cirkeln-Seq metod kan öppna ett nytt fält av forskning som syftar till att belysa den roll som eccDNA att generera gen deletioner och förstärkningar. Med tanke på att DNA-arkitektur och struktur är i stort sett bevarad från eukaryot jäst till högre eukaryoter, cirkeln-Seq metod bör i princip vara applicable till alla eukaryota celler, med smärre ändringar. För närvarande innebär metoden inte verkar ha några begränsningar, även om dess förmåga att rena megabas stora eccDNAs har ännu inte visas. Dessutom kan användningen av Ø29 DNA-polymeras, som använder en rullande-cirkel amplifieringsmetoden 31, skapar en bias mot mindre eccDNAs gör eccDNA kvantifiering svårare. Circle-Seq upptäcker eccDNAs stora nog att bära hela gener, vilket gör den lämplig för studier av dubbla minuter-cirkulära DNA från humana somatiska celler. Dubbla minuter kan bidra till cancer när proto-onkogener förstärks på dessa element 32-37. Studier av eccDNAs i nedärvda celler kunde användas för att mäta nedärvda mutationshastigheter och bedöma spermakvaliteten, exempelvis i boskap. Sålunda har Circle-Seq potential att ge insikter i den hastighet med vilken genetisk variation uppstår i form av kopietalet variation, och leda till en ny förståelse av sjukdomar som involverar gen upphovsrättnummer variation 38-40.
The authors have nothing to disclose.
Thanks to Kenn D. Møller and Claus Sternberg (DTU) for technical assistance and to Tue S. Jørgensen for quantitative PCR analysis.
Bacto peptone | BD Difco | 211677 | Alternative product can be used. |
Brilliant III SYBR Green PCR Master Mix | Agilent Technologies | 600882 | For qPCR analysis. Alternative product can be used. |
Dextrose (D-glucose) | Carl Roth | HN06.4 | Alternative product can be used. |
Disruptor Beads, 0.5 mm | Scientific Industries, Inc. | SI-BG05 | Glass beads to disrupt plasma cell membranes. Alternative product can be used. |
Ethidium bromide | Carl Roth | 2218.2 | Agarose gel stain for detecting DNA/RNA. |
GeneJet plasmid miniprep kit | Thermo Fisher | K0502 | Plasmid purifcation from bacteria. Alternative product can be used |
NotI, FastDigest | Life Technologies - Thermo Fisher Scientific, USA | FD0594 | Endonuclease. Alternative product can be used. |
Plasmid Mini AX kit | A&A Biotechnology, Poland | 010-50 | Plasmid purifcation kit used to purify eccDNA. |
Plasmid-Safe ATP-dependent DNase kit | Epicentre, USA | E3105K | ATP-dependent exonuclease kit. Alternative product can be used. |
Propidium iodide | Sigma-Aldrich, USA | 81845 | Alternative product can be used. |
pUG6 plasmid | EUROSCARF, Germany | P30114 | Marker gene: loxP-PAgTEF1-kanMX-TAgTEF1-loxP. Plasmid requests: Please contact Dr. Peter Philippsen@unibas.ch |
QIAGEN genomic-tip 100/G | Qiagen, USA | 13343 | Genomic DNA purifcation from yeast. Alternative product can be used. |
REPLI-g Mini Kit protocol | Qiagen, USA | 150023 | Amplification of eccDNA by the phi29 polymerase |
Yeast extract | BD Difco | 210929 | Alternative product can be used. |
Zymolyase 100T (Lyticase, Yeast Lytic Enzyme) | Nordic BioSite, Sweden | Z1004-3 | Alternative product can be used. |
Data access to sequence files | European Nucleotide Archive | EccDNA dataset from Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D. Study accession number PRJEB9684. 2nd accession number is ERP010820. Locus tag prefix is BN2032. | |
Strains | |||
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | Genotype MATa MAL2-8c SUC2 | ||
Saccharomyces cerevisiae yeast deletion library pool | EUROSCARF, Germany | S288c BY4741 pool of 4400 viable single-gene deletion mutants disrubted by KanMX module. Genotypes MATa his3∆1 leu2∆0 met15∆0 ura3∆0 genexxx::KanMX. | |
Equipments | |||
DNA Spectrophotometer | NanoDrop 1000 Spectrophotometer, Thermo Fisher | Measuring DNA concentration. Alternative product can be used. | |
Fluorescence microscopy | Nikon Optronics Magnafire. Red excitation fluorescence filter, 663-738 nm. | Alternative product can be used. | |
Robotic library-build system | Apollo 324, IntegenX Inc. | DNA library preparation. Alternative product can be used. | |
Sequencing platform | Illumina HiSeq 2000 platform, Illumina Inc. | DNA sequencing. Alternative product can be used. | |
Ultrasonicator | Covaris LE220, microTUBE AFA Fiber tubes | Alternative product can be used. | |
Methods | |||
2% YPD media | Mix 10 g Dextrose, 10 g Yeast extract, 20 g Bacto peptone and add H2O to a total volume of 1000 ml and autoclave. | ||
Circle-Seq test on genomic DNA | Genomic DNA was purified (Qiagen) from a pool of the yeast deletion library (Euroscarf). The DNA concentration was measured by nanodrop and 30 µg genomic DNA was pipetted into two micro centrifuge tubes. One micro centrifuge tube was supplemented with 100 nanogram plasmid (pUG6). The DNA samples were purified by Circle-Seq, omitting the protocol steps 1.1-1.3 and 1.5-1.7. The eluted DNA concentrations were measured by nanodrop and the entire DNA yield from sample GD and GD+P was treated with exonuclease for a period of 29 hours. A 10% fraction was collected for phi29-amplification and PCR analysis, while the remaining DNA was subjected to 72 hour exonuclease treatment. The samples were analyzed for linear DNA content by PCR, using the ACT1 gene as chromosomal marker. A 5% fraction of each of the exonuclease treated samples was amplified by the phi29 DNA polymerase for 16 hours (Qiagen). The presence of DNA in each sample was examined by loading an equal amount (7 µl) in wells on an 0.5 µg/ml ethidium-bromide 0.9% agarose gel after running gel-electrophoresis. | ||
Mapping software | Bowtie2 aligner, John Hopkins University | Ultrafast short read alignment. Reference: Langmead B, Salzberg S. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 2012, 9:357-359. | |
Propidium iodide stain | Images of propidium iodine stained DNA were captured by fluorescence microscopy at 100x magnification (100x/1.30 oil, Nikon) in the RFP channel (red excitation fluorescence filter, 663-738 nm) using identical exposition time (5 seconds). | ||
Workflow bioinformatic system | Galaxy, Open source. | A free web-based platform for data intensive biomedical research. References: Goecks, J, Nekrutenko, A, Taylor, J and The Galaxy Team. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 2010 Aug 25;11(8):R86. Blankenberg D, Von Kuster G, Coraor N, Ananda G, Lazarus R, Mangan M, Nekrutenko A, Taylor J. "Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists". Current Protocols in Molecular Biology. 2010 Jan; Chapter 19:Unit 19.10.1-21. Giardine B, Riemer C, Hardison RC, Burhans R, Elnitski L, Shah P, Zhang Y, Blankenberg D, Albert I, Taylor J, Miller W, Kent WJ, Nekrutenko A. "Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis." Genome Research. 2005 Oct; 15(10):1451-5. |