Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Nefrotoxische substantie Micro-injectie in zebravis tot acuut nierfalen Model

Published: July 17, 2016 doi: 10.3791/54241
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Center for Zebrafish Research, Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Center for Stem Cells and Regenerative Medicine, Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

Summary

Renal verwondingen opgelopen van nephrotoxins, die drugs, variërend van antibiotica tot chemotherapeutica omvatten, kan leiden tot complexe aandoeningen waarvan de pathogenese blijft onvolledig begrepen. Dit protocol laat zien hoe zebravis kan worden gebruikt voor ziektemodel van deze aandoeningen, die kunnen worden toegepast voor het identificeren van renoprotectieve maatregelen.

Abstract

De nieren zijn gevoelig voor schade door blootstelling aan chemische stoffen ze filteren uit de bloedstroom. Dit kan leiden tot orgaanschade tot een snelle afname van de nierfunctie en de ontwikkeling van klinisch syndroom genoemd acuut nierfalen (AKI). Farmacologische middelen gebruikt medische omstandigheden variërend van bacteriële infectie kanker te behandelen wanneer afzonderlijk toegediend of in combinatie met andere geneesmiddelen, kunnen AKI initiëren. Zebravis een bruikbaar diermodel om chemische effecten op de nierfunctie te bestuderen in vivo, aangezien zij een embryonale nier bestaat uit nefron functionele eenheden die zijn geconserveerd met hogere gewervelde dieren, waaronder mensen. Verder kunnen zebravissen worden toegepast voor genetische en chemische schermen, die mogelijkheden om de cellulaire en moleculaire aspecten van AKI helderen en therapeutische strategieën zoals het identificeren van moleculen nefroprotectief ontwikkelen verschaffen voeren. Hier laten we zien hoe micro-injectie in dezebravisembryo kan worden gebruikt als een paradigma voor nefrotoxische substantie studies.

Introduction

AKI is een abrupt verlies van nierfunctie die kunnen leiden tot verwoestende gevolgen voor de gezondheid 1. AKI is een belangrijke kwestie in de gezondheidszorg over de hele wereld vanwege de hoge incidentie van ongeveer 20% bij gehospitaliseerde patiënten, met een nog hogere percentages van 30-50% in intensive care gevallen en ouderen, en sterftecijfers van 50-70% 1-3. Helaas is de prevalentie van AKI is toegenomen en zal naar verwachting verder escaleren de komende tien jaar, mede als gevolg van de diversiteit van de factoren die de AKI kan induceren, die post-operatieve stress, ischemie, en de blootstelling aan nephrotoxins zoals antibiotica en omvatten chemotherapeutica 4.

AKI gaat plotselinge cellulaire schade in de nier, voorkomende in nefronen, die de wezenlijke functionele elementen zijn en bestaan ​​uit een bloedfilter en een gesegmenteerde tubulus die uitmondt in urine centrale verzamelbuizen 1. Wanneer een significant aantal nefronenbeschadigd tijdens AKI, de onmiddellijke gevolgen zijn onder andere een onderbreking in de klaring van afval uit de circulatie en verminderd of afgeschaft vloeistofstroom door nefronen wegens obstructie van dode en stervende cellen 1. Na verloop van tijd kan buisvormige obstructie leiden tot degeneratie van de gehele nefronen, die permanent vermindert de nierfunctie 1. Fysiologische veranderingen in de nier na AKI omvatten ook complexe inflammatoire gebeurtenissen die kunnen leiden tot chronische littekenvorming 1.

Ondanks deze resultaten, hebben een aantal nefronen capaciteit om regeneratie te ondergaan na AKI dat de buisvormige epitheel 5,6 reconstitutes. Hoewel er een toenemende moleculair begrip van nephron regeneratie is geweest, de mechanismen blijven ongrijpbaar in veel opzichten en noodzaken verder onderzoek 7. De mate waarin AKI tot blijvende nierbeschadiging nog onbekend zijn. Lopend onderzoek suggereert dat de regeneratieve potentieel voor de nieren is dehoogste volgende minder ernstige gevallen van AKI, terwijl meer uitgesproken of herhaalde episodes leiden tot chronische nierziekte (CKD) en uitmonden in eindstadium nierziekte (ESRD) die levensreddende transplantatie of dialyse 8,9 vereist. Bovendien, mensen die reeds lijden aan CKD zijn op een nog hoger risico op een ernstige episode van AKI 8,9. Samengevat blijkt dat continue fundamenteel en klinisch onderzoek is cruciaal om te begrijpen, behandelen en voorkomen AKI.

Onderzoek met diermodellen is behulpzaam geweest bij het ​​waarderen van de progressie van de lokale en ecologische veranderingen die optreden tijdens de AKI 10 geweest. Om dit inzicht te breiden en nieuwe behandelingen te ontwikkelen, heeft de zebravis diermodel toegepast op verschillende manieren 11,12. De nefronen van de zebravis nier, in zowel het embryo en volwassen, een hoge mate van conservering met zoogdieren 13-16. Verder nefron epitheliale schade in ZEbrafish lijkt op de werkwijze in hogere vertebraten, waarbij de lokale vernietiging van tubulaire cellen wordt gevolgd door intratubulaire proliferatie en herstel van nefron architectuur 17-19. In het embryo echter grote tubulus schade van de nephrotoxins zoals cisplatine is gekoppeld letaliteit 20,21. Ter vergelijking, de zebravis volwassenen overleven AKI en vertonen inhoudelijke regeneratieve mogelijkheden in de nier. Bijvoorbeeld, na blootstelling aan de aminoglycoside antibiotica gentamicine, zebravis regenereren tubulus epitheelbeschadiging en groeien nieuwe nefroneenheden en 22-24. Hoewel deze gentamicine-geïnduceerde AKI studies waardevolle informatie hebben ontvangen, begrijpen nierschade uit diverse nephrotoxins blijft kritisch voor de werking en de reactie op verschillende soorten schade 25 waarderen.

De zebravis embryo, door zijn omvang, transparantie, en genetische traceerbaarheid, heeft vele voordelen voor de nefrotoxische substantie studies <sup> 25, waarbij de werkwijze van micro-injectie 20,21 wordt gebruikt om het molecuul (en) voor onderzoek beheren. Nefronen worden gevormd door 24 uur na de bevruchting (HPF) en beginnen om bloed te filteren op ongeveer 48 HPF 26,27. Dus de snelle vorming en functie van de embryonale nier vergemakkelijkt experimentele analyse. Echter, het proces van micro-injectie heeft technische uitdagingen en er kan een steile leercurve voor het beheersen van de techniek. In deze video artikel beschrijven we hoe de micro-injecties uit te voeren en geven tips voor het oplossen van problemen met het oog op de snelheid van de succesvolle injecties verbeteren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De procedures voor het werken met de zebravis embryo's beschreven in dit protocol werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van Notre Dame.

1. Voorbereiding van de Solutions

  1. Wordt 50x voorraadoplossing van E3 embryomedium door mengen van 73,0 g NaCl, 3,15 g KCI, 9,15 g CaCl 2 en 9,95 g MgSO 4 in 5 liter gedestilleerd water, en bewaar bij kamertemperatuur.
  2. Voor het kweken van zebravis embryo verdunnen 50x voorraadoplossing van E3 embryo afdrukmateriaal een 1x werkoplossing met gedestilleerd water, voeg vervolgens 200 pl 0,05% methyleenblauw elk 1 liter 1x E3 om als fungicide en bewaar bij RT.
  3. Maak een pigmentatie blokkerende oplossing van E3 embryo medium met 0,003% 1-fenyl-2-thioureum (PTU) door het combineren van 40 ml van de 50x E3 voorraad met 0,06 mg PTU. Breng dan het volume op een totaal van 2 L met gedestilleerd water.
  4. Roer de E3 / PTU O / N bij kamertemperatuur aan de PTU poeder te krijgen in de oplossing. op te slaan dan de E3 / PTU opRT.
    Opmerking: De E3 / PTU heeft een houdbaarheid van ongeveer één week en oudere oplossingen minder effectief in het blokkeren pigmentatie ontwikkeling bij zebravis larven.
  5. Maak een anestheticum van 0,2% tricaïne (MS-222) door het toevoegen van 1 g tricaïne aan 500 ml gedestilleerd water en op pH 7,2 met 1 M Tris, pH 9,5.
  6. Bereid een 2% methylcellulose oplossing imaging maken door een oplossing van 1 x E3 (geen methyleenblauw), met 1/10 volume van 0,2% tricaïne toegevoegd bij 4 ° C.
    Opmerking: De methylcellulose oplossing is een dikke, heldere oplossing die wordt gebruikt om voorzichtig stabiliseren levende embryo's voor microscopie. Na manipulaties worden uitgevoerd kunnen de embryo's in 1x E3 worden gewassen om de methylcellulose ontbinden, zonder verwonden het dier en het mogelijk maken microscopie in de volgende fasen in hetzelfde monster.
  7. Wanneer afgekoeld tot 4 ° C, roer het 1x E3 / tricaïne oplossing krachtig op een roer plaat en voeg geleidelijk de juiste hoeveelheid methylcellulosepoeder en tegelijkertijd krachtig te roeren. Voeg geleidelijk het poeder aan de oplossing om de vorming van onoplosbare aggregaten methylcellulose voorkomen.
  8. Nadat al het poeder in de 2% methylcellulose / E3 / tricaïne oplossing wordt gemengd, roer de samengestelde oplossing in het 4 ° C koude kamer O / N.
    Opmerking: De koude temperatuur is het beste voor volledig oplossen van het poeder. Als de oplossing niet helder na één nacht roeren gedurende nog werkdag en / of een tweede O / N.
  9. Luchtbellen gedurende 30 minuten of tot 2 uur uit de 2% methylcellulose / E3 / tricaïne oplossing aliquot het mengsel in 1,5 ml buisjes en centrifugeren op hoge snelheid (12.000 x g) bij 4 ° C.
  10. Plaats de 2% methylcellulose / E3 / tricaïne oplossing bij 4 ° C voor langdurige opslag.
    Opmerking: Voorafgaand aan het gebruik, monsters moeten vooraf worden opgewarmd tot RT voor het werken met de zebravis exemplaren.

2. Voorbereiding van de Hulpmiddelen

  1. Bereid een embryo manipulator tool, gebruikt voor popositionere embryo's voor micro-injectie, door het aanbrengen van een gel geladen tip over het einde van een 5 "straight ontleden naald, en veilig met tape of secondenlijm.
  2. Bereid micro-injectie naalden met behulp van een naald trekker, door eerst een brand plaatsen van gepolijst 10 cm borosilicaatglas met filament in het instrument en zet de borosilicaatglas door het aandraaien van de handgrepen.
  3. Trek de borosilicaatglas fine-taps toelopende naalden mode. Gebruik de volgende instellingen: verwarm 540, trek 245, snelheid 200, en de tijd 125.
  4. Plaats naalden in een petrischaal, de schorsing ze op een strook van boetseerklei ter bescherming van de naald tips, en houdt het gerecht afgedekt om stofophoping te voorkomen.
  5. Om te eindigen de voorbereiding van de naald voor micro-injecties, gebruik dan een scheermesje of fijne tang rand naar het trok einde van de naald te snijden tot een scherpe hoek injectie tip te maken met een diameter van ongeveer 0,05-0,1 mm.
  6. Om de micro-injectie lade te maken, bereiden een 1,5% agarose / E3 oplossing in een 100 ml Erlenmeyer kolf en los de agarose door verhitting van het E3 aan de kook in een magnetron laat afkoelen bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 10 minuten.
  7. Giet de afgekoelde agarose / E3 oplossing in een petrischaal op een fundering te maken met een diepte van ongeveer 0,5 cm. Wanneer deze gestold giet een tweede laag met een diepte van ongeveer 0,3 cm en plaats de geprefabriceerde embryo goed vorm en laat de agarose te stollen bij kamertemperatuur.
    Opmerking: Bij het plaatsen van de matrijs in de topagar / E3 laag, het plaatsen van de matrijs in de agar onder een hoek met het aantal luchtbellen verminderen.
  8. Wanneer de hele micro-injectie lade is ingesteld, til de geprefabriceerde embryo goed kneden langzaam en voorzichtig met een scoopula, vul dan de schotel met E3-oplossing en bewaar bij 4 ° C.

3. Embryo Voorbereiding

  1. Opgericht zebravis paring tanks door het plaatsen van verdelers in paring kamers en vul met het systeem water.
  2. Plaats een vis aan weerszijden van de scheidingslijn such dat elke paring kamer bevat een vrouwelijke en een mannelijke vissen, en elk paring kamer.
  3. De volgende ochtend, verwijder de verdelers te paaien in te schakelen.
  4. Controleer de vis na ongeveer 30 minuten, en na terugkomst van de volwassenen om het aquarium, het verzamelen van hun embryo's door het passeren van de paring tank water door een fijne gaas zeef tool.
  5. Inverteer de zeef in een petrischaal en spoel met E3 de embryo's te verzamelen.
  6. Incubeer de embryo's bij 28,5 ° CO / N.
  7. Wanneer de embryo's 24-26 somiet fase 26 hebben bereikt, decanteren meeste E3 media en vervolgens dechorionate door toevoeging van 100 pl 50 mg / ml pronase elk gerecht embryo en incuberen van de schaal bij kamertemperatuur (23 ° C) gedurende ongeveer 15 min.
    Opmerking: Het duurt ongeveer 24-25 uur neemt vanaf het moment van de bevruchting embryo naar 24-26 somiet stadium te bereiken wanneer zij worden verzameld op de wijze beschreven en geïncubeerd O / N bij 28,5 ° C.
  8. Vul het gerecht metE3 en dan schud zachtjes aan de chorions van de embryo's te verwijderen.
  9. Giet het E3 / pronase en spoel de schaal met 25 ml vers E3. Herhaal spoeling stap om alle pronase te verwijderen.
  10. Om de ontwikkeling van pigmentatie te blokkeren, giet de E3 en vervangen door 25 ml vers E3 / PTU wanneer de embryo's 24 uur na de bevruchting hebben bereikt.
    Opmerking: Voor experimenten een aantal dagen verspreid, vervang dan de E3 / PTU oplossing met verse media eenmaal per dag om de schotel schoon te houden.

4. Micro-injectie van Toxine dat nierweefsel Solution

  1. Op de dag van de injectie, de voorbereiding van de gewenste nefrotoxische substantie oplossing, samen met de juiste controle over het voertuig.
  2. Vortex of meng zachtjes om het geneesmiddel (en) verzekerd is / zijn opgelost, het controleren van de zijkanten van de buis en de bovenkant van de waterkolom.
    Opmerking: Toxine dat nierweefsel oplossingen kunnen worden bereid zijn om sporen van fluorescent geconjugeerd dextran bevatten micro-injectie efficiëntie te monitoren en ook renale klaring beoordelen op subsequent tijdstippen 20,28.
  3. Laad een bijgesneden micro-injectie naald met ~ 2-3 pi van de nefrotoxische substantie door rijgen een fijne gel geladen tip in de achterkant van de naald en verticaal op te schorten van de naald met een stuk tape om de oplossing om de bijgesneden naald te vullen door de zwaartekracht.
  4. Zodra de naald vol is, zet de geladen naald in de micromanipulator.
  5. Test de micro-injectie volume door een druppel minerale olie op een micrometer en injecteren in de olie de druppelgrootte evalueren. Een injectievolume van 500 pl heeft een diameter van 0,1 mm.
  6. Verwijder de schotel van embryo's uit de incubator en verdoven door toevoeging van ongeveer 5 ml 0,2% tricaïne het embryo schotel.
  7. Om een ​​volledige verdoving te garanderen, zachtjes aanraken embryo met de punt van het embryo manipulator tool. Gebrek aan beweging geeft voldoende verdoving.
  8. Na een succesvolle verdoving, transfer embryo's naar de spuitgietmatrijs met een transfer pipet.
  9. Manoeuvreren elk embryo in een ander putje van de matrijs plaatsen van de kop in het diepste gebied van de put zodat de romp ligt langs de depressie en de staart steekt uit het depressie.
  10. Steek de gevulde naald in de micromanipulator en plaats de naald naast een embryo.
  11. Steek de naald in de staart vat door de joystick naar voren te bewegen en druk het voetpedaal aan de micro-injectie te leveren.
    Opmerking: Succesvolle injectie kan worden gemeten door te kijken naar de vloeistof in omloop gebracht. Verder co-injectie van de nephrotoxicant met fluorescent geconjugeerde dextran kan de onderzoeker succesvolle injectie na de procedure te controleren.
  12. Trek terug op de joystick om de naald van de embryo te verwijderen.
  13. Na injectie, overdracht van de embryo's om een ​​schone schotel en spoel de tricaïne te verwijderen en te vervangen door verse E3 / PTU.
  14. Incubeer de embryo naar het gewenste tijdstip om te beoordelens morfologie, die door de fotografie kan worden gedocumenteerd in methylcellulose montage media, of het proces voor experimentele analyse zoals gewenst.
    Opmerking: Herstel van embryo's worden beoordeeld op het percentage individuen met oedeem, dat vaak aangeeft nierbeschadiging bepalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een micro-injectie station opgezet is voorzien van een stereomicroscoop, micromanipulator en drukregelaar (Figuur 1A). Transilluminatie van de injectieplaat voorkeur om monsters te zien tijdens deze procedure (Figuur 1B). Bereiding van de injectienaald omvat het trekken van de juiste borosilicaatglas, gevolgd door het bereiden van de rand met snijden en tenslotte backloading de naald. Optimaal wordt de naald in plaats schuin dan stomp (figuur 1C), een snede die door scherp hengelen de rand van het snij-instrument, zoals fijne tang tijdens de snijprocedure (Figuur 1D). Dit schuine rand is van cruciaal belang en zal grote invloed hebben op de mogelijkheid om voorzichtig steek de naald in de zebravis.

Op de dag van de injectie, werden embryo's geplaatst met behulp van stevig, maar soepel embryomanipulatie gereedschappen (figuur 1E). Voor de injectie werden embryo gemanoeuvreerd, zodat de romp rustte langs de kant van de injectie lade hefboom voor de volgende injectie stap (Figuur 1F) verschaffen. Tijdens het injecteren, moet men het vlak van zicht richten op de embryonale torso aan het vasculaire bestemming voor de naald inbrengen visualiseren en vervolgens observeren het geïnjecteerde materiaal voer de omloop (figuur 1G).

De transparantie van de zebravis embryo vergemakkelijkt de micro-injectie procedure, en kan verder worden versterkt door PTU chemische behandeling op 24 HPF aan de ontwikkeling van pigmentatie te verminderen tijdens een typische experimentele tijdsverloop (Figuur 2A). Hier werden embryo exemplaren toegestaan ​​zich te ontwikkelen door middel van de 72 HPF stadium, dan waren ofwel mock geïnjecteerd, micro-injectie met een zoutoplossing voertuig, of micro-injectie met 2,5 mg / ml gentamicine (Figuur 2A).Daaropvolgende levende waarneming werd uitgevoerd op een en twee dagen na injectie, via transilluminatie verlichting met een stereomicroscoop (Figuur 2B). Vergeleken met mock of zoutoplossing geïnjecteerde embryo, alleen de gentamicine-geïnjecteerde individuen toonde de ontwikkeling van oedeem (figuur 2B), in casu pericardiale oedeem, suggereert een beëindiging van normale nieren functionaliteit in overeenstemming met eerder gepubliceerde waarnemingen 11,20,21.

Figuur 1
Figuur 1. Micro-injectie apparatuur en gereedschappen. (A) Injectie station opgezet met stereomicroscoop (links), micromanipulator en naaldhouder (midden) en drukregelaar (rechts). (B) transilluminatie van de injectie plaat. (C) Links: Blunt cut naald. Rechts: Beveled cut naald. (D) Fine tang gebruikt om de naald tips snijden. (E) Manipulatie instrumenten die worden gebruikt om in te voegen en de positie van de specimens in de spuitgietmatrijs. (F) Embryo's gerangschikt in de micro-injectie mal. Schaal bar = 0,5 mm. (G) positioneren van de naald naast de embryo voor injectie. Schaal bar = 0,15 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Experimentele tijdlijn en na de injectie oedeem-test. (A) Voorbeeld nefrotoxische substantie experimentele tijdlijn in de zebravis, hier toegepast op een gentamicine studie. Embryo's werden dechorionated en behandeld met PTU oplossing bij 24 uur na de bevruchting (HPF). Elke dag, de PTU oplossing werd gedecanteerd en vervangen door vers medium zoals aangegeven door de smaller groene pijlen. Op 72 HPF, werden embryo's verdoofd, overgebracht naar een injectie schimmel en daarna als volgt behandeld: mock geïnjecteerd of geïnjecteerd ofwel zoutoplossing (controle over het voertuig) of gentamicine. Na de heropleving van de embryo's in verse media werden de embryo's waargenomen tussen 1 en 2 dagen na de injectie (96 en 120 HPF, respectievelijk) voor analyse en beeldacquisitie. (B) Top: uninjected zebravis embryo. Midden: embryo geïnjecteerd met 72 hpf met zoutoplossing. Bottom: embryo geïnjecteerd met 2,5 mg / ml gentamicine. Schaal bar = 0,5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een divers aantal therapeutische middelen zijn geassocieerd met AKI 29. Er zijn aanzienlijke onderzoek vooruitgang in het begrijpen van de schade veroorzaakt door vele afzonderlijke verbindingen, zoals aminoglycoside gentamicine 30 en de gebruikte chemotherapeutische cisplatine 31,32 geweest. Sommige pathologische veranderingen die betrokken zijn bij deze voorwaarden, blijven echter het onderwerp van lopend onderzoek. Een opkomende uitdaging blijft begrijpen hoe meerdere drugs negatieve invloed hebben op patiënten, met name die in hoog-risicogroepen, zoals die in de intensive care-instellingen en ouderen 29. Aldus modellen die verdere cellen gebaseerde studies over de effecten van drugs geïnduceerde AKI schakelen hebben een belangrijke rol bij het verbeteren detectie van deze aandoening en waarderen dynamische geneesmiddelinteracties.

Werken met zoogdierlijke modellen zoals muizen en ratten zijn integraal cellulaire veranderingen in de nier na AKI vast zijn, but een beperking met deze systemen is dat de directe, real-time observatie is beperkt vanwege de architectonische complexiteit en de interne locatie van het orgel. Simpel gezegd, de nier is niet beschikbaar voor directe observatie, waarbij het noodzakelijk dat mensen worden opgeofferd aan de nier te analyseren. Deze beperkingen kunnen worden tegengegaan door het gebruik van zebravis embryo's die een eenvoudige nier twee nefronen die een geconserveerd segmentstructuur met andere gewervelde dieren, waaronder mensen 33 zijn gevormd. Ontwikkeling van de zebravis gebeurt ex utero en met kleine pigmentatie, waardoor voor directe observatie van renale organogenese en monitoring van reacties op externe stimuli 34. Gereedschappen voor moleculaire analyse, zoals genexpressie 35-37, zijn gebruikt met een hoge resolutie op de kenmerken van nefrogenese 38-40 te bepalen. Experimentele manipulaties voor het testen van kleine moleculen door middel van chemische genetica zijn goed ingeburgerd in de zebravis en van toepassing op de kidney 41-43. Inderdaad, in de afgelopen jaren, zebravis zijn toegepast op nefrotoxiciteit agents variërend van acetominofen mycotoxinen en aristolochiazuur 44-48 modelleren. Het is belangrijk op te merken dat er ook aanzienlijke beperkingen AKI modelleren in het zebravis embryo, vanwege de eenvoud van nierstructuur in dit stadium van ontwikkeling. Zo worden zebravis niet passende oplossingen multifactoriële interacties binnen nierweefsel dat dicht is verpakt met nefronen die zijn omgeven door een complexe stroma die meerdere interstitiële celtypen bevat, zoals het geval is bij knaagdieren of menselijke metanefros. Zo zebravis zijn het best geschikt voor het visualiseren van de autonome cellulaire en moleculaire veranderingen in het nefron tijdens de AKI.

De werkwijze van micro-injectie hier beschreven, terwijl het hebben van een steile leercurve, is zeer nuttig voor het bestuderen van zowel ontwikkelings-en ziekten, waaronder nephrotoxins. Deze techniek kan worden gebruikt to test drugs afzonderlijk of in combinatie. Bovendien kunnen injecties worden uitgevoerd in een groot aantal punten ontwikkelingstijd. Een soortgelijke, eveneens haalbare werkwijze voor het uitvoeren intraveneuze micro-injecties in zebravis larven is eerder beschreven door Cosentino, et al. 21. Een belangrijk onderscheid in methodologie, in vergelijking met de hier beschreven werkwijzen, is dat het embryo te injecteren is geïmmobiliseerd onder toepassing van een pipet 21 bedrijf. Het gebruik van een pipet bedrijf is een alternatief voor de spuitgietmatrijs. De onderzoekers die proberen uit te voeren micro-injectie als een levering methode voor nephrotoxicant agenten moeten zich bewust zijn van dit alternatief en kunnen wensen om de methoden te vergelijken om te bepalen welke is persoonlijk de voorkeur, omdat het leren om het bedrijf pipet te manipuleren om te voorkomen dat het embryo beschadigen zal de praktijk te betrekken net als praktijk vereist succesvol manoeuvreren en microinject met een eenvoudige spuitgietmatrijs met een depressie holte voor embryos.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het essentieel om de juiste grootte injectienaalden voor te bereiden en om de hoek op de naald te snijden om een ​​soepele in- en uitstappen in de embryonale circulatie te optimaliseren. Tijdens de injectieprocedure, is het essentieel om het injectievolume om de consistentie van de nefrotoxische substantie levering tussen monsters beoordelen bewaken. Periodieke beoordeling van de injectie volume met een micrometer kan worden uitgevoerd als de onderzoeker is onzeker over de veranderingen in volume tijdens het uitvoeren van een experiment. Bijvoorbeeld, door de aard van de techniek, de naald kan gedeeltelijk of geheel verstopt raken celresten. Deze complicatie kan worden tegengegaan door het opruimen van de naald regelmatig om de consistentie van de uitgeworpen vloeistof te waarborgen. Bovendien kan een vitale kleurstof zoals fenolrood toegevoegd aan het mengsel om als een visuele marker van de injectie en staan ​​bij het ​​toezicht vloeibare dispersie 49,50. Verder kan injecties van tracer moleculen te helpen bijvisualiseren specifieke celpopulaties na de injectie. Voor co-injectie van fluorescent dextran-resten, specifiek 10 kDa dextran conjugaten, heeft een aantal toepassingen 16,17. In dit geval kan de beoordeling van fluorescentie-intensiteit worden uitgevoerd onmiddellijk volgend de procedure succesvol microinjectie met minimale lekkage bevestigen. De intensiteit kan worden gemeten met behulp van de juiste beeld vast te leggen fotografie en vervolgens opnieuw onderzocht op latere tijdstippen om de verandering in fluorescentie-intensiteit te meten om zo renale klaring 51 te meten. Verder reabsorptie van het dextran in de proximale tubulus verschaft een indicatie voor de functionaliteit van het nefron segment 16,17.

Samengevat, er zijn vele manieren waarop micro-injectie kan worden gebruikt om AKI onderzoeken in de zebravis, vooral omdat dit model het mogelijk maakt farmacokinetiek pakken in vivo. Dus, eenmaal onder de knie, micro-injectie van nephrotoxinsin de zebravisembryo een nuttig paradigma voor renale studies.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de NIH-subsidie ​​DP2OD008470. Bovendien, RAM werd mede ondersteund door fondsen die door de Universiteit van Notre Dame Graduate School. Wij danken het personeel van de afdeling Biologische Wetenschappen, het Center for Research zebravis, en het Centrum voor stamcellen en regeneratieve geneeskunde aan de Universiteit van Notre Dame. We hebben vooral dank aan de leden van het lab voor het aangrijpen van discussies over de nieren biologie en hun nuttige feedback over dit werk.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Chloride American Bioanalytical AB01915
Potassium Chloride American Bioanalytical AB01652
Calcium Chloride American Bioanalytical AB00366
N-Phenylthiourea (PTU) Aldrich Chemistry P7629
Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine) Fluka Analytical A5040
Borosilicate glass Sutter Instruments Co. BF100-50-10
Flaming/Brown Micropipette puller Sutter Instruments Co. Mo. P097
UltraPure Agarose Invitrogen 15510-027
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M7506
Methylene Blue Sigma-Aldrich M9140
Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning:
60 mm x 15 mm VWR 25373-085
100 mm x 15 mm VWR 25373-100
 (microinjection tray) 150 mm x 15 mm VWR 25373-187
Low Temperature Incubator Fischer Scientific 11 690 516DQ
Micro Dissecting Tweezer Roboz Surgical Instruments Co. RS-5010
Micrometer Ted Pella, Inc. 2280-24

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Basile, D. P., Anderson, M. D., Sutton, T. A. Pathophysiology of acute kidney injury. Compr. Physiol. 2, 1303-1353 (2012).
  2. Ostermann, M. Diagnosis of acute kidney injury: kidney disease improving global outcomes criteria and beyond. Curr. Opin. Crit. Care. 20, 581-587 (2014).
  3. Fluck, R. J. Acute kidney: improving the pathway of care for patients and across healthcare. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 24, 511-516 (2015).
  4. Silver, S. A., Cardinal, H., Colwell, K., Burger, D., Dickhout, J. G. Acute kidney injury: preclinical innovations, challenges, and opportunities for translation. Can. J Kidney Health Dis. 2, 30 (2015).
  5. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. Renal stem cells: fact or science fiction? Biochem. J. 444, 153-168 (2012).
  6. Li, Y., Wingert, R. A. Regenerative medicine for the kidney: stem cell prospects and challenges. Clin. Transl. Med. 2, 11 (2013).
  7. Romagani, P., Lasagni, L., Remuzzi, G. Renal progenitors: an evolutionary conserved strategy for kidney regeneration. Nat. Rev. Nephrol. 9, 137-146 (2013).
  8. Kline, J., Rachoin, J. S. Acute kidney injury and chronic kidney disease: it's a two-way street. Ren. Fail. 35, 452-455 (2013).
  9. Chawla, L. S., Kimmel, P. L. Acute kidney injury and chronic kidney disease: an integrated clinical syndrome. Kidney Int. 82, 516-524 (2012).
  10. Sanz, A. B., Sanchez-Niño, M. D., Martìn-Cleary, C., Ortiz, A., Ramos, A. M. Progress in the development of animal models of acute kidney injury and its impact on drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 8, 879-895 (2013).
  11. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Transl Res. 163, 109-122 (2014).
  12. McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish renal pathology: emerging models of acute kidney injury. Curr. Pathobiol. Rep. 3, 171-181 (2015).
  13. Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
  14. Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73, 1120-1127 (2008).
  15. Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
  16. McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. J. Vis. Exp. (90), e51644 (2014).
  17. Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J. Vis. Exp. (54), e2845 (2011).
  18. Palmyre, A., et al. Collective epithelial migration drives kidney repair after acute injury. PLoS One. 9, e101304 (2014).
  19. Fogelgren, B., et al. Exocyst Sec10 protects renal tubule cells from injury by EGFR/MAPK activation and effects on endocytosis. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 307, F1334-F1341 (2014).
  20. Hentschel, D. M., Park, K. M., Cilenti, L., Zervox, A. S., Drummond, I. A., Bonventre, J. V. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 288, F923-F929 (2005).
  21. Cosentino, C. C., Roman, B. L., Drummond, I. A., Hukriede, N. A. Intravenous microinjections of zebrafish larvae to study acute kidney injury. J. Vis. Exp. (42), e2079 (2010).
  22. Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
  23. Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-101 (2011).
  24. McCampbell, K. M., Springer, K. N., Wingert, R. A. Atlas of cellular dynamics during zebrafish adult kidney regeneration. Stem Cell Int. , 547636 (2015).
  25. Sharma, P., Sharma, S., Patial, V., Singh, D., Padwad, Y. S. Zebrafish (Danio rerio): a potential model for nephroprotective drug screening. Clinical Queries: Nephrol. 3, 97-105 (2014).
  26. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 559-585 (2013).
  27. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  28. Hanke, N., et al. 'Zebrafishing' for novel genes relevant to the glomerular filtration barrier. Biomed. Res. Int. 2013, 658270 (2013).
  29. Kane-Gill, S. L., Goldstein, S. L. Drug-induced acute kidney injury: a focus on risk assessment for prevention. Crit. Care Clin. 31, 675-684 (2015).
  30. Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view. Kidney Int. 79, 33-45 (2010).
  31. Ozkok, A., Edelstein, C. L. Pathophysiology of cisplatin-induced acute kidney injury. Biomed. Res. Int. 2014, 967826 (2014).
  32. Perazella, M. A., Moeckel, G. W. Nephrotoxicity from chemotherapeutic agents: clinical manifestations, pathobiology, and prevention/therapy. Semin. Nephrol. 30, 570-581 (2010).
  33. Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Recent advances in elucidating the genetic mechanisms of nephrogenesis using zebrafish. Cells. 4, 218-233 (2015).
  34. Pickart, M. A., Klee, E. W. Zebrafish approaches enhance the translational research tackle box. Transl. Res. 163, 65-78 (2014).
  35. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. J. Vis. Exp. (89), e51604 (2014).
  36. Galloway, J. L., Wingert, R. A., Thisse, C., Thisse, B., Zon, L. I. Combinatorial regulation of novel erythroid gene expression in zebrafish. Exp. Hematol. 36, 424-432 (2008).
  37. McKee, R., Gerlach, G. F., Jou, J., Cheng, C. N., Wingert, R. A. Temporal and spatial expression of tight junction genes during zebrafish pronephros development. Gene Expr. Patterns. 16, 104-113 (2014).
  38. Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev. Biol. 386, 111-122 (2014).
  39. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Zebrafish pronephros tubulogenesis and epithelial identity maintenance are reliant on the polarity proteins Prkc iota and zeta. Dev. Biol. 396, 183-200 (2014).
  40. Cheng, C. N., Wingert, R. A. Nephron proximal tubule patterning and corpuscles of Stannius formation are regulated by the sim1a transcription factor and retinoic acid in the zebrafish. Dev. Biol. 399, 100-116 (2015).
  41. Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): A vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Res. C Embryo Today. 93, 268-280 (2011).
  42. Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Congenital and acute kidney disease: translational research insights from zebrafish chemical genetics. Gen. Med. 1, 112 (2013).
  43. Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (93), e52063 (2014).
  44. Peng, H. C., Wang, Y. H., Wen, C. C., Wang, W. H., Cheng, C. C., Chen, Y. H. Nephrotoxicity assessments of acetaminophen during zebrafish embryogenesis. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 151, 480-586 (2010).
  45. Wu, T. S., Yang, J. J., Yu, F. Y., Liu, B. H. Evaluation of nephrotoxic effects of mycotoxins, citrinin and patulin, on zebrafish (Danio rerio) embryos. Food Chem. Toxicol. 50, 4398-4404 (2012).
  46. Ding, Y. J., Chen, Y. H. Developmental nephrotoxicity of aristolochic acid in a zebrafish model. Toxicol. Appl. Pharmacol. 261, 59-65 (2012).
  47. Zennaro, C., et al. Podocyte developmental defects caused by adriamycin in zebrafish embryos and larvae: a novel model of glomerular damage. PLoS One. 9, e98131 (2014).
  48. Ding, Y. J., Sun, C. Y., Wen, C. C., Chen, Y. H. Nephroprotective role of resveratrol and ursolic acid in aristolochic acid intoxicated zebrafish. Toxins. 7, 97-109 (2015).
  49. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (27), e1115 (2009).
  50. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
  51. Christou-Savina, S., Beales, P. L., Osborn, D. P. Evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay. J. Vis. Exp. (96), e52540 (2015).

Tags

Geneeskunde zebravis nier nefrotoxische substantie renale klaring acuut nierfalen micro-injectie gentamicine
Nefrotoxische substantie Micro-injectie in zebravis tot acuut nierfalen Model
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McKee, R. A., Wingert, R. A.… More

McKee, R. A., Wingert, R. A. Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury. J. Vis. Exp. (113), e54241, doi:10.3791/54241 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter