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Biology

Néphrotoxine microinjection dans Zebrafish au Modèle lésion rénale aiguë

Published: July 17, 2016 doi: 10.3791/54241
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Center for Zebrafish Research, Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Center for Stem Cells and Regenerative Medicine, Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

Summary

blessures rénales survenant à partir de néphrotoxines, qui comprennent des médicaments allant des antibiotiques aux agents chimiothérapeutiques, peuvent entraîner des troubles complexes dont la pathogénie reste mal compris. Ce protocole montre comment zebrafish peut être utilisé pour la modélisation de la maladie de ces conditions, qui peuvent être appliquées à l'identification des mesures néphroprotecteurs.

Abstract

Les reins sont susceptibles de nuire à l'exposition aux produits chimiques qu'ils filtrent de la circulation sanguine. Cela peut conduire à des blessures d'organes associée à une diminution rapide de la fonction rénale et le développement du syndrome clinique connu comme l'insuffisance rénale aiguë (IRA). Les agents pharmacologiques utilisés pour traiter des circonstances médicales allant de l'infection bactérienne au cancer, lorsqu'ils sont administrés seuls ou en combinaison avec d'autres médicaments, peuvent initier AKI. Zebrafish sont un modèle animal utile pour étudier les effets chimiques sur la fonction rénale in vivo, car ils forment un rein embryonnaire composé d'unités fonctionnelles du nephron qui sont conservés avec les vertébrés supérieurs, y compris les humains. En outre, le poisson zèbre peut être utilisé pour réaliser des écrans génétiques et chimiques, qui permettent d'élucider les aspects cellulaires et moléculaires de AKI et élaborer des stratégies thérapeutiques telles que l'identification de molécules néphroprotecteurs. Ici, nous montrons comment microinjection dans leembryon de poisson zèbre peut être utilisé comme un paradigme pour les études de néphrotoxine.

Introduction

AKI est une perte soudaine de la fonction rénale qui peut conduire à des conséquences dévastatrices sur la santé 1. AKI est un important problème de santé dans le monde entier en raison de sa forte incidence d'environ 20% chez les patients hospitalisés, avec des taux encore plus élevés de 30-50% dans les cas de soins intensifs et les personnes âgées, et les taux de 50-70% 1-3 de mortalité. Malheureusement, la prévalence de l'AKI a augmenté et devrait grimper encore au cours de la prochaine décennie, en partie à cause de la diversité des facteurs qui peuvent induire des AKI, qui comprennent le stress post-opératoire, l'ischémie, et l'exposition à néphrotoxines tels que les antibiotiques et des médicaments chimiothérapeutiques 4.

Insuffisance rénale aiguë implique des lésions cellulaires soudaine dans le rein, se produisant fréquemment dans néphrons, qui sont les unités fonctionnelles essentielles, et sont constitués d'un filtre à sang et un tube segmentée qui draine l' urine dans les conduits collecteurs centraux 1. Quand un nombre important de néphrons sontendommagé pendant AKI, les effets immédiats comprennent une interruption de la clairance des déchets de la circulation, et l' écoulement de fluide réduite ou abrogée par néphrons en raison de l' obstruction de morts et mourants cellules 1. Au fil du temps, l' obstruction tubulaire peut conduire à une dégénérescence des néphrons entières, ce qui réduit de façon permanente la fonction rénale 1. Altérations physiologiques dans le rein suivantes AKI impliquent également des événements inflammatoires complexes qui peuvent conduire à la cicatrisation chronique 1.

En dépit de ces résultats, les néphrons ont une certaine capacité à subir la régénération après AKI qui reconstitue l'épithélium tubulaire 5,6. Bien qu'il y ait eu une compréhension moléculaire croissante des néphrons régénération, les mécanismes restent insaisissables à bien des égards et nécessitent la poursuite des recherches 7. Le degré auquel les résultats AKI dans les lésions rénales permanentes reste également inconnu. Les recherches actuelles suggèrent le potentiel de régénération pour le rein est lele plus élevé suivant les cas moins graves de AKI, alors que les épisodes plus prononcés ou répétées conduisent à une maladie rénale chronique (CKD) et aboutir à phase terminale de maladie rénale (STIR) qui nécessite une transplantation ou une dialyse 8,9 sauver la vie. En outre, les personnes souffrant déjà de CKD sont à un risque encore plus élevé de contracter un épisode sévère de AKI 8,9. Pris ensemble, il est clair que la poursuite de la recherche fondamentale et clinique est essentiel de comprendre, traiter et prévenir AKI.

La recherche avec des modèles animaux a joué un rôle dans l' appréciation de la progression des altérations locales et environnementales qui se produisent pendant AKI 10. Pour développer cette compréhension ainsi que de développer de nouvelles thérapies, le modèle animal zebrafish a été utilisé dans une variété de façons 11,12. Les néphrons du rein zebrafish, à la fois dans l'embryon et l' adulte, présentent un degré élevé de conservation des mammifères 13-16. En outre, une lésion épithéliale néphron dans zebrafish ressemble au processus chez les vertébrés supérieurs, de sorte que la destruction locale de cellules tubulaires est suivie par une prolifération intratubulaire et le rétablissement de l' architecture des néphrons 17-19. Dans l'embryon, cependant, d' importants dégâts tubule des néphrotoxines comme le cisplatine est associé à létalité 20,21. Par comparaison, les adultes survivent AKI poisson zèbre et présentent des capacités de régénération de fond dans le rein. Par exemple, suite à une exposition à l'antibiotique gentamicine aminoglycoside, zebrafish régénérer tubule lésions épithéliales et développer de nouvelles unités de néphrons ainsi 22-24. Bien que ces études AKI induite par la gentamicine ont fourni des renseignements précieux, la compréhension des lésions rénales à partir de divers néphrotoxines reste critique pour apprécier les effets et la réponse aux différents types de dommages 25.

L'embryon de poisson zèbre, en raison de sa taille, la transparence et la traçabilité génétique, présente de nombreux avantages pour les études de néphrotoxine <sup> 25, où la méthode de microinjection 20,21 est utilisé pour administrer la molécule (s) pour enquête. Néphrons sont formés par 24 heures après la fécondation (HPF) et commencent à filtrer le sang d'environ 48 HPF 26,27. Ainsi, la formation rapide et la fonction du rein embryonnaire facilite l'analyse expérimentale. Cependant, le processus de microinjection a des défis techniques et il peut y avoir une courbe d'apprentissage abrupte à la maîtrise de la technique. Dans cet article, vidéo, nous décrivons comment effectuer microinjections et de fournir des conseils de dépannage afin d'améliorer le taux d'injections réussies.

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Protocol

Les procédures pour travailler avec des embryons de poisson zèbre décrits dans le présent protocole ont été approuvés par le Comité soin et l'utilisation institutionnelle des animaux à l'Université de Notre Dame.

1. Préparation des solutions

  1. Faire une solution 50x stock de E3 médias d'embryons en mélangeant 73,0 g NaCl, 3,15 g de KCl, 9,15 g de CaCl 2, et 9,95 g MgSO 4 à 5 litres d'eau distillée, et conserver à la température ambiante.
  2. Pour la culture des embryons de poisson zèbre, diluer la solution 50x stock de E3 médias d'embryons disponibles à une solution de travail 1x avec de l'eau distillée, puis ajouter 200 pi de 0,05% de bleu de méthylène à chaque 1 L de 1x E3 à agir comme un fongicide, et conserver à TA.
  3. Faire une solution de pigmentation de blocage de l'E3 médias d'embryons avec 0,003% de 1-phényl-2-thiourée (PTU) en combinant 40 ml de 50x E3 actions avec 0,06 mg PTU. Ensuite, porter le volume à un total de 2 L avec de l'eau distillée.
  4. Agiter le O E3 / PTU / N à la température ambiante pour obtenir la poudre PTU en solution. Puis stocker l'E3 / PTU àTA.
    Note: L'E3 / PTU a une durée de vie d'environ une semaine, et des solutions plus âgés seront moins efficaces pour bloquer le développement de la pigmentation chez les larves de poisson zèbre.
  5. Préparer une solution anesthésique de 0,2% tricaïne (MS-222) en ajoutant 1 g de tricaïne à 500 ml d'eau distillée et d'ajuster le pH à 7,2 avec 1 M de Tris, pH 9,5.
  6. Préparer pour préparer une solution de méthylcellulose à 2% pour l' imagerie en plaçant une solution de 1 x E3 (pas de bleu de méthylène), avec 1/10 volume de 0,2% Tricaine ajouté à 4 ° C.
    Remarque: La solution méthylcellulose est une solution épaisse, claire qui est utilisée pour stabiliser doucement embryons vivants pour la microscopie. Après les manipulations sont effectuées les embryons peuvent être lavés dans 1x E3 pour dissoudre le méthylcellulose sans blesser l'animal et permettant la microscopie à des stades ultérieurs dans le même échantillon.
  7. Une fois refroidi à 4 ° C, agiter la solution 1x E3 / Tricaine vigoureusement sur une plaque d'agitation et ajouter graduellement la quantité appropriée de méthylepoudre de cellulose tout en continuant à remuer vigoureusement. ajouter graduellement la poudre à la solution pour empêcher la formation d'agrégats insolubles de méthylcellulose.
  8. Après tout, la poudre est mélangée dans la solution de méthylcellulose / E3 / tricaïne de 2%, agiter la solution composite dans le 4 ° C chambre froide O / N.
    Remarque: La température froide est préférable pour dissoudre complètement la poudre. Si la solution est pas claire après une nuit, agiter pendant une journée de travail supplémentaire et / ou une seconde O / N.
  9. Pour éliminer les bulles d'air de la méthylcellulose à 2% / solution / de tricaïne E3, aliquote le mélange dans 1,5 ml tubes et essorage à grande vitesse (12 000 xg) à 4 ° C pendant 30 min ou jusqu'à 2 heures.
  10. Placer la solution / E3 / Tricaine de méthylcellulose à 2% à 4 ° C pour une conservation à long terme.
    Note: Avant l'utilisation, des aliquotes doivent être pré-chauffé à la température ambiante pour travailler avec les échantillons de poisson zèbre.

2. Préparation des outils

  1. Préparer un outil embryon manipulateur, utilisé pour popositionne- embryons pour la microinjection, en attachant une pointe de chargement de gel à l'extrémité d'une aiguille droite de dissection 5 ", et le fixer avec du ruban adhésif ou superglue.
  2. Préparer des aiguilles de microinjection à l'aide d'un extracteur d'aiguille, en plaçant d'abord un feu brillant 10 cm en verre borosilicate avec des filaments dans l'instrument et fixer le verre borosilicate en serrant les poignées.
  3. Tirez le verre borosilicate à la mode des aiguilles fines effilées. Utilisez les paramètres suivants: la chaleur 540, tirer 245, vitesse 200, et le temps 125.
  4. La place des aiguilles à l'intérieur d'une boîte de Pétri, de les suspendre sur une bande de pâte à modeler pour protéger les pointes d'aiguille, et de garder le plat couvert pour éviter l'accumulation de poussière.
  5. Pour terminer la préparation de l'aiguille pour microinjections, utilisez un bord de lame de rasoir ou une pince fine pour couper l'extrémité tirée de l'aiguille pour créer une pointe d'injection angulaire forte avec un diamètre d'environ 0,05-0,1 mm.
  6. Pour rendre le plateau de micro-injection, préparer une solution à 1,5% d'agarose / E3 dans un 100 ml Erlenmeyer de et dissoudre l'agarose en chauffant l'E3 à ébullition dans un four micro-ondes puis laisser refroidir à température ambiante pendant environ 10 min.
  7. Verser la solution d'agarose / E3 refroidi dans une boîte de Pétri pour faire une fondation avec une profondeur d'environ 0,5 cm. Lorsque cela est solidifiée verser une seconde couche ayant une profondeur d'environ 0,3 cm et insérer le moule préfabriqué embryon de puits et permettre l'agarose se solidifie à température ambiante.
    Remarque: Lors de l'introduction du moule dans la couche / E3 supérieure d'agar, en plaçant le moule dans la gélose à un angle pour diminuer le nombre de bulles d'air.
  8. Lorsque l'ensemble du plateau de microinjection a mis, soulever l'embryon préfabriqué et la moisissure lentement et avec précaution en utilisant un scoopula, puis remplir le plat avec une solution E3 et conserver à 4 ° C.

3. Embryo Préparation

  1. Mettre en place des réservoirs d'accouplement de poisson zèbre en plaçant des séparateurs dans des chambres d'accouplement et remplir avec de l'eau du système.
  2. Placer un poisson de chaque côté du diviseur deuch que chaque chambre d'accouplement contient une femelle et un poisson mâle, et couvrir chaque chambre d'accouplement.
  3. Le lendemain matin, enlever les diviseurs pour permettre la ponte.
  4. Vérifiez le poisson au bout d'environ 30 minutes, et après le retour des adultes à l'aquarium, de recueillir leurs embryons en faisant passer l'eau du réservoir d'accouplement à travers un outil de crépine fil-maille fine.
  5. Inversez la crépine sur une boîte de Pétri et rincer à l'E3 pour recueillir les embryons.
  6. Incuber les embryons à 28,5 ° CO / N.
  7. Lorsque les embryons ont atteint le stade 24-26 somites 26, transvaser la plupart des médias E3 puis dechorionate en ajoutant 100 pi de 50 mg / ml de pronase à chaque plat d'embryons et l' incubation du plat à température ambiante (23 ° C) pendant environ 15 min.
    Remarque: Il faudra environ 24-25 heures à partir du moment de la fécondation pour les embryons atteignent le stade 24-26 somites si elles sont recueillies de la manière décrite et incubé O / N à 28,5 ° C.
  8. Remplissez le plat avecE3 puis agiter doucement pour déloger les chorions des embryons.
  9. Décanter le E3 / pronase et rincer le plat avec 25 ml d'E3 frais. Répétez l'étape de rinçage pour éliminer tous les pronase.
  10. Pour bloquer le développement de la pigmentation, transvaser l'E3 et le remplacer par 25 ml de frais E3 / PTU lorsque les embryons ont atteint 24 heures après la fécondation.
    Remarque: Pour des expériences sur plusieurs jours, remplacer la solution E3 / PTU avec un milieu frais une fois par jour pour garder le plat propre.

4. microinjection de Solution néphrotoxine

  1. Le jour de l'injection, la préparation de la solution de néphrotoxine souhaitée avec la commande d'un véhicule approprié.
  2. Vortex ou mélanger doucement pour assurer la drogue (s) est / sont en solution, en vérifiant les côtés du tube et le haut de la colonne d'eau.
    Remarque: Les solutions de néphrotoxine peuvent être préparés pour contenir des quantités infimes de dextran conjugué fluorescence pour surveiller l'efficacité de microinjection et également évaluer la clairance rénale au subseqsouligne le temps uent 20,28.
  3. Chargez une aiguille de microinjection garnie de ~ 2-3 pi du néphrotoxine en enfilant une pointe de chargement de gel fine dans le dos de l'aiguille et de suspendre l'aiguille verticalement avec un morceau de ruban adhésif pour permettre à la solution pour remplir la pointe de l'aiguille taillée par gravité.
  4. Une fois que la pointe de l'aiguille est plein, fixer l'aiguille chargée dans le micromanipulateur.
  5. Tester le volume de micro-injection en plaçant une goutte d'huile minérale sur un micromètre et injecter dans l'huile pour évaluer la taille des gouttelettes. Un volume d'injection de 500 pl a un diamètre de 0,1 mm.
  6. Retirer le plat d'embryons de l'incubateur, et anesthésier en ajoutant environ 5 ml de 0,2% Tricaine à l'antenne de l'embryon.
  7. Pour assurer une anesthésie complète, toucher doucement l'embryon avec la pointe de l'outil embryon manipulateur. Le manque de mouvement indique anesthetization suffisante.
  8. Après anesthésie réussie, transférer les embryons dans le moule d'injection avec un transfer pipette.
  9. Manœuvrer chaque embryon dans un puits différent du moule placer la tête dans la zone la plus profonde du puits de telle sorte que le tronc repose le long de la dépression et la queue colle jusqu'à sortir de la dépression.
  10. Insérez l'aiguille remplie dans le micromanipulateur et positionner la pointe de l'aiguille à côté d'un embryon.
  11. Insérez délicatement l'aiguille dans le récipient de queue en déplaçant la manette vers l'avant et appuyer sur la pédale pour fournir la microinjection.
    Remarque: l'injection réussie peut être mesurée en observant le liquide entrer circulation. En outre, la co-injection du dextran nephrotoxicant conjugué fluorescent permet au chercheur de vérifier l'injection avec succès à la suite de la procédure.
  12. Tirez doucement sur la manette pour retirer l'aiguille de l'embryon.
  13. Après l'injection, transférer les embryons à un plat propre et rincer pour enlever le Tricaine et remplacer avec des produits frais E3 / PTU.
  14. Incuber l'embryon jusqu'au point de temps souhaité pour évaluers morphologie, qui peut être documenté par la photographie dans un milieu de montage de la méthylcellulose, ou un procédé pour l'analyse expérimentale comme souhaité.
    Remarque: La récupération des embryons doit être évaluée afin de déterminer le pourcentage de personnes ayant un oedème, qui indique généralement une lésion rénale.

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Representative Results

Une station de microinjection mis en place comprend un stéréomicroscope, micromanipulateur et régulateur de pression (figure 1A). Transillumination de la plaque d'injection est préférable d'afficher des échantillons au cours de cette procédure (figure 1B). Préparation de l'aiguille d'injection consiste à tirer le verre borosilicate approprié, suivie par la préparation de l'arête de coupe et, enfin, avec chargement par l'arrière de l'aiguille. Idéalement, la pointe de l' aiguille est biseautée plutôt que émousser (figure 1C), une coupe qui est faite en inclinant fortement le bord de l'instrument de coupe, comme les pince fine, au cours de la procédure de coupe (Figure 1D). Ce bord biseauté est critique et affectera grandement la possibilité d'insérer délicatement l'aiguille dans le poisson zèbre.

Le jour de l'injection, les embryons ont été placés en utilisant l'embryon robuste mais flexibleoutils de manipulation (Figure 1E). Pour l'injection, les embryons ont été manoeuvrés, de sorte que le tronc repose le long du côté du plateau d'injection pour fournir un effet de levier pour l'étape d'injection ultérieure (figure 1F). Alors que l' injection, on devrait se concentrer le plan de vue sur le torse embryonnaire pour visualiser la destination vasculaire pour l' insertion de l' aiguille, puis observer la matière injectée dans la circulation (figure 1G).

La transparence de l'embryon de poisson zèbre facilite la procédure de micro - injection, et peut être encore améliorée par un traitement chimique PTU à 24 HPF pour réduire le développement de la pigmentation pendant un décours temporel expérimentale typique (figure 2A). Ici, les échantillons d'embryons ont été autorisés à se développer à travers l'étape 72 de HPF, puis étaient soit mock injecté, microinjecté avec un véhicule de solution saline ou microinjecté avec 2,5 mg / ml de gentamicine (figure 2A).L' observation en direct subséquente a été menée à un et deux jours après l' injection, en utilisant l' éclairage de transillumination avec un stéréomicroscope (figure 2B). Par rapport aux embryons injectés simulacres ou salins, seuls les individus de gentamicine à injection ont montré le développement de l' oedème (figure 2B), dans ce cas , un œdème péricardique, ce qui suggère une abrogation de la fonctionnalité rénale normale compatible avec les observations publiées antérieurement 11,20,21.

Figure 1
Figure 1. appareils et outils microinjection. (A) Station d'injection mis en place avec stéréomicroscope ( à gauche), micromanipulateur et porte-aiguille (milieu) et régulateur de pression ( à droite). (B) transillumination de la plaque d'injection. (C) A gauche: aiguille Blunt coupe. A droite: l'aiguille de coupe biseauté. (D) Fforceps ine utilisés pour couper les pointes des aiguilles. (E) des outils de manipulation utilisés pour insérer et positionner les spécimens dans le moule d'injection. (F) Embryons revêtit dans le moule de microinjection. Barre d'échelle = 0,5 mm. (G) Positionnement de l' aiguille à côté de l'embryon pour injection. Barre d' échelle = 0,15 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. chronologie et de l' œdème post - injection test expérimental. (A) Exemple néphrotoxine chronologie expérimentale chez le poisson zèbre, ici appliquée à une étude gentamicine. Les embryons ont été dechorionated et traités avec une solution PTU à 24 h après la fécondation (HPF). Chaque jour, la solution a été décantée PTU et remplacé par du milieu frais, comme indiqué par la smaller flèches vertes. A 72 HPF, les embryons ont été anesthésiés, transféré dans un moule d'injection, puis traitée comme suit: mock injectée ou injectée soit une solution saline (témoin véhicule) ou la gentamicine. Après la relance des embryons dans des milieux frais, les embryons ont été observés après l'injection 1 et 2 jours (96 et 120 HPF, respectivement) pour l'analyse et l'acquisition d'images. (B) Top: embryon de poisson zèbre non injectée. Moyen: embryon à 72 HPF avec une solution saline. En bas: l'embryon injecté avec 2,5 mg / ml de gentamicine. Barre d' échelle = 0,5 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Un nombre varié d'agents thérapeutiques ont été associés à AKI 29. Il y a eu des progrès importants travaux de recherche dans la compréhension des dommages induits par de nombreux composés individuels, tels que la gentamicine aminoglycoside 30 et le cisplatine chimiothérapeutique largement utilisé 31,32. Certains changements pathologiques impliqués dans ces conditions, cependant, restent l'objet d'une étude en cours. Un défi émergent reste à comprendre comment de multiples médicaments affectent négativement les patients, en particulier ceux des populations à haut risque tels que ceux dans les milieux de soins intensifs et les personnes âgées 29. Ainsi, les modèles qui permettent d'autres études basées cellulaires sur les effets de AKI induite par les médicaments jouent un rôle important dans l'amélioration de la détection de cette condition et d'apprécier les interactions dynamiques de drogue.

Travailler avec des modèles de mammifères tels que la souris et le rat ont été partie intégrante d'établir des changements cellulaires dans les reins suivants AKI, but une limitation de ces systèmes est que l'observation en temps réel directe est limitée en raison de la complexité architecturale et l'emplacement interne de l'organe. Autrement dit, le rein ne sont pas disponibles pour l'observation directe, ce qui nécessite que les individus soient sacrifiés pour analyser le rein. Ces limitations peuvent être contrés par l' utilisation d' embryons de poisson zèbre, qui forment un simple , les reins de deux néphrons qui ont une structure de segment conservé avec d' autres vertébrés, y compris les humains 33. Développement Zebrafish se produit ex utero et avec une pigmentation mineure, permettant l' observation directe de l' organogenèse et le suivi des réponses rénales à des signaux externes 34. Outils d'analyse moléculaire, tels que l' expression du gène 35-37, ont été utilisés à haute résolution pour déterminer les caractéristiques de néphrogenèse 38-40. Les manipulations expérimentales pour les tests de petites molécules par le biais de la génétique chimique sont bien établis dans zebrafish et applicable au KIDNey 41-43. En effet, ces dernières années, le poisson zèbre ont été appliqués pour modéliser la néphrotoxicité des agents allant de l' acétaminophène aux mycotoxines et de l' acide aristolochique 44-48. Il est important de noter qu'il existe aussi des limites importantes à la modélisation AKI dans l'embryon de poisson zèbre, en raison de la simplicité de la structure rénale à ce stade de développement. Par exemple, le poisson zèbre ne sont pas adaptés pour traiter des interactions multifactorielles dans le tissu rénal qui est très dense avec néphrons qui sont entourées par un stroma complexe qui contient plusieurs types de cellules interstitielles, comme cela est le cas dans le rongeur ou humain métanéphros. Ainsi, zebrafish sont les mieux adaptés à la visualisation des changements cellulaires et moléculaires autonomes dans le néphron pendant AKI.

La méthode de microinjection décrite ici, tout en ayant une courbe d'apprentissage abrupte, est très utile pour étudier les deux états de développement et de la maladie, y compris néphrotoxines. Cette technique peut être utilisée pour Temédicaments st seuls ou en combinaison. De plus, les injections peuvent être réalisées au cours d'un grand nombre de points de temps de développement. Une méthode similaire, tout aussi viable pour réaliser microinjections intraveineuses chez les larves de poisson zèbre a été décrit précédemment par Cosentino, et al. 21. Une différence significative dans leur méthodologie, par rapport aux procédés décrits ici, est que l'embryon à injecter est immobilisée en utilisant une pipette de maintien 21. L'utilisation d'une pipette de maintien est une alternative viable au moule d'injection. Les chercheurs qui cherchent à mettre en œuvre microinjection comme méthode de livraison pour les agents nephrotoxicant doivent être conscients de cette alternative et peuvent souhaiter comparer les méthodes pour identifier qui est personnellement préférable, comme apprendre à manipuler la pipette de maintien afin de ne pas endommager l'embryon impliquera la pratique tout comme il exige la pratique à manoeuvrer avec succès et micro-injection en utilisant un moule à injection simple, avec une cavité de dépression de l'embryos.

Lors de l'exécution de cette procédure, il est essentiel de préparer des aiguilles d'injection de taille appropriée, et de réduire l'angle de la pointe de l'aiguille pour optimiser la facilité d'entrée et de sortie dans la circulation embryonnaire. Au cours de la procédure d'injection, il est essentiel de contrôler le volume d'injection afin d'évaluer l'uniformité de la distribution de néphrotoxine entre les échantillons. L'évaluation périodique du volume d'injection avec un micromètre peut être réalisée si le chercheur est incertain au sujet des changements de volume tout en effectuant une expérience. Par exemple, en raison de la nature de la technique, la pointe de l'aiguille peut se boucher partiellement ou entièrement de débris cellulaires. Cette complication peut être contrecarrée en effaçant l'aiguille périodiquement afin d'assurer la cohérence du fluide éjecté. En outre, un colorant vital comme le rouge de phénol peut être ajouté au mélange pour agir en tant que marqueur visuel de l'injection et aider à surveiller la dispersion de fluide 49,50. En outre, des injections de molécules traceur peuvent aider àla visualisation des populations de cellules spécifiques, à la suite de l'injection. Pour la co-injection de fractions de dextrane fluorescentes, en particulier de 10 kDa conjugués dextrane, présente un certain nombre d'applications 16,17. Dans ce cas, l'évaluation de l'intensité de fluorescence peut être effectuée immédiatement après la procédure pour confirmer microinjection réussie avec un minimum de fuites. L'intensité peut être mesurée en utilisant la photographie appropriée de capture d' image et réexaminés à des points de temps suivants , puis de mesurer la variation de l' intensité de fluorescence de manière à mesurer la clairance rénale 51. En outre, la réabsorption du dextrane dans le tubule proximal fournit une approximation de la fonctionnalité de ce segment de néphron 16,17.

Pris ensemble, il y a plusieurs façons que microinjection peut être utilisé pour enquêter sur AKI avec le poisson zèbre, d' autant plus que ce modèle offre l'occasion d'aborder la pharmacocinétique in vivo. Ainsi, une fois maîtrisé, microinjection de néphrotoxinesdans l'embryon de poisson zèbre fournit un paradigme utile pour les études rénales.

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Acknowledgments

Ce travail a été soutenu en partie par la subvention DP2OD008470 NIH. En outre, la RAM a été soutenu en partie par des fonds fournis par l'Université de Graduate School Notre-Dame. Nous remercions le personnel du Département des sciences biologiques, le Centre de recherche Zebrafish, et le Centre pour les cellules souches et la médecine régénérative à l'Université de Notre Dame. Nous remercions tout particulièrement les membres du laboratoire pour engager des discussions sur les reins biologie et leurs commentaires utiles sur ce travail.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Chloride American Bioanalytical AB01915
Potassium Chloride American Bioanalytical AB01652
Calcium Chloride American Bioanalytical AB00366
N-Phenylthiourea (PTU) Aldrich Chemistry P7629
Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine) Fluka Analytical A5040
Borosilicate glass Sutter Instruments Co. BF100-50-10
Flaming/Brown Micropipette puller Sutter Instruments Co. Mo. P097
UltraPure Agarose Invitrogen 15510-027
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M7506
Methylene Blue Sigma-Aldrich M9140
Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning:
60 mm x 15 mm VWR 25373-085
100 mm x 15 mm VWR 25373-100
 (microinjection tray) 150 mm x 15 mm VWR 25373-187
Low Temperature Incubator Fischer Scientific 11 690 516DQ
Micro Dissecting Tweezer Roboz Surgical Instruments Co. RS-5010
Micrometer Ted Pella, Inc. 2280-24

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Basile, D. P., Anderson, M. D., Sutton, T. A. Pathophysiology of acute kidney injury. Compr. Physiol. 2, 1303-1353 (2012).
  2. Ostermann, M. Diagnosis of acute kidney injury: kidney disease improving global outcomes criteria and beyond. Curr. Opin. Crit. Care. 20, 581-587 (2014).
  3. Fluck, R. J. Acute kidney: improving the pathway of care for patients and across healthcare. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 24, 511-516 (2015).
  4. Silver, S. A., Cardinal, H., Colwell, K., Burger, D., Dickhout, J. G. Acute kidney injury: preclinical innovations, challenges, and opportunities for translation. Can. J Kidney Health Dis. 2, 30 (2015).
  5. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. Renal stem cells: fact or science fiction? Biochem. J. 444, 153-168 (2012).
  6. Li, Y., Wingert, R. A. Regenerative medicine for the kidney: stem cell prospects and challenges. Clin. Transl. Med. 2, 11 (2013).
  7. Romagani, P., Lasagni, L., Remuzzi, G. Renal progenitors: an evolutionary conserved strategy for kidney regeneration. Nat. Rev. Nephrol. 9, 137-146 (2013).
  8. Kline, J., Rachoin, J. S. Acute kidney injury and chronic kidney disease: it's a two-way street. Ren. Fail. 35, 452-455 (2013).
  9. Chawla, L. S., Kimmel, P. L. Acute kidney injury and chronic kidney disease: an integrated clinical syndrome. Kidney Int. 82, 516-524 (2012).
  10. Sanz, A. B., Sanchez-Niño, M. D., Martìn-Cleary, C., Ortiz, A., Ramos, A. M. Progress in the development of animal models of acute kidney injury and its impact on drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 8, 879-895 (2013).
  11. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Transl Res. 163, 109-122 (2014).
  12. McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish renal pathology: emerging models of acute kidney injury. Curr. Pathobiol. Rep. 3, 171-181 (2015).
  13. Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
  14. Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73, 1120-1127 (2008).
  15. Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
  16. McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. J. Vis. Exp. (90), e51644 (2014).
  17. Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J. Vis. Exp. (54), e2845 (2011).
  18. Palmyre, A., et al. Collective epithelial migration drives kidney repair after acute injury. PLoS One. 9, e101304 (2014).
  19. Fogelgren, B., et al. Exocyst Sec10 protects renal tubule cells from injury by EGFR/MAPK activation and effects on endocytosis. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 307, F1334-F1341 (2014).
  20. Hentschel, D. M., Park, K. M., Cilenti, L., Zervox, A. S., Drummond, I. A., Bonventre, J. V. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 288, F923-F929 (2005).
  21. Cosentino, C. C., Roman, B. L., Drummond, I. A., Hukriede, N. A. Intravenous microinjections of zebrafish larvae to study acute kidney injury. J. Vis. Exp. (42), e2079 (2010).
  22. Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
  23. Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-101 (2011).
  24. McCampbell, K. M., Springer, K. N., Wingert, R. A. Atlas of cellular dynamics during zebrafish adult kidney regeneration. Stem Cell Int. , 547636 (2015).
  25. Sharma, P., Sharma, S., Patial, V., Singh, D., Padwad, Y. S. Zebrafish (Danio rerio): a potential model for nephroprotective drug screening. Clinical Queries: Nephrol. 3, 97-105 (2014).
  26. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 559-585 (2013).
  27. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  28. Hanke, N., et al. 'Zebrafishing' for novel genes relevant to the glomerular filtration barrier. Biomed. Res. Int. 2013, 658270 (2013).
  29. Kane-Gill, S. L., Goldstein, S. L. Drug-induced acute kidney injury: a focus on risk assessment for prevention. Crit. Care Clin. 31, 675-684 (2015).
  30. Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view. Kidney Int. 79, 33-45 (2010).
  31. Ozkok, A., Edelstein, C. L. Pathophysiology of cisplatin-induced acute kidney injury. Biomed. Res. Int. 2014, 967826 (2014).
  32. Perazella, M. A., Moeckel, G. W. Nephrotoxicity from chemotherapeutic agents: clinical manifestations, pathobiology, and prevention/therapy. Semin. Nephrol. 30, 570-581 (2010).
  33. Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Recent advances in elucidating the genetic mechanisms of nephrogenesis using zebrafish. Cells. 4, 218-233 (2015).
  34. Pickart, M. A., Klee, E. W. Zebrafish approaches enhance the translational research tackle box. Transl. Res. 163, 65-78 (2014).
  35. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. J. Vis. Exp. (89), e51604 (2014).
  36. Galloway, J. L., Wingert, R. A., Thisse, C., Thisse, B., Zon, L. I. Combinatorial regulation of novel erythroid gene expression in zebrafish. Exp. Hematol. 36, 424-432 (2008).
  37. McKee, R., Gerlach, G. F., Jou, J., Cheng, C. N., Wingert, R. A. Temporal and spatial expression of tight junction genes during zebrafish pronephros development. Gene Expr. Patterns. 16, 104-113 (2014).
  38. Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev. Biol. 386, 111-122 (2014).
  39. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Zebrafish pronephros tubulogenesis and epithelial identity maintenance are reliant on the polarity proteins Prkc iota and zeta. Dev. Biol. 396, 183-200 (2014).
  40. Cheng, C. N., Wingert, R. A. Nephron proximal tubule patterning and corpuscles of Stannius formation are regulated by the sim1a transcription factor and retinoic acid in the zebrafish. Dev. Biol. 399, 100-116 (2015).
  41. Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): A vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Res. C Embryo Today. 93, 268-280 (2011).
  42. Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Congenital and acute kidney disease: translational research insights from zebrafish chemical genetics. Gen. Med. 1, 112 (2013).
  43. Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (93), e52063 (2014).
  44. Peng, H. C., Wang, Y. H., Wen, C. C., Wang, W. H., Cheng, C. C., Chen, Y. H. Nephrotoxicity assessments of acetaminophen during zebrafish embryogenesis. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 151, 480-586 (2010).
  45. Wu, T. S., Yang, J. J., Yu, F. Y., Liu, B. H. Evaluation of nephrotoxic effects of mycotoxins, citrinin and patulin, on zebrafish (Danio rerio) embryos. Food Chem. Toxicol. 50, 4398-4404 (2012).
  46. Ding, Y. J., Chen, Y. H. Developmental nephrotoxicity of aristolochic acid in a zebrafish model. Toxicol. Appl. Pharmacol. 261, 59-65 (2012).
  47. Zennaro, C., et al. Podocyte developmental defects caused by adriamycin in zebrafish embryos and larvae: a novel model of glomerular damage. PLoS One. 9, e98131 (2014).
  48. Ding, Y. J., Sun, C. Y., Wen, C. C., Chen, Y. H. Nephroprotective role of resveratrol and ursolic acid in aristolochic acid intoxicated zebrafish. Toxins. 7, 97-109 (2015).
  49. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (27), e1115 (2009).
  50. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
  51. Christou-Savina, S., Beales, P. L., Osborn, D. P. Evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay. J. Vis. Exp. (96), e52540 (2015).

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Néphrotoxine microinjection dans Zebrafish au Modèle lésion rénale aiguë
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McKee, R. A., Wingert, R. A. Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury. J. Vis. Exp. (113), e54241, doi:10.3791/54241 (2016).

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