Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell

Published: July 17, 2016 doi: 10.3791/54241
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Center for Zebrafish Research, Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Center for Stem Cells and Regenerative Medicine, Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

Summary

Renal Verletzungen von Nephrotoxinen entstehen, die Medikamente im Bereich von Antibiotika zu Chemotherapeutika gehören, können in komplexen Erkrankungen, deren Pathogenese zur Folge bleibt unvollständig verstanden. Dieses Protokoll zeigt, wie Zebrabärbling für Krankheitsmodelle dieser Bedingungen verwendet werden, die zur Identifizierung von renoprotektive Maßnahmen angewendet werden können.

Abstract

Die Nieren sind anfällig von der Exposition zu schädigen zu Chemikalien, die sie aus dem Blut zu filtern. Dies kann mit einem raschen Rückgang der Nierenfunktion und die Entwicklung des klinischen Syndrom bekannt als akute Nierenschädigung (AKI) in Verbindung zu Organschäden führen. Pharmakologischer Mittel verwendet, um medizinische Bedingungen zur Behandlung von bakteriellen Infektionen zu Krebs reichen, wenn sie einzeln verabreicht werden oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen, kann AKI initiieren. Zebrabärbling sind ein nützliches Tiermodell die chemischen Wirkungen auf die Nierenfunktion in vivo zu untersuchen, da sie eine embryonale Niere Nephron Funktionseinheiten besteht bilden , die mit höheren Vertebraten konserviert sind, einschließlich Menschen. Ferner kann Zebrabärbling genetische und chemische Bildschirme auszuführen verwendet werden, die Möglichkeiten bieten, um die zellulären und molekularen Facetten AKI aufzuklären und therapeutischen Strategien wie die Identifizierung von Molekülen nephroprotektive entwickeln. Hier zeigen wir, wie die Mikroinjektion in dieZebrafischembryo kann als Paradigma für Nephrotoxin Studien genutzt werden.

Introduction

AKI ist ein abrupter Verlust der Nierenfunktion , die 1 bis verheerenden gesundheitlichen Folgen führen kann. AKI ist ein bedeutendes Gesundheits Problem weltweit aufgrund seiner hohen Inzidenz von etwa 20% bei Patienten im Krankenhaus, mit noch höheren Raten von 30-50% in kritischen Pflegefälle und ältere Menschen, und die Sterblichkeitsrate von 50-70% 1-3. Leider hat sich die Prävalenz von AKI zugenommen und wird voraussichtlich weiter über die nächsten zehn Jahre zu eskalieren, zum Teil aufgrund der Vielfalt der Faktoren, die AKI auslösen können, zu denen die postoperative Belastung, Ischämie und Exposition gegenüber Nephrotoxinen wie Antibiotika und chemotherapeutischen Arzneimitteln 4.

AKI beinhaltet plötzliche Zellschäden in der Niere, die gemeinhin in Nephronen auftretenden, die die wesentlichen Funktionseinheiten sind, und aus einem Blutfilter und einer segmentierten tubule umfasst , die Urin in den zentralen Sammelrohre 1 entwässert. Wenn eine erhebliche Anzahl von Nephronen sindwährend AKI beschädigt, sind die unmittelbaren Auswirkungen einer Unterbrechung in der Abfall Clearance aus dem Kreislauf und reduziert oder außer Kraft gesetzt Fluidstrom durch Nephronen durch Obstruktion von toten und sterbenden Zellen 1. Im Laufe der Zeit können Rohr Behinderung zu einer Degeneration des gesamten Nephronen führen, die 1 Nierenfunktion reduziert dauerhaft. Physiologische Veränderungen in der Niere folgenden AKI beinhalten auch komplexe entzündliche Ereignisse , die zu chronischen Vernarbung 1 führen kann.

Trotz dieser Ergebnisse haben Nephronen gewisse Fähigkeit Regeneration nach AKI zu unterziehen, die die Tubulusepithel 5,6 rekonstituiert. Zwar gibt es eine wachsende molekulare Verständnis von nephron Regeneration gewesen ist, bleiben die Mechanismen schwer in vielerlei Hinsicht und erforderlich machen Untersuchung 7 fortgesetzt. Das Ausmaß, in dem AKI führt zu einer dauerhaften Nierenschädigung bleibt ebenfalls unbekannt. Die aktuelle Forschung deutet darauf hin, das regenerative Potenzial für die Niere ist diehöchste folgenden weniger schwere Fälle von AKI, während ausgeprägter oder wiederholte Episoden zu einer chronischen Nierenerkrankung (CKD) führen und in Nierenerkrankung im Endstadium (ESRD) , die lebensrettende Transplantation oder Dialyse erfordert 8,9 gipfeln. Darüber hinaus Personen , die bereits von CKD leiden , sind zu einem noch höheren Risiko von 8,9 eine schwere Folge von AKI Vertrags. Zusammengenommen ist es klar, dass die weitere Grundlagen- und klinische Forschung zu verstehen, von entscheidender Bedeutung ist, zu behandeln und AKI verhindern.

Forschung mit Tiermodellen hat in Würdigung der Progression der lokalen und ökologischen Veränderungen beigetragen , die während der AKI 10 auftreten. Um dieses Verständnis zu erweitern sowie die Entwicklung neuer Therapien, die Zebrabärbling Tiermodell wurde in einer Vielzahl von Möglichkeiten 11,12 eingesetzt. Die Nephronen der Zebrabärbling Niere, sowohl im Embryo und Erwachsenen zeigen einen hohen Grad an Konservierung bei Säugetieren 13-16. Ferner nephron epithelialen Verletzungen in zeFisch - ähnelt dem Prozess bei höheren Wirbeltieren, wobei die lokale Zerstörung von röhrenförmigen Zellen durch intratubulären Proliferation und Wiederherstellung der nephron Architektur 17-19 folgt. Im Embryo ist jedoch umfangreiche Röhrchens Schaden von den Nephrotoxinen wie Cisplatin im Zusammenhang mit Letalität 20,21. Zum Vergleich: überleben Zebrabärbling Erwachsene AKI und zeigen materielle regenerative Fähigkeiten in der Niere. Zum Beispiel, um das Aminoglykosid - Antibiotikum Gentamicin nach der Exposition, Zebrabärbling Röhrchens Epithelschädigung regenerieren und neue Nephron - Einheiten sowie 22-24 wachsen. Während diese Gentamicin-induzierten AKI Studien wertvolle Informationen zur Verfügung gestellt haben, Nierenschäden aus verschiedenen Nephrotoxinen Verständnis bleibt entscheidend , um die Auswirkungen und die Reaktion auf verschiedene Arten von Schäden 25 zu schätzen.

Der Zebrafischembryo, aufgrund seiner Größe, Transparenz und genetische Lenkbarkeit, hat viele Vorteile für Nephrotoxin Studien <sup> 25, wobei das Verfahren der Mikroinjektion 20,21 verwendet, um das Molekül (e) für die Untersuchung zu verabreichen. Nephron werden von 24 Stunden nach der Befruchtung (HPF) und beginnen zu filtern Blut von etwa 48 HPF 26,27 gebildet. Somit erleichtert die schnelle Bildung und Funktion der embryonalen Nieren experimentellen Analyse. Allerdings hat der Prozess der Mikroinjektions technischen Herausforderungen, und es kann eine steile Lernkurve zu Beherrschung der Technik sein. In diesem Video-Artikel beschreiben wir, wie Mikroinjektionen durchführen und Tipps zur Fehlerbehebung, um die Rate der erfolgreichen Injektionen bieten zu verbessern.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Die Verfahren für die Arbeit mit Genaktivität in diesem Protokoll beschrieben wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der University of Notre Dame genehmigt.

1. Herstellung der Lösungen

  1. Machen Sie eine 50x Stammlösung von E3 Embryo Medium durch Mischen von 73,0 g NaCl, 3,15 g KCl, 9,15 g CaCl 2 und 9,95 g MgSO 4 in 5 l destilliertem Wasser, und lagern bei RT.
  2. Für die Kultivierung von Genaktivität verdünnen 50x Stammlösung von E3 Embryo Medium Lager auf eine 1x-Arbeitslösung mit destilliertem Wasser, dann 200 ul 0,05% Methylenblau zu je 1 Liter 1x E3 hinzufügen als Fungizid zu handeln, und an einem RT.
  3. Machen Sie eine Pigmentierung Blocking-Lösung von E3 Embryo Medium mit 0,003% 1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU) von 40 ml des 50x E3 Lager kombiniert mit 0,06 mg PTU. Dann bringen Sie die Lautstärke auf insgesamt 2 l mit destilliertem Wasser.
  4. Rühren Sie die E3 / PTU O / N bei RT die PTU Pulver in Lösung zu erhalten. Dann speichern Sie die E3 / PTU beiRT.
    Hinweis: Die E3 / PTU eine Lagerbeständigkeit von etwa einer Woche hat und ältere Lösungen werden weniger effektiv bei der Pigmentierung Entwicklung in Zebrabärbling Larven blockieren.
  5. Machen Sie eine Anästhesielösung von 0,2% Tricaine (MS-222) durch Zugabe von 1 g Tricaine zu 500 ml destilliertem Wasser und der pH-Wert auf 7,2 mit 1 M Tris, pH-Wert 9,5.
  6. Bereiten einer 2% igen Methylcelluloselösung für die Bildgebung zu machen , indem eine Lösung von 1x E3 (kein Methylenblau) platzieren, mit 1/10 Volumen von 0,2% Tricaine bei 4 ° C zugegeben.
    Hinweis: Die Methylcellulose-Lösung eine dicke, klare Lösung ist, die sanft verwendet wird, um Live-Embryonen für die Mikroskopie stabilisieren. Nach Manipulationen die Embryonen durchgeführt werden, können in 1x E3 gewaschen werden, um die Methyl aufzulösen, ohne das Tier zu verletzen und bei den nachfolgenden Stufen in der gleichen Probe ermöglicht Mikroskopie.
  7. Wenn auf 4 ° C abgekühlt, rühren Sie die 1x E3 / Tricaine Lösung kräftig auf einer Rührplatte und nach und nach die entsprechende Menge an Methyl hinzufügenCellulosepulver während sie weiterhin kräftig zu rühren. Nach und nach das Pulver zu der Lösung, um die Bildung von unlöslichen Methyl Aggregate zu verhindern.
  8. Nachdem das gesamte Pulver in die 2% Methylcellulose / E3 / Tricaine Lösung gemischt wird, rühren Sie die Verbundlösung im 4 ° C kalten Raum O / N.
    Hinweis: Die kalte Temperatur für voll am besten ist es, das Pulver zu lösen. Wenn die Lösung nicht klar nach einer Nacht ist, rühren Sie für einen zusätzlichen Arbeitstag und / oder einem zweiten O / N.
  9. Um Luftblasen aus der 2% Methylcellulose / E3 / Tricaine Lösung Aliquot der Mischung in 1,5 ml Röhrchen und drehen mit hoher Geschwindigkeit (12,000 × g) bei 4 ° C für 30 min oder bis zu 2 Stunden zu entfernen.
  10. Legen Sie die 2% Methylcellulose / E3 / Tricaine Lösung bei 4 ° C für die Langzeitlagerung.
    Hinweis: Vor der Verwendung sollten Aliquots für die Arbeit mit den Zebrabärbling Proben auf RT vorgewärmt werden.

2. Herstellung von Werkzeugen

  1. Bereiten Sie ein Embryo Manipulatorwerkzeug, für po verwendetsitionsang Embryonen für die Mikroinjektion, durch eine Gel-Beladungsspitze am Ende einer 5 "gerade Seziernadel Befestigung und Sicherung mit Klebeband oder superglue.
  2. Bereiten Mikroinjektionsnadeln mit einer Nadel Abzieher, indem man zuerst ein Feuer platzieren poliert 10 cm Borosilikatglas mit Filament in das Gerät und sichern Sie das Borosilicatglas durch die Griffe festziehen.
  3. Ziehen Sie das Borosilicatglas fein verjüngte Nadeln zu gestalten. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: Wärme 540, ziehen 245, Geschwindigkeit 200 und Zeit 125.
  4. Platz Nadeln in einer Petrischale, so dass sie auf einem Streifen aus Knetmasse Aussetzung der Nadelspitzen zu schützen, und halten Sie die Schale bedeckt Staubansammlung zu verhindern.
  5. Vorbereitung der Nadel für Mikroinjektionen zu beenden, mit einer Rasierklinge oder einer feinen Pinzette Kante verwenden die gezogener Ende der Nadel zu schneiden eine scharfe Winkelinjektionsspitze mit einem Durchmesser von etwa 0,05 bis 0,1 mm zu schaffen.
  6. Um die Mikroinjektions Tablett machen, bereiten Sie einen 1,5% igen / E3-Lösung in einem 100 ml Erlenmeyerkolben und die Agarose aufzulösen, indem der E3 zum Kochen in der Mikrowelle erhitzt dann erlauben bei RT für etwa 10 Minuten abkühlen lassen.
  7. Gießen Sie die gekühlte Agarose / E3-Lösung in eine Petrischale ein Fundament mit einer Tiefe von etwa 0,5 cm zu machen. Wenn diese erstarrt ist mit einer Tiefe von etwa 0,3 cm eine zweite Schicht gießen und das vorgefertigte Embryo gut Formeinsatz und lassen Sie die Agarose bei RT zu verfestigen.
    Hinweis: Beim Einsetzen der Form in die Top-Agar / E3-Schicht in einem Winkel um die Form in den Agar Anordnen der Anzahl von Luftblasen zu verringern.
  8. Wenn die gesamte Mikroinjektions Tablett gesetzt hat, heben auch die vorgefertigte Embryo langsam formen und vorsichtig mit einem Spatel verwenden, dann füllen die Schale mit E3-Lösung und lagern bei 4 ° C.

3. Embryo Vorbereitung

  1. Richten Sie Zebrabärbling Paarungs Tanks durch Trennwände in entsprechende Kammern und füllen mit System Wasser kommen.
  2. Setzen Sie einen Fisch auf jeder Seite des Teilers such, dass jede Gegenkammer enthält eine weibliche und eine männliche Fische und decken jede Paarung Kammer.
  3. Am nächsten Morgen, entfernen Sie die Teiler Laich zu ermöglichen.
  4. Überprüfen Sie den Fisch nach ca. 30 min, und nach der Erwachsenen in das Aquarium zurückkehrt, sammeln ihre Embryonen, die durch den Gegentankwasser durch ein feines Drahtgitter Sieb Werkzeug vorbei.
  5. Kehren Sie die Sieb über einer Petrischale und spülen mit E3 die Embryonen zu sammeln.
  6. Inkubieren Sie die Embryonen bei 28,5 ° CO / N.
  7. Wenn die Embryonen 24-26 Somitenstufe 26 erreicht haben, dekantiert die meisten der E3 Medien und dann dechorionate von 100 ul 50 mg Addier / ml Pronase zu jeder Schale von Embryonen und die Schale bei RT (23 ° C) Inkubieren für ungefähr 15 Minute
    Hinweis: Es dauert etwa 24-25 Stunden ab dem Zeitpunkt der Befruchtung für die Embryonen, die 24-26 Somiten Stadium zu erreichen, wenn sie gesammelt werden in der beschriebenen Art und Weise und inkubiert O / N bei 28,5 ° C.
  8. Füllen Sie die Schale mitE3 und schwenken dann sanft die Chorion aus den Embryonen zu entfernen.
  9. Dekantiert die E3 / Pronase und spülen Sie die Schale mit 25 ml frischem E3. Wiederholen Sie Spülschritt alle Pronase zu entfernen.
  10. So blockieren die Entwicklung der Pigmentierung, dekantiert die E3 und ersetzen mit 25 ml frischem E3 / PTU, wenn die Embryonen 24 Stunden nach der Befruchtung erreicht.
    Hinweis: Für Experimente mehrere Tage Spanning, sobald die E3 / PTU Lösung durch frische Medien ersetzt werden täglich die Schale sauber zu halten.

4. Mikroinjektion von Nephrotoxin Lösung

  1. Am Tag der Injektion, bereiten Sie die gewünschte Nephrotoxin Lösung zusammen mit der entsprechenden Fahrzeugsteuerung.
  2. Vortex oder vorsichtig mischen das Medikament (e), um sicherzustellen, ist / sind in der Lösung, die Seiten der Röhre und die Oberseite der Wassersäule zu überprüfen.
    Hinweis: Nephrotoxin Lösungen hergestellt werden können, um Spurenmengen von fluoreszenz konjugierten Dextran enthalten Mikroinjektionseffizienz zu überwachen und auch die renale Clearance bei SUBSEQ beurteilenießend Zeitpunkten 20,28.
  3. Legen Sie eine getrimmten Mikroinjektionsnadel mit ~ 2-3 ul der Nephrotoxin durch eine feine Gel-Beladungsspitze in die Rückseite des Einfädeln und suspendieren die Nadel vertikal mit einem Stück Klebeband die Lösung zu ermöglichen, um das zugeschnittene Nadelspitze durch die Schwerkraft zu füllen.
  4. Sobald die Nadelspitze voll ist, sichern die geladene Nadel in den Mikromanipulator.
  5. Testen des Mikroinjektionsvolumen um einen Tropfen Mineralöl auf eine Mikrometer-Objektträger platziert und Injizieren in das Öl um die Tröpfchengröße zu bewerten. Einem Injektionsvolumen von 500 pl hat einen Durchmesser von 0,1 mm.
  6. Entfernen Sie die Schale von Embryonen aus dem Inkubator und betäuben durch Zugabe von etwa 5 ml 0,2% Tricaine zum Embryo Gericht.
  7. Um eine vollständige Betäubung gewährleisten, sanft berühren Embryo mit der Spitze des Embryos Manipulatorwerkzeug. Der Mangel an Bewegung gibt ausreichend anesthetization.
  8. Nach dem erfolgreichen anesthetization, übertragen Embryonen in die Spritzgießform mit einem transfer Pipette.
  9. Manövrieren Sie jeden Embryo in eine andere Vertiefung der Form, um den Kopf in den tiefsten Bereich des Bohrlochs so platzieren, dass der Stamm entlang der Vertiefung ruht und der Schwanz ragt aus der Depression auf.
  10. Legen Sie die gefüllte Nadel in den Mikromanipulator und die Position der Nadelspitze neben einem Embryo.
  11. Führen Sie vorsichtig die Nadel in den Schwanz Schiff durch den Joystick nach vorne und drücken Sie den Fußschalter Bewegen des Mikroinjektions zu liefern.
    Hinweis: Eine erfolgreiche Injektion kann durch die Beobachtung der Flüssigkeitskreislauf gelangen gemessen werden. Ferner ermöglicht Koinjektion des nephrotoxicant mit fluoreszenz konjugiertes Dextran den Forscher erfolgreiche Injektion im Anschluss an das Verfahren zu überprüfen.
  12. Ziehen Sie vorsichtig auf dem Joystick zurück, um die Nadel aus dem Embryo zu entfernen.
  13. Nach der Injektion übertragen Sie die Embryonen in eine saubere Schüssel und spülen Sie die Tricaine und ersetzen mit frischen E3 / PTU zu entfernen.
  14. Inkubieren des Embryos auf den gewünschten Zeitpunkt zu Eselns Morphologie, die durch die Fotografie in Methylmontage Medien oder Verfahren zur experimentellen Analyse dokumentiert werden kann, wie gewünscht.
    Hinweis: Erholung von Embryonen beurteilt werden sollte der Anteil der Personen mit Ödemen, um zu bestimmen, die Nierenschädigung zeigt häufig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ein Mikroinjektionsstation eingerichtet umfasst eine Stereo, Mikromanipulator und Druckregler (1A). Durchleuchtung der Einspritzplatte ist bevorzugt , Proben während dieses Verfahrens (1B) anzuzeigen. Herstellung der Injektionsnadel umfasst das Ziehen des entsprechenden Borsilikatglas, gefolgt von der Kante der Vorbereitung mit Schneiden und schließlich die Nadel Backloading. Optimalerweise wird die Nadelspitze abgeschrägt anstatt stumpf (1C), einem Schnitt, der durch eine starke Abwinkeln der Kante des Schneidinstruments, wie beispielsweise die feinen Pinzetten, während des Schneidvorgangs erfolgt (1D). Diese abgeschrägte Kante ist von entscheidender Bedeutung und wird die Fähigkeit stark beeinflussen sanft die Nadel in den Zebrabärbling einzufügen.

Am Tag der Injektion wurden Embryonen robust, aber biegsam Embryo positioniertManipulationswerkzeuge (Abbildung 1E). Für die Injektion, Embryonen wurden manövriert, so dass der Rumpf an der Seite des Einspritzschale Hebelwirkung für die nachfolgende Einspritzstufe (1F) , um lag. Während die Injektion sollte man die Ebene der Blick auf den embryonalen Torso konzentrieren , um die Gefäß Ziel für Nadeleinführung zu visualisieren und dann das eingespritzte Material die Zirkulation (1G) eingeben beobachten.

Die Transparenz des Zebrafischembryo erleichtert das Mikroinjektionsverfahren, und kann weiter bei 24 hpf durch PTU chemische Behandlung verbessert werden , die Entwicklung der Pigmentierung während einer typischen experimentellen Zeitverlaufs (2A) zu verringern. Hier embryo Proben wurden erlaubt , durch den HPF 72 Stufe zu entwickeln, dann wurden entweder mock injiziert, mikroinjiziert mit Kochsalzträger oder mikroinjiziert mit 2,5 mg / ml Gentamicin (2A).Anschließende Live - Beobachtung wurde bei ein und zwei Tage nach der Injektion unter Verwendung von Durchleuchtungs Beleuchtung mit einem Stereomikroskop (2B) durchgeführt. Im Vergleich zu mock oder Salzlösung injizierten Embryonen werden nur die Gentamicin-injizierten Individuen zeigten die Entwicklung eines Ödems (2B), in diesem Fall pericardial Ödem, eine Aufhebung der normalen Nierenfunktionen darauf hindeutet , konsistent mit zuvor veröffentlichten Beobachtungen 11,20,21.

Abbildung 1
Abbildung 1. Mikroinjektionsgerät und Werkzeuge. (A) Injektionsstelle mit Stereomikroskop (links), Mikromanipulator und Nadelhalter (Mitte) und Druckregler (rechts) eingerichtet. (B) Durchleuchtung der Injektionsplatte. (C) Links: Blunt Schnitt Nadel. Rechts: Beveled Schnitt Nadel. (D) Fine Zange verwendet Nadelspitzen zu schneiden. (E) Manipulation verwendeten Werkzeuge einzusetzen und die Proben in die Spritzgussform positionieren. (F) Die Embryonen in der Mikroinjektionsform angeordnet. Maßstabsbalken = 0,5 mm. (G) Positionierung der Nadel neben dem Embryo zur Injektion. Maßstabsbalken = 0,15 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Experimentelle Timeline und Nacheinspritzung Ödem - Test. (A) Beispiel Nephrotoxin Versuchszeitleiste in Zebrabärbling, hier zu einer Gentamicin Studie angewendet. Die Embryonen wurden mit PTU-Lösung bei 24 Stunden nach der Befruchtung (HPF) dechorionated und behandelt. Jeden Tag wurde die PTU-Lösung dekantiert und durch frisches Medium ersetzt, wie durch die smalle angegebenenr grüne Pfeile. Bei 72 hpf wurden Embryonen narkotisiert, in eine Spritzgießform überführt und dann wie folgt behandelt: mock injiziert oder eingespritzt wird entweder Kochsalzlösung (Vehikel-Kontrolle) oder Gentamicin. Nachdem die Embryonen in frisches Medium Wiederbelebung wurden die Embryonen in 1 und 2 Tage nach der Injektion (96 und 120 HPF bezeichnet) für die Analyse und Bildaufnahme beobachtet. (B) nach oben: uninjizierten Zebrafischembryo. Mitte: Embryo bei 72 HPF mit Kochsalzlösung injiziert. Unten: Embryo mit 2,5 mg / ml Gentamicin injiziert. Maßstabsbalken = 0,5 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Eine vielfältige Anzahl von therapeutischen Wirkstoffen wurden mit AKI 29 verbunden. Es wurden von vielen einzelnen Verbindungen, wie das Aminoglycosid Gentamicin 30 und dem weit verbreiteten chemotherapeutischen Cisplatin induzierte Schäden beim Verständnis 31,32 signifikante Fortschritte in der Forschung gewesen. Einige pathologische Veränderungen dieser Bedingungen beteiligt sind, bleiben jedoch Gegenstand der laufenden Studie. Ein entstehender Herausforderung bleibt das Verständnis , wie mehrere Medikamente negativ auf die Patienten auswirken, vor allem diejenigen , die in Hochrisikogruppen , wie sie in der Intensivmedizin und ältere Menschen 29. So können Modelle, die über die Wirkung von Medikamenten-induzierten AKI weitere zelluläre basierte Studien ermöglichen dienen eine wichtige Rolle Erkennung dieser Erkrankung zu verbessern und dynamische Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten zu schätzen.

Die Arbeit mit Säugetiermodelle wie die Maus und Ratte sind integral gewesen zellulären Veränderungen in der Niere zu etablieren AKI folgende, but Eine Einschränkung bei diesen Systemen ist, dass die direkte Echtzeit-Beobachtung aufgrund der architektonischen Komplexität und inneren Lage des Organs begrenzt ist. Einfach ausgedrückt, ist die Niere für die direkte Beobachtung nicht zur Verfügung, die, dass der Einzelne die Niere zu analysieren geopfert werden erforderlich macht. Diese Einschränkungen können durch Verwendung Zebrabärbling Embryonen begegnet werden, was eine einfache Niere zweier Nephronen bilden, der ein konserviertes Segment - Struktur mit anderen Wirbeltieren, einschließlich Menschen 33. Zebrabärblingentwicklung tritt ex utero und mit geringen Pigmentierung, so dass für die direkte Beobachtung der Nieren Organogenese und Überwachung von Reaktionen auf externe Signale 34. Werkzeuge für die molekulare Analyse, wie die Genexpression 35-37 wurden mit hoher Auflösung verwendet , um die Eigenschaften von Nephrogenese 38-40 zu bestimmen. Experimentelle Manipulationen zum Testen von kleinen Molekülen durch chemische Genetik sind in Zebrabärbling und für den kidn etabliertey 41-43. Tatsächlich in den letzten Jahren Zebrabärbling wurden Nephrotoxizität von Agenten von Acetominophen auf Mykotoxine und Aristolochiasäure 44-48 bis hin zur Modellierung angewendet. Es ist wichtig zu beachten, dass es zu AKI Modellierung im Zebrafischembryo auch erhebliche Einschränkungen sind, wegen der Einfachheit der Nierenstruktur in diesem Stadium in der Entwicklung. Beispielsweise Zebrafisch nicht auf Adressieren multifaktorielle Wechselwirkungen innerhalb Nierengewebe geeignet, die dicht mit Nephronen verpackt ist, die von einem komplexen Stroma umgeben sind, die mehrere interstitiellen Zelltypen enthält, wie es der Fall in dem Nagetier oder menschliche Metanephros ist. So Zebrabärbling sind am besten geeignet, um die Visualisierung autonomen zellulären und molekularen Veränderungen in der nephron während AKI.

Verfahren nach Mikroinjektions hier beschrieben, während eine steile Lernkurve ist, ist sehr nützlich sowohl Entwicklungs- und Krankheitszuständen, einschließlich Nephrotoxinen für die Untersuchung. Diese Technik kann verwendet werden, um test Medikamente einzeln oder in Kombination. Außerdem können Injektionen während einer Vielzahl von Entwicklungszeitpunkten durchgeführt werden. Eine ähnliche, ebenso praktikable Methode zur intravenösen Mikroinjektionen in Zebrabärbling Larven Durchführung wurde von Cosentino zuvor beschrieben, et al. 21. Ein wesentlicher Unterschied in ihrer Methodik, im Vergleich zu den hier beschriebenen Verfahren ist , dass der Embryo injiziert werden immobilisiert unter Verwendung einer Haltepipette 21. Die Verwendung einer Haltepipette ist eine praktikable Alternative zu der Spritzgießform. Die Forscher, die versuchen, die Mikroinjektion zu implementieren als eine Liefermethode für nephrotoxicant Mittel sollten von dieser Alternative bewusst sein, und möchten, können die Methoden zu vergleichen, um zu ermitteln, welche persönlich vorzuziehen ist, als das Erlernen der Haltepipette zu manipulieren, um nicht den Embryo schädigen Praxis einbeziehen so wie es die Praxis erfordert, um erfolgreich zu manövrieren und microinject eine einfache Spritzgussform mit einer Vertiefung Hohlraum für den embr mitYos.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, entsprechend dimensionierten Injektionsnadeln vorzubereiten und den Winkel an der Nadelspitze zu schneiden glatt Ein- und Ausstieg in den embryonalen Kreislauf zu optimieren. Während des Injektionsvorganges ist es wichtig, die Einspritzvolumen zu beurteilen Konsistenz der Nephrotoxin Lieferung zwischen den Proben zu beobachten. Regelmäßige Beurteilung der Injektionsvolumen mit einem Mikrometer durchgeführt werden, wenn der Forscher über die Änderungen im Volumen unsicher ist, während der Durchführung eines Experiments. Zum Beispiel aufgrund der Art des Verfahrens kann die Nadelspitze teilweise oder vollständig mit Zelldebris verstopfen. Diese Komplikation kann in regelmäßigen Abständen durch das Löschen der Nadel entgegengewirkt werden, die Konsistenz des ausgestoßenen Flüssigkeit zu gewährleisten. Zusätzlich kann ein Vitalfarbstoff wie Phenolrot zu dem Gemisch hinzugefügt werden , als visuelle Marker der Injektion zu wirken und bei der Überwachung der Flüssigkeitsausbreitungs 49,50 unterstützen. Ferner können Injektionen Tracermoleküle unterstützen inVisualisierung von spezifischen Zellpopulationen nach der Injektion. Für die Co-Injektion von fluoreszierendem Dextran - Einheiten, insbesondere 10 kDa - Dextran - Konjugate, hat eine Anzahl von Anwendungen 16,17. In diesem Fall kann Auswertung der Fluoreszenzintensität durchgeführt werden, unmittelbar nach dem Verfahren erfolgreiche Mikroinjektion mit minimaler Leckage zu bestätigen. Die Intensität kann eine geeignete Bildaufnahme Fotografie gemessen werden und dann bei späteren Zeitpunkten erneut untersucht die Veränderung der Fluoreszenzintensität zu messen , um die renale Clearance 51 zu messen. Ferner Reabsorption des Dextrans im proximalen Tubulus liefert 16,17 für die Funktionalität dieses nephron Segment einen Proxy.

Zusammengenommen gibt es viele Möglichkeiten , die Mikroinjektion verwendet werden kann AKI mit der Zebrabärbling zu untersuchen, insbesondere da dieses Modell die Möglichkeit bietet , Pharmakokinetik in vivo zu behandeln. Sobald also beherrscht, die Mikroinjektion von Nephrotoxinenin den Zebrafischembryo sorgt für Nieren-Studien ein nützliches Paradigma.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde teilweise durch die NIH Zuschusses DP2OD008470 unterstützt. Zusätzlich RAM wurde von Fonds, die von der University of Notre Dame Graduate School zur Verfügung gestellt teilweise unterstützt. Wir danken den Mitarbeiter der Abteilung für Biologische Wissenschaften, das Zentrum für Zebrabärblinge Forschung, und das Zentrum für Stammzellen und regenerative Medizin an der University of Notre Dame. Wir danken vor allem den Mitgliedern des Labor für Diskussionen über Nieren Biologie und ihre hilfreichen Feedback zu dieser Arbeit engagieren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Chloride American Bioanalytical AB01915
Potassium Chloride American Bioanalytical AB01652
Calcium Chloride American Bioanalytical AB00366
N-Phenylthiourea (PTU) Aldrich Chemistry P7629
Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine) Fluka Analytical A5040
Borosilicate glass Sutter Instruments Co. BF100-50-10
Flaming/Brown Micropipette puller Sutter Instruments Co. Mo. P097
UltraPure Agarose Invitrogen 15510-027
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M7506
Methylene Blue Sigma-Aldrich M9140
Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning:
60 mm x 15 mm VWR 25373-085
100 mm x 15 mm VWR 25373-100
 (microinjection tray) 150 mm x 15 mm VWR 25373-187
Low Temperature Incubator Fischer Scientific 11 690 516DQ
Micro Dissecting Tweezer Roboz Surgical Instruments Co. RS-5010
Micrometer Ted Pella, Inc. 2280-24

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Basile, D. P., Anderson, M. D., Sutton, T. A. Pathophysiology of acute kidney injury. Compr. Physiol. 2, 1303-1353 (2012).
  2. Ostermann, M. Diagnosis of acute kidney injury: kidney disease improving global outcomes criteria and beyond. Curr. Opin. Crit. Care. 20, 581-587 (2014).
  3. Fluck, R. J. Acute kidney: improving the pathway of care for patients and across healthcare. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 24, 511-516 (2015).
  4. Silver, S. A., Cardinal, H., Colwell, K., Burger, D., Dickhout, J. G. Acute kidney injury: preclinical innovations, challenges, and opportunities for translation. Can. J Kidney Health Dis. 2, 30 (2015).
  5. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. Renal stem cells: fact or science fiction? Biochem. J. 444, 153-168 (2012).
  6. Li, Y., Wingert, R. A. Regenerative medicine for the kidney: stem cell prospects and challenges. Clin. Transl. Med. 2, 11 (2013).
  7. Romagani, P., Lasagni, L., Remuzzi, G. Renal progenitors: an evolutionary conserved strategy for kidney regeneration. Nat. Rev. Nephrol. 9, 137-146 (2013).
  8. Kline, J., Rachoin, J. S. Acute kidney injury and chronic kidney disease: it's a two-way street. Ren. Fail. 35, 452-455 (2013).
  9. Chawla, L. S., Kimmel, P. L. Acute kidney injury and chronic kidney disease: an integrated clinical syndrome. Kidney Int. 82, 516-524 (2012).
  10. Sanz, A. B., Sanchez-Niño, M. D., Martìn-Cleary, C., Ortiz, A., Ramos, A. M. Progress in the development of animal models of acute kidney injury and its impact on drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 8, 879-895 (2013).
  11. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Transl Res. 163, 109-122 (2014).
  12. McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish renal pathology: emerging models of acute kidney injury. Curr. Pathobiol. Rep. 3, 171-181 (2015).
  13. Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
  14. Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73, 1120-1127 (2008).
  15. Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
  16. McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. J. Vis. Exp. (90), e51644 (2014).
  17. Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J. Vis. Exp. (54), e2845 (2011).
  18. Palmyre, A., et al. Collective epithelial migration drives kidney repair after acute injury. PLoS One. 9, e101304 (2014).
  19. Fogelgren, B., et al. Exocyst Sec10 protects renal tubule cells from injury by EGFR/MAPK activation and effects on endocytosis. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 307, F1334-F1341 (2014).
  20. Hentschel, D. M., Park, K. M., Cilenti, L., Zervox, A. S., Drummond, I. A., Bonventre, J. V. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 288, F923-F929 (2005).
  21. Cosentino, C. C., Roman, B. L., Drummond, I. A., Hukriede, N. A. Intravenous microinjections of zebrafish larvae to study acute kidney injury. J. Vis. Exp. (42), e2079 (2010).
  22. Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
  23. Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-101 (2011).
  24. McCampbell, K. M., Springer, K. N., Wingert, R. A. Atlas of cellular dynamics during zebrafish adult kidney regeneration. Stem Cell Int. , 547636 (2015).
  25. Sharma, P., Sharma, S., Patial, V., Singh, D., Padwad, Y. S. Zebrafish (Danio rerio): a potential model for nephroprotective drug screening. Clinical Queries: Nephrol. 3, 97-105 (2014).
  26. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 559-585 (2013).
  27. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  28. Hanke, N., et al. 'Zebrafishing' for novel genes relevant to the glomerular filtration barrier. Biomed. Res. Int. 2013, 658270 (2013).
  29. Kane-Gill, S. L., Goldstein, S. L. Drug-induced acute kidney injury: a focus on risk assessment for prevention. Crit. Care Clin. 31, 675-684 (2015).
  30. Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view. Kidney Int. 79, 33-45 (2010).
  31. Ozkok, A., Edelstein, C. L. Pathophysiology of cisplatin-induced acute kidney injury. Biomed. Res. Int. 2014, 967826 (2014).
  32. Perazella, M. A., Moeckel, G. W. Nephrotoxicity from chemotherapeutic agents: clinical manifestations, pathobiology, and prevention/therapy. Semin. Nephrol. 30, 570-581 (2010).
  33. Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Recent advances in elucidating the genetic mechanisms of nephrogenesis using zebrafish. Cells. 4, 218-233 (2015).
  34. Pickart, M. A., Klee, E. W. Zebrafish approaches enhance the translational research tackle box. Transl. Res. 163, 65-78 (2014).
  35. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. J. Vis. Exp. (89), e51604 (2014).
  36. Galloway, J. L., Wingert, R. A., Thisse, C., Thisse, B., Zon, L. I. Combinatorial regulation of novel erythroid gene expression in zebrafish. Exp. Hematol. 36, 424-432 (2008).
  37. McKee, R., Gerlach, G. F., Jou, J., Cheng, C. N., Wingert, R. A. Temporal and spatial expression of tight junction genes during zebrafish pronephros development. Gene Expr. Patterns. 16, 104-113 (2014).
  38. Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev. Biol. 386, 111-122 (2014).
  39. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Zebrafish pronephros tubulogenesis and epithelial identity maintenance are reliant on the polarity proteins Prkc iota and zeta. Dev. Biol. 396, 183-200 (2014).
  40. Cheng, C. N., Wingert, R. A. Nephron proximal tubule patterning and corpuscles of Stannius formation are regulated by the sim1a transcription factor and retinoic acid in the zebrafish. Dev. Biol. 399, 100-116 (2015).
  41. Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): A vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Res. C Embryo Today. 93, 268-280 (2011).
  42. Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Congenital and acute kidney disease: translational research insights from zebrafish chemical genetics. Gen. Med. 1, 112 (2013).
  43. Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (93), e52063 (2014).
  44. Peng, H. C., Wang, Y. H., Wen, C. C., Wang, W. H., Cheng, C. C., Chen, Y. H. Nephrotoxicity assessments of acetaminophen during zebrafish embryogenesis. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 151, 480-586 (2010).
  45. Wu, T. S., Yang, J. J., Yu, F. Y., Liu, B. H. Evaluation of nephrotoxic effects of mycotoxins, citrinin and patulin, on zebrafish (Danio rerio) embryos. Food Chem. Toxicol. 50, 4398-4404 (2012).
  46. Ding, Y. J., Chen, Y. H. Developmental nephrotoxicity of aristolochic acid in a zebrafish model. Toxicol. Appl. Pharmacol. 261, 59-65 (2012).
  47. Zennaro, C., et al. Podocyte developmental defects caused by adriamycin in zebrafish embryos and larvae: a novel model of glomerular damage. PLoS One. 9, e98131 (2014).
  48. Ding, Y. J., Sun, C. Y., Wen, C. C., Chen, Y. H. Nephroprotective role of resveratrol and ursolic acid in aristolochic acid intoxicated zebrafish. Toxins. 7, 97-109 (2015).
  49. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (27), e1115 (2009).
  50. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
  51. Christou-Savina, S., Beales, P. L., Osborn, D. P. Evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay. J. Vis. Exp. (96), e52540 (2015).

Tags

Medizin Ausgabe 113 Zebrabärbling Niere Nephrotoxin renale Clearance akutem Nierenversagen Mikroinjektion Gentamicin
Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McKee, R. A., Wingert, R. A.… More

McKee, R. A., Wingert, R. A. Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury. J. Vis. Exp. (113), e54241, doi:10.3791/54241 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter