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Biology

Zebrafish में Nephrotoxin Microinjection गुर्दे की गंभीर चोट मॉडल के लिए

Published: July 17, 2016 doi: 10.3791/54241
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Center for Zebrafish Research, Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Center for Stem Cells and Regenerative Medicine, Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

Summary

गुर्दे की चोटों nephrotoxins, जो एंटीबायोटिक दवाओं से केमोथेरापी से लेकर दवाओं में शामिल हैं से किए गए, जटिल विकारों जिसका रोगजनन पूरी तरह से समझे रहता है में परिणाम कर सकते हैं। इस प्रोटोकॉल दर्शाता है कि कैसे zebrafish इन परिस्थितियों, जो renoprotective उपायों की पहचान करने के लिए लागू किया जा सकता का रोग मॉडलिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Abstract

गुर्दे रसायन वे खून से फिल्टर करने के लिए जोखिम से नुकसान करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। इस अंग गुर्दे समारोह और नैदानिक ​​तीव्र गुर्दे की चोट (अकी) के रूप में जाना जाता है सिंड्रोम के विकास में तेजी से गिरावट के साथ जुड़े चोट करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। औषधीय एजेंटों या जब व्यक्तिगत रूप से प्रशासित चिकित्सा परिस्थितियों जीवाणु संक्रमण से कैंसर, को लेकर इलाज के लिए इस्तेमाल अन्य दवाओं के साथ संयोजन में, अकी आरंभ कर सकते हैं। Zebrafish विवो में गुर्दे समारोह पर रासायनिक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी पशु मॉडल के रूप में वे एक भ्रूण गुर्दे नेफ्रॉन कार्यात्मक इकाइयों कि मानव सहित उच्च रीढ़, साथ संरक्षित कर रहे हैं के शामिल फार्म हैं। इसके अलावा, zebrafish आनुवंशिक और रासायनिक स्क्रीन है, जो अकी के सेलुलर और आणविक पहलुओं को स्पष्ट और ऐसे nephroprotective अणुओं की पहचान के रूप में चिकित्सकीय रणनीति विकसित करने के लिए अवसर उपलब्ध कराने के प्रदर्शन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। यहाँ, हम में कैसे microinjection का प्रदर्शनzebrafish भ्रूण nephrotoxin अध्ययन के लिए एक प्रतिमान के रूप में उपयोग किया जा सकता है।

Introduction

अकी गुर्दे समारोह में कहा कि विनाशकारी स्वास्थ्य परिणाम 1 करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं की एक आकस्मिक नुकसान हुआ है। अकी एक महत्वपूर्ण स्वास्थ्य मुद्दा 50-70% 1-3 की मृत्यु दर क्रिटिकल केयर मामलों में 30-50% की भी उच्च दर और बुजुर्गों, और साथ, अस्पताल में भर्ती मरीजों के बीच लगभग 20% की अपनी उच्च घटना के कारण दुनिया भर में है। दुर्भाग्य से, अकी के प्रसार में वृद्धि की गई है और कारकों की विविधता है कि अकी पैदा कर सकते हैं, जो पोस्ट ऑपरेटिव तनाव, ischemia, और जैसे एंटीबायोटिक दवाओं और के रूप में nephrotoxins के लिए जोखिम को शामिल करने के कारण भाग में, अगले एक दशक में आगे बढ़ा होने का अनुमान है कीमोथेरेपी दवाओं 4।

अकी गुर्दे के भीतर अचानक सेलुलर क्षति शामिल है, आमतौर पर नेफ्रॉन, जो आवश्यक कार्यात्मक इकाइयां हैं, और एक रक्त फिल्टर और एक खंडों छोटी नली है कि केंद्रीय एकत्रित नलिकाओं 1 में मूत्र नालियों के शामिल हैं में होने वाली। जब नेफ्रॉन की एक महत्वपूर्ण संख्या में हैंअकी के दौरान क्षतिग्रस्त, तत्काल प्रभाव मर चुका है और मर कोशिकाओं 1 से बाधा के कारण नेफ्रॉन के माध्यम से प्रचलन से अपशिष्ट क्लीयरेंस में एक रुकावट है, और कम या निराकृत द्रव का प्रवाह शामिल हैं। समय के साथ, ट्यूबलर रुकावट पूरे नेफ्रॉन, जो स्थायी रूप से गुर्दे समारोह 1 कम कर देता है के अध: पतन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। अकी निम्नलिखित गुर्दे में शारीरिक परिवर्तन भी जटिल भड़काऊ घटनाओं है कि जीर्ण scarring 1 करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं शामिल है।

इन परिणामों के बावजूद, नेफ्रॉन अकी कि ट्यूबलर उपकला 5,6 reconstitutes के बाद उत्थान से गुजरना करने के लिए कुछ क्षमता है। नेफ्रॉन उत्थान के एक बढ़ती हुई आणविक समझ कर दिया गया है, वहीं तंत्र कई संबंध में मायावी रहते हैं और जरूरत जांच 7 जारी रखा। डिग्री है जो अकी स्थायी गुर्दे की क्षति में परिणाम भी अनजान बनी हुई है। वर्तमान शोध से पता चलता गुर्दे के लिए पुनर्योजी क्षमता हैजबकि अधिक स्पष्ट या दोहराया एपिसोड क्रोनिक किडनी रोग (सीकेडी) के लिए नेतृत्व उच्चतम, अकी के कम गंभीर मामलों के बाद और अंत मंच वृक्क रोग (ईएसआरडी) है कि जीवन रक्षक प्रत्यारोपण या डायलिसिस की आवश्यकता है 8,9 में culminate। इसके अतिरिक्त, व्यक्तियों को पहले से ही सीकेडी से पीड़ित अकी 8,9 की एक गंभीर प्रकरण से ग्रस्त होने का एक भी उच्च जोखिम में हैं। साथ में ले ली, यह है कि जारी रखा बुनियादी और नैदानिक ​​अनुसंधान, समझने के इलाज के लिए और अकी को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है स्पष्ट है।

पशु मॉडल के साथ अनुसंधान स्थानीय और पर्यावरण परिवर्तन है कि अकी 10 के दौरान होने की प्रगति की प्रशंसा में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। इस समझ का विस्तार करने के साथ ही नए उपचारों के विकास, zebrafish पशु मॉडल तरीके 11,12 की एक किस्म में नियोजित किया गया है। Zebrafish गुर्दे की नेफ्रॉन, दोनों भ्रूण और वयस्क में, स्तनधारियों 13-16 के साथ संरक्षण के एक उच्च डिग्री प्रदर्शित करते हैं। इसके अलावा, ज़ी में वृक्कांग उपकला चोटbrafish उच्च रीढ़, जिससे ट्यूबलर कोशिकाओं के स्थानीय विनाश intratubular प्रसार और नेफ्रॉन वास्तुकला 17-19 के reestablishment द्वारा पीछा किया जाता है में प्रक्रिया जैसा दिखता है। भ्रूण में, हालांकि, सिस्पैटिन तरह nephrotoxins से व्यापक क्षति छोटी नली मारक 20,21 के साथ जुड़ा हुआ है। तुलना करके, zebrafish वयस्कों अकी जीवित है और गुर्दे में ठोस पुनर्योजी क्षमताओं दिखा रहे हैं। उदाहरण के लिए, अमिनोग्लाईकोसाइड एंटीबायोटिक जेंटामाइसिन को प्रदर्शन के बाद, zebrafish छोटी नली उपकला नुकसान पुनर्जन्म और नए नेफ्रॉन इकाइयों के रूप में अच्छी तरह से 22-24 बढ़ता है। इन जेंटामाइसिन प्रेरित अकी अध्ययनों अमूल्य जानकारी उपलब्ध कराई है, वहीं विविध nephrotoxins से गुर्दे की क्षति को समझने के प्रभाव और नुकसान 25 के विभिन्न प्रकार की प्रतिक्रिया की सराहना करने के लिए गंभीर बनी हुई है।

zebrafish भ्रूण, इसके आकार, पारदर्शिता, और आनुवंशिक शिक्षणीयता के कारण, nephrotoxin अध्ययन के लिए कई फायदे हैं <sup> 25, जहां microinjection 20,21 की विधि जांच के लिए अणु (s) प्रशासन के लिए प्रयोग किया जाता है। नेफ्रॉन 24 घंटे बाद निषेचन (HPF) द्वारा गठित और लगभग 48 HPF 26,27 से खून को फिल्टर करने के लिए शुरू कर रहे हैं। इस प्रकार, तेजी से गठन और भ्रूण गुर्दे के समारोह में प्रयोगात्मक विश्लेषण की सुविधा। हालांकि, microinjection की प्रक्रिया तकनीकी चुनौतियों का सामना किया और तकनीक माहिर करने के लिए एक तेजी से सीखने की अवस्था हो सकता है। इस वीडियो लेख में, हम कैसे microinjections प्रदर्शन और आदेश में सफल इंजेक्शन की दर को बढ़ाने के लिए समस्या निवारण युक्तियाँ प्रदान करने का वर्णन है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में वर्णित zebrafish भ्रूण के साथ काम करने के लिए प्रक्रियाओं नोट्रे डेम विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. समाधान की तैयारी

  1. आरटी पर 73.0 छ NaCl, 3.15 छ KCl, 9.15 जी 2 CaCl, और आसुत जल के 5 एल में 9.95 जी MgSO 4, और दुकान के मिश्रण से E3 भ्रूण मीडिया के एक 50x शेयर समाधान करें।
  2. zebrafish भ्रूण के संवर्धन के लिए, आसुत जल के साथ एक 1x काम कर समाधान के लिए E3 भ्रूण मीडिया शेयर की 50x शेयर समाधान पतला तो 1x E3 के हर 1 एल एक कवकनाशी के रूप में कार्य करने के लिए, और दुकान में 0.05% methylene नीले रंग के 200 μl जोड़ने आर टी।
  3. 0.06 मिलीग्राम पीटीयू के साथ 50x E3 शेयर के 40 मिलीलीटर के संयोजन से 0.003% 1-फिनाइल-2-Thiourea (पीटीयू) के साथ E3 भ्रूण मीडिया के एक रंजकता अवरुद्ध समाधान करें। तब आसुत जल के साथ 2 एल की कुल मात्रा को लाओ।
  4. आरटी पर E3 / पीटीयू हे / एन हिलाओ समाधान में पीटीयू पाउडर पाने के लिए। तो कम से E3 / पीटीयू स्टोरआर टी।
    नोट: E3 / पीटीयू लगभग एक सप्ताह की शैल्फ जीवन है, और पुराने समाधान zebrafish लार्वा में रंजकता विकास को अवरुद्ध करने में कम प्रभावी हो जाएगा।
  5. आसुत जल के 500 मिलीलीटर के लिए Tricaine की 1 ग्राम जोड़कर 0.2% Tricaine (एमएस-222) के एक संवेदनाहारी समाधान करें और 1 एम Tris, पीएच 9.5 से 7.2 पीएच को समायोजित करें।
  6. 0.2% Tricaine 4 डिग्री सेल्सियस पर जोड़ा के 1/10 वें मात्रा के साथ, 1x E3 (कोई methylene नीले) का एक समाधान रखकर इमेजिंग के लिए एक 2% methylcellulose समाधान बनाने के लिए तैयार करें।
    नोट: methylcellulose समाधान के लिए एक मोटी, स्पष्ट समाधान है कि धीरे माइक्रोस्कोपी के लिए रहते भ्रूण को स्थिर करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है। जोड़तोड़ प्रदर्शन कर रहे हैं के बाद भ्रूण को पशु घायल हो गए और एक ही नमूना में बाद के चरणों में माइक्रोस्कोपी सक्रिय करने के बिना methylcellulose भंग करने के लिए 1x E3 में धोया जा सकता है।
  7. जब 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा, एक हलचल प्लेट पर सख्ती 1x E3 / Tricaine समाधान हलचल और धीरे-धीरे मिथाइल की उचित मात्रा में जोड़नेसेल्यूलोज पाउडर, जबकि तेजी से हलचल जारी है। धीरे-धीरे अघुलनशील methylcellulose समुच्चय के गठन को रोकने के समाधान के लिए पाउडर डालें।
  8. के बाद सभी पाउडर 2% methylcellulose / E3 / tricaine समाधान में मिलाया जाता है, 4 डिग्री सेल्सियस ठंडे कमरे हे / एन में समग्र समाधान हलचल।
    नोट: ठंड तापमान पूरी तरह से पाउडर भंग के लिए सबसे अच्छा है। समाधान एक रात के बाद स्पष्ट नहीं है, तो एक अतिरिक्त कार्यदिवस और / या एक दूसरे हे / N के लिए हलचल।
  9. हवा के बुलबुले 30 मिनट के लिए या 2 घंटा अप करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर उच्च गति (12,000 XG) में 1.5 मिलीलीटर ट्यूब और स्पिन में 2% methylcellulose / E3 / tricaine समाधान, विभाज्य मिश्रण से निकालने के लिए।
  10. 2% methylcellulose / E3 / Tricaine लंबी अवधि के भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान रखें।
    नोट: उपयोग करने से पहले, aliquots आरटी के लिए zebrafish नमूनों के साथ काम करने के लिए पूर्व गरम किया जाना चाहिए।

2. उपकरण की तैयारी

  1. एक भ्रूण जोड़तोड़ उपकरण, पुलिस के लिए इस्तेमाल किया तैयारmicroinjection के लिए भ्रूण sitioning, एक 5 "सीधे विदारक सुई के अंत पर एक जेल लोड हो रहा टिप संलग्न करके, और टेप या superglue के साथ सुरक्षित है।
  2. एक सुई खींचने का उपयोग microinjection सुई, तैयार पहले एक आग रखकर साधन में रेशा के साथ 10 सेमी borosilicate ग्लास पॉलिश और हैंडल कस द्वारा borosilicate ग्लास सुरक्षित।
  3. ठीक-पतला सुइयों फैशन के लिए borosilicate ग्लास खींचो। निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करें: गर्मी 540, 245 खींच, वेग 200, और समय 125।
  4. एक पेट्री डिश के अंदर जगह सुई, क्ले मॉडलिंग की एक पट्टी पर उन्हें निलंबित सुई सुझावों की रक्षा, और धूल संचय रोकने के लिए कवर पकवान बनाए रखने के लिए।
  5. microinjections के लिए सुई की तैयारी कर खत्म करने के लिए, एक रेजर ब्लेड या ठीक संदंश बढ़त का उपयोग सुई की खींच लिया अंत में कटौती करने के लिए लगभग 0.05-0.1 मिमी की एक व्यास के साथ एक तेज कोणीय इंजेक्शन नोक बनाने के लिए।
  6. microinjection ट्रे बनाने के लिए, एक 10 में 1.5% agarose / E3 समाधान तैयार0 मिलीलीटर Erlenmeyer फ्लास्क और एक माइक्रोवेव में एक फोड़ा करने के लिए E3 हीटिंग तो लगभग 10 मिनट के लिए आरटी पर शांत करने के लिए अनुमति देने के द्वारा agarose भंग।
  7. लगभग 0.5 सेमी की गहराई के साथ एक नींव बनाने के लिए एक पेट्री डिश में ठंडा agarose / E3 समाधान डालो। यह लगभग 0.3 सेमी की गहराई के साथ एक दूसरी परत डालना और पूर्वनिर्मित भ्रूण अच्छी तरह से ढालना डालने और agarose आरटी पर जमना करने की अनुमति जम गया है।
    नोट: जब शीर्ष अगर / E3 परत में ढालना डालने, एक कोण पर अगर में ढालना रखने हवा के बुलबुले की संख्या में कमी करने के लिए।
  8. जब पूरे microinjection ट्रे का गठन किया है, उठा पूर्वनिर्मित भ्रूण अच्छी तरह से धीरे धीरे और सावधानी से एक scoopula का उपयोग कर बाहर ढालना, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर E3 समाधान और दुकान के साथ पकवान भरें।

3. भ्रूण तैयारी

  1. संभोग के कक्षों में डिवाइडर रखकर zebrafish संभोग टैंक की स्थापना की और प्रणाली पानी के साथ भरें।
  2. विभक्त एस के प्रत्येक पक्ष पर एक मछली की जगहuch कि प्रत्येक संभोग चैम्बर एक महिला और एक पुरुष मछली शामिल हैं, और प्रत्येक संभोग चैम्बर कवर।
  3. अगली सुबह, स्पॉन सक्षम करने के लिए डिवाइडर को हटा दें।
  4. मछली की जाँच के बाद लगभग 30 मिनट, और मछलीघर के लिए वयस्कों के लौटने के बाद, उनके भ्रूण एक ठीक तार-जाल छलनी उपकरण के माध्यम से संभोग टैंक पानी से गुजर रहा इकट्ठा।
  5. एक पेट्री डिश पर झरनी पलटना और भ्रूण इकट्ठा करने के लिए E3 से कुल्ला।
  6. 28.5 डिग्री सीओ / एन में भ्रूण सेते हैं।
  7. जब भ्रूण 24-26 विखंड चरण 26 पर पहुंच गया है, तो dechorionate E3 मीडिया के सबसे अधिक है और छानना भ्रूण के प्रत्येक पकवान 50 मिलीग्राम / मिलीलीटर pronase के 100 μl जोड़ने और लगभग 15 के लिए आरटी पर पकवान (23 डिग्री सेल्सियस) incubating द्वारा मि।
    नोट: यह निषेचन के समय से लगभग 24-25 मानव संसाधन लेने के लिए भ्रूण 24-26 विखंड चरण तक पहुंचने के लिए अगर वे एकत्र कर रहे हैं में वर्णित ढंग से और ओ / एन incubated 28.5 डिग्री सेल्सियस पर होगा।
  8. साथ पकवान भरेंE3 और फिर धीरे से चक्कर आने भ्रूण से chorions को बेदखल करने के लिए।
  9. E3 / pronase छानना और ताजा E3 के 25 मिलीलीटर के साथ पकवान कुल्ला। दोहराएँ कुल्ला कदम के लिए सभी pronase हटा दें।
  10. रंजकता के विकासखण्ड, E3 छानना और जब भ्रूण 24 घंटे बाद निषेचन तक पहुँच चुके ताजा E3 / पीटीयू के 25 मिलीलीटर के साथ की जगह।
    नोट: प्रयोगों कई दिनों फैले लिए, पकवान स्वच्छ रखने के लिए एक बार दैनिक ताजा मीडिया के साथ E3 / पीटीयू समाधान की जगह।

4. Nephrotoxin समाधान के microinjection

  1. इंजेक्शन के दिन, उचित वाहन पर नियंत्रण के साथ-साथ वांछित nephrotoxin समाधान तैयार है।
  2. भंवर या धीरे मिश्रण दवा (ओं) के लिए बीमा करने के लिए ट्यूब और पानी स्तंभ के ऊपर के पक्ष जाँच / समाधान में हो रहा है।
    नोट: Nephrotoxin समाधान microinjection दक्षता पर नजर रखने के लिए और भी subseq में गुर्दे की निकासी का आकलन करने के fluorescently संयुग्मित dextran की मात्रा का पता लगाने को रोकने के लिए तैयार किया जा सकताuent समय 20,28 अंक।
  3. सुई के पीछे में एक ठीक जेल लोड हो रहा टिप सूत्रण द्वारा nephrotoxin की ~ 2-3 μl के साथ एक छंटनी की microinjection सुई लोड और टेप का एक टुकड़ा के साथ खड़ी सुई को निलंबित समाधान गंभीरता से छंटनी की सुई की नोक को भरने के लिए अनुमति देते हैं।
  4. एक बार सुई टिप भरा हुआ है, micromanipulator में भरी हुई सुई सुरक्षित।
  5. एक माइक्रोमीटर स्लाइड पर खनिज तेल की एक बूंद रखकर microinjection मात्रा का परीक्षण और तेल में सुई छोटी बूंद के आकार का मूल्यांकन करने के लिए। 500 पी एल की एक इंजेक्शन की मात्रा 0.1 मिमी की एक व्यास है।
  6. इनक्यूबेटर से भ्रूण के पकवान निकालें, और भ्रूण डिश के लिए लगभग 0.2% Tricaine के 5 मिलीलीटर जोड़कर anesthetize।
  7. पूरा anesthetization सुनिश्चित करने के लिए, धीरे भ्रूण जोड़तोड़ उपकरण की नोक के साथ भ्रूण स्पर्श करें। आंदोलन की कमी पर्याप्त anesthetization इंगित करता है।
  8. सफल anesthetization के बाद, एक स्ि्न्ंतरर के साथ इंजेक्शन मोल्ड करने के लिए भ्रूण स्थानांतरणएर पिपेट।
  9. मोल्ड में अच्छी तरह से है कि इस तरह ट्रंक अवसाद के साथ टिकी हुई है और पूंछ अवसाद से बाहर चिपक के गहरे क्षेत्र में सिर रखने के लिए एक अलग कुएं में प्रत्येक भ्रूण पैंतरेबाजी।
  10. micromanipulator में भरा सुई डालें और एक भ्रूण के बगल में सुई की नोक स्थिति।
  11. धीरे जॉयस्टिक आगे बढ़ने से पूंछ पोत में सुई डालने और microinjection वितरित करने के लिए पैर पेडल दबाना।
    नोट: सफल इंजेक्शन तरल देख कर लगाया जा सकता है संचलन में प्रवेश। इसके अलावा, fluorescently संयुग्मित dextran साथ nephrotoxicant के सह इंजेक्शन प्रक्रिया करने के बाद सफल इंजेक्शन सत्यापित करने के लिए शोधकर्ता सक्षम बनाता है।
  12. धीरे जॉयस्टिक पर वापस खींचने के भ्रूण से सुई निकालने के लिए।
  13. इंजेक्शन के बाद, एक साफ डिश के लिए भ्रूण हस्तांतरण और Tricaine हटाने और ताजा E3 / पीटीयू के साथ बदलने के लिए कुल्ला।
  14. गधे को वांछित समय बात करने के लिए भ्रूण सेतेएस आकृति विज्ञान, जो वांछित के रूप में प्रयोगात्मक विश्लेषण के लिए methylcellulose बढ़ते मीडिया, या प्रक्रिया में फोटोग्राफी द्वारा प्रलेखित किया जा सकता।
    नोट: भ्रूण की वसूली सूजन, जो आमतौर पर गुर्दे की चोट को इंगित करता है के साथ व्यक्तियों का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए।

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Representative Results

एक microinjection स्टेशन स्थापित एक stereomicroscope, micromanipulator और दबाव नियामक (चित्रा 1 ए) भी शामिल है। इंजेक्शन थाली के transillumination इस प्रक्रिया (चित्रा 1 बी) के दौरान नमूनों को देखने के लिए बेहतर है। इंजेक्शन सुई की तैयारी उचित borosilicate ग्लास, काटने और अंत में वापस लोड सुई के साथ बढ़त तैयारी द्वारा पीछा किया खींच शामिल है। बेहतर, सुई टिप (चित्रा 1 सी), एक कट कि इस तरह के ठीक संदंश के रूप में तेजी से काटने के उपकरण, के किनारे angling द्वारा किया जाता है, कुंद काटने की प्रक्रिया के दौरान बजाय beveled है (चित्रा -1)। यह beveled बढ़त महत्वपूर्ण है और बहुत धीरे zebrafish में सुई डालने करने की क्षमता को प्रभावित करेगा।

इंजेक्शन के दिन, भ्रूण मजबूत लेकिन लचीला भ्रूण का उपयोग कर तैनात थेहेरफेर उपकरण (चित्रा 1E)। इंजेक्शन के लिए, भ्रूण चतुराई रहे थे, कि इस तरह के धड़ इंजेक्शन ट्रे के पक्ष के साथ विश्राम किया बाद में इंजेक्शन कदम (चित्रा 1F) के लिए लाभ उठाने प्रदान करने के लिए। इंजेक्शन लगाने, वहीं एक सुई प्रविष्टि के लिए संवहनी गंतव्य कल्पना करने के लिए और उसके बाद निरीक्षण इंजेक्शन सामग्री परिसंचरण (चित्रा 1G) दर्ज भ्रूण धड़ पर देखने का विमान ध्यान केंद्रित करना चाहिए।

Zebrafish भ्रूण की पारदर्शिता microinjection प्रक्रिया की सुविधा है, और आगे एक ठेठ प्रयोगात्मक समय पाठ्यक्रम (2A चित्रा) के दौरान रंजकता के विकास को कम करने के लिए 24 HPF पर पीटीयू रासायनिक उपचार के द्वारा बढ़ाया जा सकता है। इधर, भ्रूण नमूनों, 72 HPF मंच के माध्यम से विकसित करने के लिए अनुमति दी गई तो थे या तो नकली इंजेक्शन, खारा वाहन के साथ microinjected, या 2.5 मिलीग्राम / एमएल जेंटामाइसिन (2A चित्रा) के साथ microinjected।इसके बाद लाइव अवलोकन एक और दो ​​दिनों के इंजेक्शन पद पर आयोजित किया गया था, एक stereomicroscope (चित्रा 2 बी) के साथ transillumination प्रकाश का उपयोग। नकली या खारा इंजेक्शन भ्रूण की तुलना में, केवल जेंटामाइसिन इंजेक्शन व्यक्तियों शोफ के विकास (चित्रा 2 बी) से पता चला है, इस मामले पेरिकार्डियल शोफ में, सामान्य गुर्दे की कार्यक्षमता पहले प्रकाशित टिप्पणियों 11,20,21 के साथ संगत की एक निराकरण का सुझाव दे।

आकृति 1
चित्रा 1. microinjection तंत्र और उपकरण। (ए) इंजेक्शन स्टेशन stereomicroscope (बाएं) के साथ स्थापित की, micromanipulator और सुई धारक (मध्य) और दबाव नियामक (दाएं)। (बी) के इंजेक्शन थाली के transillumination। (सी) वाम: कुंद कटौती सुई। अधिकार: Beveled कटौती सुई। (डी) एफine संदंश सुई सुझावों कटौती करने के लिए इस्तेमाल किया। (ई) हेरफेर डालने और इंजेक्शन मोल्ड में नमूनों की स्थिति के लिए इस्तेमाल किया उपकरणों। (एफ) भ्रूण microinjection मोल्ड में हुए थे। स्केल बार = 0.5 मिमी। (G) सुई के पोजिशनिंग इंजेक्शन के लिए भ्रूण के बगल में। स्केल बार = 0.15 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. zebrafish में प्रयोगात्मक समय nephrotoxin प्रायोगिक समय और बाद इंजेक्शन शोफ परख। (ए) उदाहरण के लिए, यहाँ एक जेंटामाइसिन अध्ययन करने के लिए आवेदन किया। भ्रूण dechorionated और 24 घंटे बाद निषेचन (HPF) पर पीटीयू के समाधान के साथ इलाज किया गया। प्रत्येक दिन, पीटीयू समाधान निथर और ताजा मीडिया के साथ बदल दिया गया था के रूप में smalle ने संकेतहरी तीर आर। 72 HPF पर, भ्रूण anesthetized थे, एक इंजेक्शन मोल्ड करने के लिए स्थानांतरित कर दिया और उसके बाद इस प्रकार के रूप में व्यवहार किया: नकली इंजेक्शन या इंजेक्शन या तो खारा (वाहन नियंत्रण) या जेंटामाइसिन। ताजा मीडिया में भ्रूण को पुनर्जीवित करने के बाद, भ्रूण विश्लेषण और छवि अधिग्रहण के लिए 1 और 2 दिनों के बाद इंजेक्शन (96 और 120 HPF, क्रमशः) पर मनाया गया। (बी) के शीर्ष पर: uninjected zebrafish भ्रूण। मध्य: भ्रूण खारा के साथ 72 HPF पर इंजेक्शन। नीचे: भ्रूण 2.5 मिलीग्राम / एमएल जेंटामाइसिन के साथ इंजेक्शन। स्केल बार = 0.5 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

चिकित्सीय एजेंटों की एक विविध संख्या अकी 29 के साथ संबद्ध किया गया है। ऐसे अमिनोग्लाईकोसाइड जेंटामाइसिन 30 और व्यापक रूप से इस्तेमाल कीमोथेराप्युटिक सिस्पैटिन 31,32 के रूप में कई अलग-अलग यौगिकों, द्वारा प्रेरित क्षति को समझने में महत्वपूर्ण अनुसंधान अग्रिम दिया गया है। कुछ रोग इन शर्तों में शामिल परिवर्तन, हालांकि, चल रहे अध्ययन का विषय बने हुए हैं। एक आकस्मिक चुनौती समझ कैसे कई दवाओं पर प्रतिकूल ऐसे बुजुर्ग 29 क्रिटिकल केयर सेटिंग्स में उन लोगों और के रूप में, मरीजों को प्रभावित विशेष रूप से उच्च जोखिम आबादी में उन लोगों बनी हुई है। इस प्रकार, मॉडल है कि दवा प्रेरित अकी के प्रभाव के बारे में आगे सेलुलर आधारित अध्ययन सक्षम इस हालत का पता लगाने में सुधार और गतिशील दवा बातचीत की प्रशंसा करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका की सेवा।

माउस और चूहे की तरह स्तनधारी मॉडलों के साथ काम के बाद अकी गुर्दे में सेलुलर परिवर्तन की स्थापना का अभिन्न अंग रहा है, बूटी इन पद्धतियों के साथ एक सीमा है कि प्रत्यक्ष, वास्तविक समय अवलोकन वास्तु जटिलता और अंग की आंतरिक स्थिति के कारण सीमित है। सीधे शब्दों में कहें, गुर्दे प्रत्यक्ष अवलोकन, जो जरूरी है कि व्यक्ति गुर्दे का विश्लेषण करने के लिए बलिदान किया जा के लिए उपलब्ध नहीं है। इन सीमाओं zebrafish भ्रूण है, जो दो नेफ्रॉन मनुष्यों 33 सहित अन्य रीढ़, साथ एक संरक्षित खंड संरचना है की एक सरल गुर्दे फार्म का उपयोग करके मुकाबला किया जा सकता है। Zebrafish विकास पूर्व utero और मामूली रंजकता के साथ होता है, बाहरी संकेतों से 34 गुर्दे जीवोत्पत्ति और प्रतिक्रियाओं की निगरानी के प्रत्यक्ष अवलोकन के लिए अनुमति देता है। इस तरह के जीन अभिव्यक्ति 35-37, के रूप में आणविक विश्लेषण के लिए उपकरण, nephrogenesis 38-40 की सुविधाओं को निर्धारित करने के लिए उच्च संकल्प के साथ उपयोग किया गया है। रासायनिक आनुवंशिकी के माध्यम से छोटे अणुओं के परीक्षण के लिए प्रायोगिक जोड़तोड़ में अच्छी तरह से zebrafish में स्थापित किया है और kidn करने के लिए लागू कर रहे हैंey 41-43। दरअसल, हाल के वर्षों में, zebrafish acetominophen से mycotoxins और aristolochic एसिड 44-48 को लेकर एजेंटों की नेफ्रोटोक्सिटी मॉडल करने के लिए लागू किया गया है। यह नोट करने के लिए वहां के विकास में इस स्तर पर गुर्दे की संरचना के बहुत सादगी की वजह से, यह भी हैं कि zebrafish भ्रूण में अकी मॉडलिंग करने के लिए महत्वपूर्ण सीमाओं महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, zebrafish, गुर्दे ऊतक कि घनी नेफ्रॉन कि एक जटिल स्ट्रोमा है कि कई प्रकार की कोशिकाओं के मध्य होता है से घिरे रहे हैं के साथ पैक किया जाता है के भीतर multifactorial बातचीत को संबोधित करने के लिए अनुकूल नहीं हैं कृंतक या मानव metanephros में मामला है। इस प्रकार, zebrafish सबसे अच्छा अकी दौरान नेफ्रॉन में स्वायत्त सेलुलर और आणविक परिवर्तन visualizing के लिए अनुकूल हैं।

microinjection की विधि यहाँ वर्णित है, जबकि एक तेजी से सीखने की अवस्था के होने, nephrotoxins सहित दोनों विकास और रोग राज्यों के अध्ययन के लिए बहुत उपयोगी है। इस तकनीक ते इस्तेमाल किया जा सकतासेंट दवाओं अकेले या संयोजन में। इसके अतिरिक्त, इंजेक्शन के विकास के समय अंक की एक विस्तृत श्रृंखला के दौरान किया जा सकता है। इसी तरह की एक, zebrafish लार्वा में नसों में microinjections प्रदर्शन के लिए समान रूप से व्यवहार्य तरीका पहले से Cosentino, एट अल। 21 से वर्णित किया गया है। अपनी कार्यप्रणाली में एक महत्वपूर्ण अंतर है, यहाँ वर्णित तरीकों की तुलना में, कि भ्रूण इंजेक्शन जा एक होल्डिंग पिपेट 21 उपयोग स्थिर है है। एक होल्डिंग पिपेट का उपयोग इंजेक्शन मोल्ड करने के लिए एक व्यवहार्य विकल्प है। शोधकर्ताओं ने microinjection को लागू करने के रूप में nephrotoxicant एजेंटों के लिए एक वितरण पद्धति इस विकल्प के बारे में पता होना चाहिए की तलाश है और, तरीकों की तुलना करने के लिए होल्डिंग पिपेट हेरफेर करने के लिए इतनी के रूप में भ्रूण को नुकसान नहीं अभ्यास में शामिल होगी सीखने के रूप में जो व्यक्तिगत रूप से बेहतर है की पहचान करने के लिए चाहते हो सकता है बस के रूप में यह अभ्यास की आवश्यकता है सफलतापूर्वक पैंतरेबाज़ी करने के लिए और microinject embr के लिए एक अवसाद गुहा के साथ एक सरल इंजेक्शन मोल्ड का उपयोग करyos।

जब इस प्रक्रिया का प्रदर्शन, यह उचित आकार के इंजेक्शन सुई तैयार करने के लिए, और चिकनी प्रवेश और भ्रूण संचलन में बाहर निकलने के अनुकूलन करने के लिए सुई की नोक पर कोण में कटौती करने के लिए महत्वपूर्ण है। इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान, यह नमूने के बीच nephrotoxin वितरण की स्थिरता का आकलन करने के लिए इंजेक्शन की मात्रा पर नजर रखने के लिए महत्वपूर्ण है। एक माइक्रोमीटर के साथ इंजेक्शन की मात्रा का आकलन करता है, तो समय-समय पर शोधकर्ता मात्रा में परिवर्तन के बारे में अनिश्चित है, जबकि एक प्रयोग प्रदर्शन किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, तकनीक की प्रकृति के कारण, सुई की नोक आंशिक रूप से या पूरी तरह से सेलुलर मलबे के साथ रोकना कर सकते हैं। इस जटिलता समय समय पर सुई समाशोधन निकली तरल पदार्थ की स्थिरता सुनिश्चित करने के द्वारा counteracted जा सकता है। इसके अतिरिक्त, फिनोल लाल की तरह एक महत्वपूर्ण डाई इंजेक्शन के एक दृश्य मार्कर के रूप में कार्य और तरल पदार्थ प्रसार 49,50 की निगरानी में सहायता करने के लिए मिश्रण में जोड़ा जा सकता है। इसके अलावा, ट्रेसर अणुओं के इंजेक्शन में सहायता कर सकते हैंविशेष सेल आबादी, इंजेक्शन के बाद visualizing। फ्लोरोसेंट dextran moieties, विशेष रूप से 10 केडीए dextran conjugates के सह इंजेक्शन के लिए, अनुप्रयोगों 16,17 के एक नंबर है। इस मामले में, फ्लोरोसेंट तीव्रता के मूल्यांकन के तुरंत प्रक्रिया कम से कम रिसाव के साथ सफल microinjection पुष्टि करने के लिए निम्न प्रदर्शन किया जा सकता है। तीव्रता उचित छवि पर कब्जा फोटोग्राफी और फिर बाद में समय बिंदुओं पर reexamined का उपयोग कर फ्लोरोसेंट तीव्रता में परिवर्तन को मापने के लिए इतनी के रूप में गुर्दे की निकासी 51 को मापने के लिए मापा जा सकता है। इसके अलावा, समीपस्थ छोटी नली में dextran के पुनःअवशोषण इस नेफ्रॉन खंड 16,17 की कार्यक्षमता के लिए एक प्रॉक्सी प्रदान करता है।

साथ में ले ली, वहाँ कई तरीके है कि microinjection zebrafish साथ अकी जांच करने के लिए, इस मॉडल विवो में फार्माकोकाइनेटिक्स को संबोधित करने का अवसर प्रदान करता है, खासकर के रूप में उपयोग किया जा सकता है। इस प्रकार, एक बार में महारत हासिल है, nephrotoxins के microinjectionzebrafish भ्रूण में गुर्दे के अध्ययन के लिए एक उपयोगी प्रतिमान प्रदान करता है।

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Acknowledgments

यह काम एनआईएच अनुदान DP2OD008470 द्वारा समर्थित किया गया था। इसके अतिरिक्त, राम नोट्रे डेम ग्रेजुएट स्कूल विश्वविद्यालय द्वारा उपलब्ध कराई गई निधियों द्वारा समर्थित किया गया था। हम स्टेम सेल और नोट्रे डेम विश्वविद्यालय में पुनर्योजी चिकित्सा के लिए जीव विज्ञान विभाग, zebrafish अनुसंधान के लिए केंद्र, और केंद्र के कर्मचारी धन्यवाद। हम विशेष रूप से गुर्दे की जीव विज्ञान और इस काम पर उनकी मददगार प्रतिक्रिया के बारे में विचार विमर्श उलझाने के लिए प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Chloride American Bioanalytical AB01915
Potassium Chloride American Bioanalytical AB01652
Calcium Chloride American Bioanalytical AB00366
N-Phenylthiourea (PTU) Aldrich Chemistry P7629
Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine) Fluka Analytical A5040
Borosilicate glass Sutter Instruments Co. BF100-50-10
Flaming/Brown Micropipette puller Sutter Instruments Co. Mo. P097
UltraPure Agarose Invitrogen 15510-027
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M7506
Methylene Blue Sigma-Aldrich M9140
Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning:
60 mm x 15 mm VWR 25373-085
100 mm x 15 mm VWR 25373-100
 (microinjection tray) 150 mm x 15 mm VWR 25373-187
Low Temperature Incubator Fischer Scientific 11 690 516DQ
Micro Dissecting Tweezer Roboz Surgical Instruments Co. RS-5010
Micrometer Ted Pella, Inc. 2280-24

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References

  1. Basile, D. P., Anderson, M. D., Sutton, T. A. Pathophysiology of acute kidney injury. Compr. Physiol. 2, 1303-1353 (2012).
  2. Ostermann, M. Diagnosis of acute kidney injury: kidney disease improving global outcomes criteria and beyond. Curr. Opin. Crit. Care. 20, 581-587 (2014).
  3. Fluck, R. J. Acute kidney: improving the pathway of care for patients and across healthcare. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 24, 511-516 (2015).
  4. Silver, S. A., Cardinal, H., Colwell, K., Burger, D., Dickhout, J. G. Acute kidney injury: preclinical innovations, challenges, and opportunities for translation. Can. J Kidney Health Dis. 2, 30 (2015).
  5. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. Renal stem cells: fact or science fiction? Biochem. J. 444, 153-168 (2012).
  6. Li, Y., Wingert, R. A. Regenerative medicine for the kidney: stem cell prospects and challenges. Clin. Transl. Med. 2, 11 (2013).
  7. Romagani, P., Lasagni, L., Remuzzi, G. Renal progenitors: an evolutionary conserved strategy for kidney regeneration. Nat. Rev. Nephrol. 9, 137-146 (2013).
  8. Kline, J., Rachoin, J. S. Acute kidney injury and chronic kidney disease: it's a two-way street. Ren. Fail. 35, 452-455 (2013).
  9. Chawla, L. S., Kimmel, P. L. Acute kidney injury and chronic kidney disease: an integrated clinical syndrome. Kidney Int. 82, 516-524 (2012).
  10. Sanz, A. B., Sanchez-Niño, M. D., Martìn-Cleary, C., Ortiz, A., Ramos, A. M. Progress in the development of animal models of acute kidney injury and its impact on drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 8, 879-895 (2013).
  11. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Transl Res. 163, 109-122 (2014).
  12. McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish renal pathology: emerging models of acute kidney injury. Curr. Pathobiol. Rep. 3, 171-181 (2015).
  13. Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
  14. Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73, 1120-1127 (2008).
  15. Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
  16. McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. J. Vis. Exp. (90), e51644 (2014).
  17. Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J. Vis. Exp. (54), e2845 (2011).
  18. Palmyre, A., et al. Collective epithelial migration drives kidney repair after acute injury. PLoS One. 9, e101304 (2014).
  19. Fogelgren, B., et al. Exocyst Sec10 protects renal tubule cells from injury by EGFR/MAPK activation and effects on endocytosis. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 307, F1334-F1341 (2014).
  20. Hentschel, D. M., Park, K. M., Cilenti, L., Zervox, A. S., Drummond, I. A., Bonventre, J. V. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 288, F923-F929 (2005).
  21. Cosentino, C. C., Roman, B. L., Drummond, I. A., Hukriede, N. A. Intravenous microinjections of zebrafish larvae to study acute kidney injury. J. Vis. Exp. (42), e2079 (2010).
  22. Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
  23. Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-101 (2011).
  24. McCampbell, K. M., Springer, K. N., Wingert, R. A. Atlas of cellular dynamics during zebrafish adult kidney regeneration. Stem Cell Int. , 547636 (2015).
  25. Sharma, P., Sharma, S., Patial, V., Singh, D., Padwad, Y. S. Zebrafish (Danio rerio): a potential model for nephroprotective drug screening. Clinical Queries: Nephrol. 3, 97-105 (2014).
  26. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 559-585 (2013).
  27. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  28. Hanke, N., et al. 'Zebrafishing' for novel genes relevant to the glomerular filtration barrier. Biomed. Res. Int. 2013, 658270 (2013).
  29. Kane-Gill, S. L., Goldstein, S. L. Drug-induced acute kidney injury: a focus on risk assessment for prevention. Crit. Care Clin. 31, 675-684 (2015).
  30. Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view. Kidney Int. 79, 33-45 (2010).
  31. Ozkok, A., Edelstein, C. L. Pathophysiology of cisplatin-induced acute kidney injury. Biomed. Res. Int. 2014, 967826 (2014).
  32. Perazella, M. A., Moeckel, G. W. Nephrotoxicity from chemotherapeutic agents: clinical manifestations, pathobiology, and prevention/therapy. Semin. Nephrol. 30, 570-581 (2010).
  33. Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Recent advances in elucidating the genetic mechanisms of nephrogenesis using zebrafish. Cells. 4, 218-233 (2015).
  34. Pickart, M. A., Klee, E. W. Zebrafish approaches enhance the translational research tackle box. Transl. Res. 163, 65-78 (2014).
  35. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. J. Vis. Exp. (89), e51604 (2014).
  36. Galloway, J. L., Wingert, R. A., Thisse, C., Thisse, B., Zon, L. I. Combinatorial regulation of novel erythroid gene expression in zebrafish. Exp. Hematol. 36, 424-432 (2008).
  37. McKee, R., Gerlach, G. F., Jou, J., Cheng, C. N., Wingert, R. A. Temporal and spatial expression of tight junction genes during zebrafish pronephros development. Gene Expr. Patterns. 16, 104-113 (2014).
  38. Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev. Biol. 386, 111-122 (2014).
  39. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Zebrafish pronephros tubulogenesis and epithelial identity maintenance are reliant on the polarity proteins Prkc iota and zeta. Dev. Biol. 396, 183-200 (2014).
  40. Cheng, C. N., Wingert, R. A. Nephron proximal tubule patterning and corpuscles of Stannius formation are regulated by the sim1a transcription factor and retinoic acid in the zebrafish. Dev. Biol. 399, 100-116 (2015).
  41. Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): A vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Res. C Embryo Today. 93, 268-280 (2011).
  42. Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Congenital and acute kidney disease: translational research insights from zebrafish chemical genetics. Gen. Med. 1, 112 (2013).
  43. Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (93), e52063 (2014).
  44. Peng, H. C., Wang, Y. H., Wen, C. C., Wang, W. H., Cheng, C. C., Chen, Y. H. Nephrotoxicity assessments of acetaminophen during zebrafish embryogenesis. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 151, 480-586 (2010).
  45. Wu, T. S., Yang, J. J., Yu, F. Y., Liu, B. H. Evaluation of nephrotoxic effects of mycotoxins, citrinin and patulin, on zebrafish (Danio rerio) embryos. Food Chem. Toxicol. 50, 4398-4404 (2012).
  46. Ding, Y. J., Chen, Y. H. Developmental nephrotoxicity of aristolochic acid in a zebrafish model. Toxicol. Appl. Pharmacol. 261, 59-65 (2012).
  47. Zennaro, C., et al. Podocyte developmental defects caused by adriamycin in zebrafish embryos and larvae: a novel model of glomerular damage. PLoS One. 9, e98131 (2014).
  48. Ding, Y. J., Sun, C. Y., Wen, C. C., Chen, Y. H. Nephroprotective role of resveratrol and ursolic acid in aristolochic acid intoxicated zebrafish. Toxins. 7, 97-109 (2015).
  49. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (27), e1115 (2009).
  50. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
  51. Christou-Savina, S., Beales, P. L., Osborn, D. P. Evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay. J. Vis. Exp. (96), e52540 (2015).

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चिकित्सा अंक 113 zebrafish गुर्दे nephrotoxin गुर्दे की निकासी तीव्र गुर्दे चोट microinjection जेंटामाइसिन
Zebrafish में Nephrotoxin Microinjection गुर्दे की गंभीर चोट मॉडल के लिए
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McKee, R. A., Wingert, R. A.… More

McKee, R. A., Wingert, R. A. Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury. J. Vis. Exp. (113), e54241, doi:10.3791/54241 (2016).

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