Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Zebra balığı Nephrotoxin Mikroenjeksiyon Akut Böbrek Yaralanması Model

Published: July 17, 2016 doi: 10.3791/54241
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Center for Zebrafish Research, Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Center for Stem Cells and Regenerative Medicine, Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

Summary

kemoterapötik antibiyotik arasında değişen ilaçlar yer alır nephrotoxins, kaynaklanacak böbrek yaralanmaları, kimin patogenezi tam olarak anlaşılamamıştır karmaşık bozuklukları oluşabilir. Bu protokol, zebra balığı böbrek koruyucu önlemlerin tanımlanması için uygulanabilir, bu koşullar, hastalık modelleme için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Abstract

Böbrekler onlar kan filtrelemek kimyasallara maruz zarar yatkındır. Bu böbrek fonksiyonu ve akut böbrek hasarı (ABH) olarak bilinen klinik sendrom gelişiminde hızlı bir düşüş ile ilişkili organ hasarına yol açabilir. Farmakolojik maddeler tek tek uygulandığında bakteriyel enfeksiyondan kanseri kadar sağlık durumları tedavi etmek için kullanılabilir ya da başka ilaçlar ile kombinasyon halinde, AKI başlatabilir. Balığı onlar insanları da kapsayan yüksek omurgalıların ile korunan nefron işlevsel birimler oluşan bir embriyonik böbrek formu olarak yararlı bir hayvan modeli, in vivo olarak böbrek fonksiyonu kimyasal etkilerini incelemek için vardır. Dahası, zebra balığı AKI hücresel ve moleküler yönlerini aydınlatmak ve bu tür nefrokoruyucu moleküllerin kimlik olarak tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için fırsatlar sağlayan genetik ve kimyasal ekranlar, gerçekleştirmek için kullanılabilir. Burada, biz içine nasıl mikroenjeksiyon göstermekzebra balığı embriyo Nephrotoxin çalışmaları için bir paradigma olarak kullanılabilir.

Introduction

AKI yıkıcı sağlık sonuçları 1 yol açabilir böbrek fonksiyonlarının ani bir kayıptır. AKI daha yüksek kritik bakım olgularında% 30-50 oranları ve yaşlı, ve% 50-70 1-3 mortalite oranları ile, bağlı yatan hastalarda yaklaşık% 20 yüksek insidansı dünya çapında önemli bir sağlık sorunudur. Ne yazık ki, AKI prevalansı giderek artmaktadır nedeniyle, antibiyotikler gibi nephrotoxins post-operatif stres, iskemi ve maruz kalma dahil AKI neden olabilir faktörlerin çeşitliliği, kısmen, önümüzdeki on yıl içinde daha da yükselmek tahmin edilmektedir kemoterapötik ilaçlar 4.

AKI yaygın temel fonksiyonel birimler ve kan filtresi ve merkezi toplayıcı kanallarda 1 İdrarı boşaltır parçalı bir tübül oluşmaktadır nefron, ortaya çıkan, böbrek içindeki ani hücresel hasara içerir. Ne zaman nefron önemli bir kısmı vardırAKI sırasında hasar, ani etkiler ölü ve ölmekte olan hücrelerden 1 tıkanması nedeniyle nefron aracılığıyla bir dolaşımdan atık klerensinde kesinti, ve azalan veya yürürlükten kaldırılan sıvı akışını içerir. Zamanla, boru şeklindeki tıkanıklığı kalıcı böbrek fonksiyonlarını 1 azaltır tüm nefron, dejenerasyonu neden olabilir. AKI aşağıdaki böbrekte fizyolojik değişiklikler de kronik yara izi 1 yol açabilir karmaşık inflamatuar olayları içerir.

Bu sonuçların rağmen, nefron tübüler epitel 5,6 tekrar oluşturur AKI sonra rejenerasyon geçmesi için bazı kapasitesine sahiptir. Nefron rejenerasyon artan moleküler anlayış var olsa da, mekanizmalar birçok açıdan zor kalır ve soruşturma 7 devam gerektirecek. AKI kalıcı böbrek hasarı ile sonuçlanan derecesi de bilinmemektedir. Mevcut araştırma böbrek için rejeneratif potansiyeli olduğunu göstermektedirEn yüksek daha belirgin veya tekrarlanan bölüm kronik böbrek hastalığı (KBH) neden olurken, AKI daha az şiddetli Aşağıdaki hallerde ve hayat kurtarıcı nakli ya da diyaliz 8,9 gerektiren son dönem böbrek yetmezliği (SDBY) olarak birikirler. Ayrıca, zaten CKD muzdarip kişilerin AKI 8,9 şiddetli bölüm yakalanma daha yüksek bir risk altındadır. Birlikte ele alındığında, temel ve klinik araştırma, anlama tedavi ve AKI önlemek için hayati önem taşımaktadır devam ettiğini açıktır.

Hayvan modelleri ile Araştırma AKI 10 sırasında meydana gelen yerel ve çevresel değişiklikler ilerlemesini takdir vesile olmuştur. Bu anlayış genişletmek yanı sıra yeni tedaviler geliştirmek için, Zebra balığı hayvan modeli yolları 11,12 çeşitli istihdam edilmiştir. Zebra balığı böbrek nefron, embriyo ve yetişkin hem de memelilerde 13-16 ile birlikte koruma yüksek derecede gösterir. ze daha, nefron epitel hasarıbrafish tübüler hücrelerin lokal yıkımı intratubuler çoğalması ve nefron mimarisinin 17-19 yeniden kurulması izler sayede yüksek omurgalıların, süreci benzer. Embriyo, bununla birlikte, sisplatin gibi nephrotoxins kapsamlı tübül hasarı öldürücülüğü 20,21 ile ilişkilidir. Karşılaştırıldığında, zebrabalıkları yetişkinler AKI hayatta ve böbrekte maddi rejeneratif yeteneklerini sergileyecekleri. Örneğin, aminoglikozid antibiyotik gentamisin maruz kaldıktan sonra, Zebra balığı tübül epitel hasarı yeniden ve yeni nefron birimleri de 22-24 büyür. Bu gentamisin kaynaklı AKI çalışmaları farklı nephrotoxins böbrek hasarı anlamak, çok değerli bilgiler sağlamıştır olsa da etkileri ve hasar 25 farklı türde yanıt takdir için kritik kalır.

Zebra balığı embriyo nedeniyle büyüklüğü, şeffaflık ve genetik tractability için, Nephrotoxin çalışmaları için pek çok faydaları vardır <Mikroenjeksiyon 20,21 yöntemi soruşturma molekülü (ler) yönetmek için kullanılır sup> 25. Nefron 24 saat sonra döllenme (hpf) tarafından oluşturulan ve yaklaşık 48 hpf 26,27 kanı filtre başlarlar. Böylece, embriyonik böbrek hızlı oluşumu ve fonksiyonu deneysel analizini kolaylaştırır. Ancak, mikroenjeksiyon işlemi teknik zorlukları vardır ve teknik mastering için bir öğrenme eğrisi olabilir. Bu video makalede, biz microinjections gerçekleştirmek ve başarılı enjeksiyonları oranını arttırmak için sorun giderme ipuçları sağlamak açıklanmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu protokol açıklanan Zebra balığı embriyolarının ile çalışmak için prosedürler Notre Dame Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

Çözümler 1. hazırlanması

  1. Oda sıcaklığında 73.0 g NaCl, 3.15 g KCI, 9.15 g CaCl2 ve damıtılmış suyun 5 L 9.95 g MgSO 4 ve mağaza karıştırılarak E3 embriyo medya 50x stok çözeltisi olun.
  2. zebra balığı embriyoların kültür için, daha sonra her 1, bir mantar öldürücü olarak hareket etmek 1x E3 L ve mağazada için% 0,05'lik metilen mavisi 200 ul, damıtılmış su ile 1 x çalışma çözeltisi E3 embriyo ortam stokunun 50x stok solüsyonu seyreltik RT.
  3. 0.06 mg PTU 50x E3 stokunun 40 ml birleştirilerek% 0.003 1-fenil-2-tioüre (PTU) ile E3 embriyo ortam pigmentasyon bloke çözeltisi olun. Sonra damıtılmış su ile 2 L 'lik bir toplam hacim getirmek.
  4. çözüm haline PTU tozu almak için oda sıcaklığında E3 / PTU O / N karıştırın. Sonra da E3 / PTU saklamakRT.
    E3 / PTU yaklaşık bir haftalık bir raf ömrü vardır ve eski çözümler Zebra balığı larvaları pigmentasyon gelişmesini engelleme az etkili olacaktır: Not.
  5. damıtılmış su, 500 ml Tricaine 1 g eklenerek% 0.2 Tricaine (MS-222) bir anestezik yapmak ve 1 M Tris, pH 9.5 ile pH'ı 7.2'ye ayarlayın.
  6. Tricaine 4 ° C'de% 0.2 1/10 hacim, 1 x E3 (Resim metilen mavi) içeren bir çözelti vererek görüntüleme için% 2 metilselülöz solüsyonu yapmak için hazırlayın.
    Not: metilselüloz çözeltisi yavaşça mikroskopi için canlı embriyolar stabilize etmek için kullanılır kalın açık bir çözümdür. manipülasyonlar yapıldıktan sonra embriyolar hayvan yaralanmasına ve aynı örnekte sonraki aşamalarında mikroskopi etkinleştirmeden metilselüloz eritmek için 1x E3 yıkanabilir.
  7. 4 ° C'ye soğutulduğunda, bir karıştırma plakası üzerinde kuvvetli bir şekilde 1 x E3 / Tricaine solüsyonu ilave edin ve yavaş yavaş metil uygun miktardaselüloz tozu kuvvetlice karıştırın devam ederken. Yavaş yavaş çözünür metilselüloz agregatların oluşumunu önlemek için çözeltiye toz ekleyin.
  8. Tüm toz% 2 metilselülöz / E3 / tricaine çözeltiye karıştırılır sonra, 4 ° C soğuk oda göre O / N bileşik solüsyonu ilave edin.
    Not: Soğuk sıcaklık tamamen toz çözülmesi için en iyisidir. Çözelti sonra bir gece net değilse, ek bir iş günü ve / veya ikinci bir O / N karıştırın.
  9. 30 dakika boyunca ya da 2 saat kadar 4 ° C'de yüksek hızda (12.000 xg) 1.5 ml tüpler ve spin içine% 2 metilselüloz / E3 / tricaine çözeltisi, kısım karışımı hava kabarcıklarını çıkarmak için.
  10. Uzun süreli depolama boyunca 4 ° C 'de% 2 metilselülöz / E3 / Tricaine çözeltisi yerleştirin.
    Not: kullanımdan önce, tam bölünen miktarları, zebra balığı numunelerin çalışma için oda sıcaklığına önceden ısıtılmış olmalıdır.

Araçlar 2. Hazırlık

  1. po için kullanılan bir embriyo manipülatör aracı hazırlayın5 "düz diseksiyon iğnenin ucunda bir jel yükleme ucu takarak, mikroenjeksiyon için embriyolar ırma ve bant veya yapıştırıcı ile sabitleyin.
  2. İlk yangın koyarak bir iğne çektirmenin kullanarak mikroenjeksiyon iğneler hazırlayın aracı haline filament ile 10 cm borosilikat cam cilalı ve kolları sıkarak borosilikat cam sabitleyin.
  3. ince konik iğne moda borosilikat cam çekin. aşağıdaki ayarları kullanın: 540 ısıtmak, 245, hız 200 ve saati 125 çekin.
  4. kil modelleme bir şerit onları askıya bir Petri kabı içine yerleştirin iğneler, iğne uçları korumak ve toz birikmesini önlemek için kapalı çanak tutmak.
  5. microinjections için iğne hazırlanıyor bitirmek için yaklaşık 0.05-0.1 mm çapında bir keskin köşeli enjeksiyon ucu oluşturmak için iğnenin çekti ucunu kesmek için bir jilet veya ince forseps kenar kullanın.
  6. mikroenjeksiyon tepsisini yapmak için, bir 10'da% 1.5 agaroz / E3 çözüm hazırlamak0 ml Erlenmeyer şişe ve daha sonra yaklaşık 10 dakika boyunca oda sıcaklığında soğumasına izin verin bir mikrodalga kaynama E3 ısıtılarak agaroz çözülür.
  7. yaklaşık 0,5 cm derinliğe sahip bir vakıf yapmak için bir Petri kabı içine soğutulmuş agaroz / E3 çözüm dökün. Bu, yaklaşık 0.3 cm derinliğinde ikinci bir tabaka dökmek ve prefabrik embriyo de kalıp yerleştirin ve agaroz oda sıcaklığında katılaşmaya izin katılaşmış zaman.
    Not: hava kabarcıklarının sayısını azaltmak için, bir açı ile agar içine kalıp yerleştirme üst agar / E3 tabaka haline kalıp takarken.
  8. Tüm mikroenjeksiyon tepsi belirledi olduğunda, prefabrik embriyo iyi o zaman 4 ° C'de E3 çözüm ve mağaza ile çanak doldurun, yavaş ve dikkatli bir scoopula kullanarak kalıp kaldırın.

3. Embriyo Hazırlık

  1. çiftleşme odalarına bölücüler koyarak Zebra balığı çiftleşme tankları kurmak ve sistem su ile doldurun.
  2. Bölücü s her iki tarafında bir balık yerleştirinuch her çiftleşme odası bir kadın ve bir erkek balık içerir ve her çiftleşme odasına kapsadığını.
  3. Ertesi sabah, yumurtlama etkinleştirmek için bölücüler çıkarın.
  4. sonra yaklaşık 30 dakika, ve akvaryuma yetişkin döndükten sonra, ince bir tel örgü süzgeç aracıyla çiftleşme tankı suyun geçerek onların embriyolar toplamak balık edin.
  5. Petri kabı üzerine süzgeç ters çevirin ve embriyolar toplamak için E3 ile durulayın.
  6. 28.5 ° CO / N embriyolar inkübe edin.
  7. Embriyolar 24-26 hücre gruplarının aşama 26 ulaştığı zaman, embriyoların, her çanak 50 mg / ml Pronaz 100 ul ilave edilmesi ve yaklaşık 15, oda sıcaklığında bir çanak (23 ° C) inkübe edilerek dechorionate sonra E3 ortam en ve dekante min.
    Not: şekilde tarif ve 28.5 ° C'de O / N kuluçkaya toplanması durumunda embriyolar 24-26 hücre gruplarının aşamaya ulaşmak için bu karnına düştüğü andan itibaren yaklaşık 24-25 saat sürer.
  8. ile çanak doldurunDaha sonra E3 ve embriyoların chorions çıkarmak için hafifçe döndürün.
  9. E3 / pronase Durusu ve taze E3 25 ml çanak durulayın. Tekrarlayın durulama adımı tüm pronase kaldırmak için.
  10. , Pigmentasyon gelişmesini engellemek E3 süzün ve embriyolar 24 saat sonrası gübreleme ulaşmış taze E3 / PTU 25 ml değiştirmek için.
    Not: deneyler birkaç gün yayılan için, temiz çanak tutmak için günde bir kez taze medya ile E3 / PTU çözüm değiştirin.

Nephrotoxin Çözüm 4. Mikroenjeksiyon

  1. Enjeksiyon gününde, uygun araç kontrolü ile birlikte arzu edilen Nephrotoxin solüsyon hazırlanır.
  2. Girdap veya ilaç (lar) sağlamak üzere hafifçe karıştırın su kolonunun tüp ve üst tarafı kontrol / çözelti içinde yer alır.
    Not: Nephrotoxin çözümleri mikroenjeksiyon etkinliğini izlemek ve ayrıca subseq böbrek klerensini değerlendirmek için floresan konjuge dekstran eser miktarda içeren hazırlanabiliruent zaman 20,28 işaret ediyor.
  3. iğne arkasına ince bir jel yükleme ucu geçirilerek Nephrotoxin bir ~ 2-3 ul bir kesilmiş mikroenjeksiyon iğne yükleyin ve çözüm yerçekimi tarafından kesilmiş iğne ucu doldurmak için izin bant parçası ile dikey iğne askıya.
  4. İğne ucu dolduğunda, mikromanipülatör yüklenen iğne sabitleyin.
  5. Bir mikrometre slayt üzerine mineral yağ bir damla koyarak mikroenjeksiyon ses seviyesini test ve damlacık boyutunu değerlendirmek için yağın içine enjekte edilir. 500 ul enjeksiyon hacmi 0.1 mm bir çapa sahiptir.
  6. inkübatör embriyoların çanak çıkarın ve embriyo çanak yaklaşık% 0.2 Tricaine 5 ml ekleyerek uyutmak.
  7. tam anesthetization sağlamak için, yavaşça embriyo manipülatör aracı ucuyla embriyo dokunun. hareket eksikliği yeterli anesthetization gösterir.
  8. Başarılı anesthetization sonra, transf ile enjeksiyon kalıp embriyo transferineer pipet.
  9. gövde depresyon boyunca dinlenir ve kuyruk depresyon dışarı kadar yapışır iyi böyle derin alanda kafa yerleştirerek kalıp farklı bir kuyunun içine her bir embriyo Manevra.
  10. Mikromanipülatör doldurulur iğne takın ve embriyo yanındaki iğne ucu yerleştirin.
  11. Yavaşça ileri joystick'i hareket ettirerek kuyruk kabına iğne takın ve mikroenjeksiyon sunmak için ayak pedalına basın.
    Not: Başarılı enjeksiyon sıvı izleyerek gauged olabilir dolaşıma girebilir. Bundan başka, floresan konjuge dekstran ile nephrotoxicant birlikte enjeksiyon işlemiyle daha sonra başarılı bir enjeksiyon kontrol etmek için araştırmacı sağlar.
  12. Yavaşça embriyo iğne kaldırmak için joystick geri çekin.
  13. enjeksiyonundan sonra, temiz bir çanak embriyo transferine ve Tricaine kaldırmak ve taze E3 / PTU ile yerine durulayın.
  14. eşek istenilen zaman noktasına embriyo inkübeistenildiği gibi deneysel analiz için metil montaj medya, ya da süreç içinde fotoğraf ile belgelenmiştir edilebilir s morfolojisi.
    Not: embriyoların Recovery yaygın böbrek hasarı gösteren ödem, bireylerin yüzdesini belirlemek için değerlendirilmelidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kurmak bir mikroenjeksiyon istasyonu stereomikroskopta, micromanipulator ve basınç regülatörü (Şekil 1A) içerir. Enjeksiyon plaka transillüminasyonu Bu prosedür (Şekil 1B) içinde örnekleri görüntülemek için tercih edilir. enjeksiyon iğnesinin hazırlanması arka yükleme iğne nihayet kesme ile kenar hazırlayarak ardından uygun borosilikat cam, çekme içerir. Optimal, iğne ucu kesme işlemi sırasında (Şekil 1C) gibi ince forseps olarak keskin kesme aleti, kenarına açı ile yapılan bir kesim, künt yerine eğimli olduğu (Şekil 1D). Bu eğimli kenar önemlidir ve büyük ölçüde yavaşça zebrafish içine iğneyi yeteneğini etkiler.

Enjeksiyon gününde, embriyolar sağlam ama esnek embriyo kullanılarak konumlandırıldımanipülasyon araçları (Şekil 1E). Enjeksiyon için, embriyolar gövde daha sonra, enjeksiyon aşamasında (Şekil 1F) için bir kaldıraç sağlamak için püskürtme tepsinin kenarı boyunca dinlenmiş şekilde, manevra edildi. Enjekte ederken, bir iğne yerleştirilmesi için damar hedef görselleştirmek ve daha sonra enjekte malzeme dolaşımı (Şekil 1G) girmek gözlemlemek embriyonik gövde üzerinde görüş uçağı odaklanmalıdır.

Zebra balığı embriyo asetat mikroenjeksiyon prosedürünü kolaylaştırır ve ayrıca tipik deney hızı zaman süresini (Şekil 2A) ne pigmentasyon gelişmesini azaltmak için 24 hpf PTU kimyasal muamele ile geliştirilebilir. Burada, embriyo örnekleri edildi, daha sonra 72 HPF aşamasında gelişmeye bırakılmıştır ya sahte tuzlu su taşıyıcı ile mikroenjeksiyon ya da 2.5 mg / ml gentamisin (Şekil 2A) ile birlikte mikro-enjekte enjekte edilir.Daha sonraki canlı gözlem stereomikroskop (Şekil 2B) ile transillüminasyon aydınlatma kullanarak, enjeksiyon sonrası bir ve iki gün sonra gerçekleştirildi. Sahte veya salin enjekte edilen embriyolar ile karşılaştırıldığında, sadece gentamisin enjekte bireyler daha önce yayınlanan gözlemler 11,20,21 uygun normal böbrek işlevinin bir ortadan kaldırma göstermektedir, bu durumda, perikardiyal ödem, ödem (Şekil 2B) göstermektedir.

Şekil 1
Şekil 1. Mikroenjeksiyon cihaz ve aletler. Stereomikroskop (solda) ile kurmak (A) Enjeksiyon istasyonu, mikromanipülatör ve iğne tutucu (orta) ve basınç regülatörü (sağda). Enjeksiyon plakasının (B) transillüminasyon. Sol (C): Künt kesim iğne. Sağ: Eğimli kesim iğne. (D) Fine forseps iğne uçları kesmek için kullanılır. (E) yerleştirin ve enjeksiyon kalıp içine örnekleri konumlandırmak için kullanılan Manipülasyon araçları. (F) Embriyolar mikroenjeksiyon kalıp içinde dizilmiş. Ölçek çubuğu = 0,5 mm. Enjeksiyon için embriyo iğne (G) konumlandırma aşağıdaki. Ölçek çubuğu = 0.15 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Zebra balığı deneysel zaman çizelgesi Nephrotoxin Şekil 2. Deneysel zaman çizelgesi ve sonrası enjeksiyon ödem deneyi. (A) Örnek, burada bir gentamisin çalışmaya başvurdu. Embriyolar dechorionated ve 24 saat sonra döllenme (HPF) de PTU çözeltisi ile muamele edildi. Smalle ile gösterildiği gibi, her gün PTU çözeltisi boşaltıldı ve taze ortam ile değiştirilmiştiryeşil okları r. Sahte enjekte edilmesi veya iki tuzlu su (taşıt kontrol) ya da gentamisin enjekte: 72 HPF, embriyolar bir enjeksiyon kalıbına aktarılır ve daha sonra aşağıdaki şekilde işlendi, anestezi uygulandı. taze ortam embriyolar canlandırılması sonra, embriyolar analizi ve görüntü elde etmek için 1 ve 2 gün sonra, enjeksiyon (sırasıyla 96 ve 120 HPF) gözlendi. (B) Üst: uninjected Zebra balığı embriyosu. Orta: serum fizyolojik ile 72 hpf enjekte embriyo. Alt: Embriyo 2.5 mg / ml gentamisin ile enjekte edilir. Ölçek çubuğu = 0.5 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Terapötik maddelerin bir çok çeşitli sayıda AKI 29 ile ilişkilendirilmiştir. Böyle aminoglikozid gentamisin 30 ve yaygın olarak kullanılan kemoterapötik sisplatin 31,32 olarak birçok bireysel bileşikler tarafından uyarılan hasar anlaşılmasında önemli araştırma gelişmeler olmuştur. Bu koşullar dahil patolojik değişiklikler, devam eden çalışmanın konusu olmaya devam etmektedir. Bir acil zorluk birden fazla ilaç olumsuz gibi kritik bakım ortamlarında olanlar ve yaşlılar 29 gibi yüksek riskli toplumlarda özellikle bu hastaların nasıl etkilediğini anlamak kalır. Böylece, ilaca bağlı AKI etkileri hakkında daha fazla hücresel dayalı çalışmaları sağlayacak modeller bu durumun tespiti iyileştirilmesi ve dinamik ilaç etkileşimleri takdir önemli bir rol vermektedir.

Fare ve sıçan gibi memeli modelleri ile çalışmak AKI aşağıdaki böbrekte hücresel değişiklikler kurmak için ayrılmaz olmuştur bubu sistemler ile T bir sınırlama doğrudan, gerçek zamanlı gözlem, mimari karmaşıklığı ve organın iç konuma sınırlı olmasıdır. Basitçe söylemek gerekirse, böbrek bireylerin böbrek analiz etmek feda edilmesini gerektiren doğrudan gözlem için mevcut değildir. Bu sınırlamalar, insanlarda 33 dahil olmak üzere diğer omurgalılar, bir korunmuş bölüm yapıya sahip iki nefron basit bir böbrek oluşturan zebrafish embriyolar kullanılarak karşılık olabilir. Zebra balığı gelişme dış işaretlere 34 renal organogenez ve yanıtların izlenmesi doğrudan gözlem için izin eski utero ve küçük pigmentasyon ile oluşur. Gen ifadesi 35-37 gibi moleküler analiz araçları, nefrogenezisi 38-40 özelliklerini belirlemek amacıyla yüksek çözünürlüklü faydalanılmıştır. Kimyasal genetik yoluyla küçük moleküllerin test için deneysel manipülasyonlar iyi zebrabalıkları yılında kurulan ve kidn uygulanabileney 41-43. Gerçekten de, son yıllarda, zebra balığı asetominofen mikotoksinlerden ve aristolochic asit 44-48 arasında değişen maddelerin nefrotoksisite model uygulanmıştır. Zebrafish embriyo AKI modelleme açısından önemli kısıtlamalar nedeniyle gelişme bu aşamada böbrek yapısının çok basitliği, ayrıca olduğuna dikkat etmek önemlidir. kemirgen veya insan metanephros olduğu gibi, örneğin, Zebra balığı, yoğun birden interstisyel hücre tiplerini içeren karmaşık bir stroma ile çevrilidir nefron ile doludur böbrek dokusu içinde çok faktörlü etkileşimleri ele alınmasına uygun değildir. Böylece, zebra balığı en iyi AKI sırasında nefron özerk hücresel ve moleküler değişiklikler görselleştirmek için uygundur.

mikroenjeksiyon gibi bir yöntem, bir öğrenme eğrisi yaparken, nephrotoxins içeren her iki gelişim ve hastalık durumlarını incelemek için yararlı olan, burada açıklanan. Bu teknik te kullanılabilirst ilaçlar tek başına ya da kombinasyon halinde kullanılabilir. Buna ek olarak, enjeksiyonlar gelişimi zaman noktalarında geniş bir aralığında gerçekleştirilebilir. Zebra balığı larvası intravenöz microinjections gerçekleştirmek için benzer bir eşit olarak geçerli yöntemin daha önce ve ark., 21 Cosentino tarafından tarif edilmiştir. Metodoloji biri anlamlı fark, burada tarif edilen yöntemlere göre, embriyo, bir tutma pipeti 21 kullanılarak immobilize edilir enjekte edilecek olmasıdır. Bir holding pipet kullanılması enjeksiyon kalıp bir alternatiftir. nephrotoxicant ajanlar için bir dağıtım yöntemi, bu alternatifin farkında olması gerektiği gibi mikroenjeksiyon uygulamaya koymaya ve uygulama içerecektir embriyo zarar vermemek için tutma pipet işlemek için öğrenme gibi, şahsen tercih edilir olduğunu belirlemek için yöntemler karşılaştırmak isteyebilirsiniz Araştırmacılar o pratik gerektirir gibi başarılı manevra ve Microinject EMBR bir depresyon boşluğuna ile basit bir enjeksiyon kalıp kullanarakYÖS.

Bu yordamı gerçekleştirirken, uygun büyüklükte enjeksiyon iğneleri hazırlamak ve embriyonik dolaşıma pürüzsüz giriş ve çıkış optimize etmek için iğne ucu açısını kesmek için kritik öneme sahiptir. enjeksiyon işlemi sırasında, örnekler arasında Nephrotoxin teslimat tutarlılığını değerlendirmek için enjeksiyon hacmi izlemek için çok önemlidir. Bir mikrometre ile enjeksiyon hacmi periyodik olarak değerlendirilmesi bir deney yaparken araştırmacı hacmindeki değişiklikler hakkında belirsiz ise yapılabilir. Örneğin, nedeniyle tekniğin doğası gereği, iğne ucu kısmen veya tamamen hücresel enkaz ile yapışmasına neden olabilir. Bu komplikasyon püskürtülen sıvı tutarlılığı sağlamak için periyodik olarak iğne temizleyerek engellenebilir. Buna ek olarak, fenol kırmızısı gibi vital boya enjeksiyonu görsel bir işaret olarak görev ve sıvı dağılımı 49,50 denetlenmesine yardımcı olmak için karışıma ilave edilebilir. Bundan başka, izleyici moleküller enjeksiyonlar yardımcı olabilirenjeksiyonu takiben spesifik hücre popülasyonu, görselleştirme. Floresan dekstran parçalarının, özellikle de 10 kDa dekstran konjugatları eş enjeksiyon için, uygulama 16,17 bir dizi vardır. Bu durumda, floresan yoğunluğu değerlendirilmesi az sızıntı başarılı mikroenjeksiyon teyit etmek için prosedür takip hemen gerçekleştirilebilir. Yoğunluk renal klerensi 51 ölçmek üzere floresan yoğunluğu değişimi ölçmek için sonraki zaman noktalarında yeniden gözden sonra uygun görüntü yakalama fotoğraf ve kullanılarak ölçülebilir. Ayrıca, proksimal tübül içinde dekstran reabsorbsiyonu bu nefron segmentinde 16,17 işlevlerinin bir vekil sağlar.

Birlikte ele alındığında, mikroenjeksiyon bu model in vivo farmakokinetik gidermek için fırsat sağlar özellikle de Zebra balığı ile AKI araştırmak için kullanılabilir birçok yolu vardır. Bu durumda, bir kez nephrotoxins mikroenjeksiyon hakimZebra balığı embriyo içine böbrek çalışmalar için kullanışlı bir paradigma sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Bu çalışma NIH hibe DP2OD008470 tarafından kısmen desteklenmiştir. Ayrıca, RAM Notre Dame Graduate School Üniversitesi tarafından sağlanan fonlarla kısmen desteklenmiştir. Biz Kök Hücre ve Notre Dame Üniversitesi Rejeneratif Tıp Biyolojik Bilimler Bölümü, Zebra balığı Araştırma Merkezi ve Merkezi kadroya teşekkür ederim. Biz özellikle böbrek biyoloji ve bu işin kendi yararlı geribildirim hakkında tartışmalar takılmak için laboratuar üyelerine teşekkür ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Chloride American Bioanalytical AB01915
Potassium Chloride American Bioanalytical AB01652
Calcium Chloride American Bioanalytical AB00366
N-Phenylthiourea (PTU) Aldrich Chemistry P7629
Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine) Fluka Analytical A5040
Borosilicate glass Sutter Instruments Co. BF100-50-10
Flaming/Brown Micropipette puller Sutter Instruments Co. Mo. P097
UltraPure Agarose Invitrogen 15510-027
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M7506
Methylene Blue Sigma-Aldrich M9140
Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning:
60 mm x 15 mm VWR 25373-085
100 mm x 15 mm VWR 25373-100
 (microinjection tray) 150 mm x 15 mm VWR 25373-187
Low Temperature Incubator Fischer Scientific 11 690 516DQ
Micro Dissecting Tweezer Roboz Surgical Instruments Co. RS-5010
Micrometer Ted Pella, Inc. 2280-24

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Basile, D. P., Anderson, M. D., Sutton, T. A. Pathophysiology of acute kidney injury. Compr. Physiol. 2, 1303-1353 (2012).
  2. Ostermann, M. Diagnosis of acute kidney injury: kidney disease improving global outcomes criteria and beyond. Curr. Opin. Crit. Care. 20, 581-587 (2014).
  3. Fluck, R. J. Acute kidney: improving the pathway of care for patients and across healthcare. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 24, 511-516 (2015).
  4. Silver, S. A., Cardinal, H., Colwell, K., Burger, D., Dickhout, J. G. Acute kidney injury: preclinical innovations, challenges, and opportunities for translation. Can. J Kidney Health Dis. 2, 30 (2015).
  5. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. Renal stem cells: fact or science fiction? Biochem. J. 444, 153-168 (2012).
  6. Li, Y., Wingert, R. A. Regenerative medicine for the kidney: stem cell prospects and challenges. Clin. Transl. Med. 2, 11 (2013).
  7. Romagani, P., Lasagni, L., Remuzzi, G. Renal progenitors: an evolutionary conserved strategy for kidney regeneration. Nat. Rev. Nephrol. 9, 137-146 (2013).
  8. Kline, J., Rachoin, J. S. Acute kidney injury and chronic kidney disease: it's a two-way street. Ren. Fail. 35, 452-455 (2013).
  9. Chawla, L. S., Kimmel, P. L. Acute kidney injury and chronic kidney disease: an integrated clinical syndrome. Kidney Int. 82, 516-524 (2012).
  10. Sanz, A. B., Sanchez-Niño, M. D., Martìn-Cleary, C., Ortiz, A., Ramos, A. M. Progress in the development of animal models of acute kidney injury and its impact on drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 8, 879-895 (2013).
  11. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Transl Res. 163, 109-122 (2014).
  12. McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish renal pathology: emerging models of acute kidney injury. Curr. Pathobiol. Rep. 3, 171-181 (2015).
  13. Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
  14. Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73, 1120-1127 (2008).
  15. Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
  16. McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. J. Vis. Exp. (90), e51644 (2014).
  17. Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J. Vis. Exp. (54), e2845 (2011).
  18. Palmyre, A., et al. Collective epithelial migration drives kidney repair after acute injury. PLoS One. 9, e101304 (2014).
  19. Fogelgren, B., et al. Exocyst Sec10 protects renal tubule cells from injury by EGFR/MAPK activation and effects on endocytosis. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 307, F1334-F1341 (2014).
  20. Hentschel, D. M., Park, K. M., Cilenti, L., Zervox, A. S., Drummond, I. A., Bonventre, J. V. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 288, F923-F929 (2005).
  21. Cosentino, C. C., Roman, B. L., Drummond, I. A., Hukriede, N. A. Intravenous microinjections of zebrafish larvae to study acute kidney injury. J. Vis. Exp. (42), e2079 (2010).
  22. Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
  23. Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-101 (2011).
  24. McCampbell, K. M., Springer, K. N., Wingert, R. A. Atlas of cellular dynamics during zebrafish adult kidney regeneration. Stem Cell Int. , 547636 (2015).
  25. Sharma, P., Sharma, S., Patial, V., Singh, D., Padwad, Y. S. Zebrafish (Danio rerio): a potential model for nephroprotective drug screening. Clinical Queries: Nephrol. 3, 97-105 (2014).
  26. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 559-585 (2013).
  27. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  28. Hanke, N., et al. 'Zebrafishing' for novel genes relevant to the glomerular filtration barrier. Biomed. Res. Int. 2013, 658270 (2013).
  29. Kane-Gill, S. L., Goldstein, S. L. Drug-induced acute kidney injury: a focus on risk assessment for prevention. Crit. Care Clin. 31, 675-684 (2015).
  30. Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view. Kidney Int. 79, 33-45 (2010).
  31. Ozkok, A., Edelstein, C. L. Pathophysiology of cisplatin-induced acute kidney injury. Biomed. Res. Int. 2014, 967826 (2014).
  32. Perazella, M. A., Moeckel, G. W. Nephrotoxicity from chemotherapeutic agents: clinical manifestations, pathobiology, and prevention/therapy. Semin. Nephrol. 30, 570-581 (2010).
  33. Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Recent advances in elucidating the genetic mechanisms of nephrogenesis using zebrafish. Cells. 4, 218-233 (2015).
  34. Pickart, M. A., Klee, E. W. Zebrafish approaches enhance the translational research tackle box. Transl. Res. 163, 65-78 (2014).
  35. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. J. Vis. Exp. (89), e51604 (2014).
  36. Galloway, J. L., Wingert, R. A., Thisse, C., Thisse, B., Zon, L. I. Combinatorial regulation of novel erythroid gene expression in zebrafish. Exp. Hematol. 36, 424-432 (2008).
  37. McKee, R., Gerlach, G. F., Jou, J., Cheng, C. N., Wingert, R. A. Temporal and spatial expression of tight junction genes during zebrafish pronephros development. Gene Expr. Patterns. 16, 104-113 (2014).
  38. Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev. Biol. 386, 111-122 (2014).
  39. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Zebrafish pronephros tubulogenesis and epithelial identity maintenance are reliant on the polarity proteins Prkc iota and zeta. Dev. Biol. 396, 183-200 (2014).
  40. Cheng, C. N., Wingert, R. A. Nephron proximal tubule patterning and corpuscles of Stannius formation are regulated by the sim1a transcription factor and retinoic acid in the zebrafish. Dev. Biol. 399, 100-116 (2015).
  41. Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): A vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Res. C Embryo Today. 93, 268-280 (2011).
  42. Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Congenital and acute kidney disease: translational research insights from zebrafish chemical genetics. Gen. Med. 1, 112 (2013).
  43. Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (93), e52063 (2014).
  44. Peng, H. C., Wang, Y. H., Wen, C. C., Wang, W. H., Cheng, C. C., Chen, Y. H. Nephrotoxicity assessments of acetaminophen during zebrafish embryogenesis. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 151, 480-586 (2010).
  45. Wu, T. S., Yang, J. J., Yu, F. Y., Liu, B. H. Evaluation of nephrotoxic effects of mycotoxins, citrinin and patulin, on zebrafish (Danio rerio) embryos. Food Chem. Toxicol. 50, 4398-4404 (2012).
  46. Ding, Y. J., Chen, Y. H. Developmental nephrotoxicity of aristolochic acid in a zebrafish model. Toxicol. Appl. Pharmacol. 261, 59-65 (2012).
  47. Zennaro, C., et al. Podocyte developmental defects caused by adriamycin in zebrafish embryos and larvae: a novel model of glomerular damage. PLoS One. 9, e98131 (2014).
  48. Ding, Y. J., Sun, C. Y., Wen, C. C., Chen, Y. H. Nephroprotective role of resveratrol and ursolic acid in aristolochic acid intoxicated zebrafish. Toxins. 7, 97-109 (2015).
  49. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (27), e1115 (2009).
  50. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
  51. Christou-Savina, S., Beales, P. L., Osborn, D. P. Evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay. J. Vis. Exp. (96), e52540 (2015).

Tags

Tıp Sayı 113 Zebra balığı böbrek Nephrotoxin renal klerens akut böbrek hasarı mikroenjeksiyon gentamisin
Zebra balığı Nephrotoxin Mikroenjeksiyon Akut Böbrek Yaralanması Model
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McKee, R. A., Wingert, R. A.… More

McKee, R. A., Wingert, R. A. Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury. J. Vis. Exp. (113), e54241, doi:10.3791/54241 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter