触媒水泳デバイスの作製と3Dトラッキング

Introduction

彼らは、このような薬物送達のようなエキサイティングな新しい機能を有効にする可能性を秘めているように、これらのデバイスは^、3ラボオンチップトランスポートを重要な研究の関心を集めている、自律的流体環境での運動を生成することが可能な命綱をつけコロイド小規模です^。1,2触媒水泳機器⁴および環境改善^。5つ広く研究されている例は、触媒「ヤヌス」スイマーです^。6これらの粒子は、（ヤヌスは2直面ローマの神である）は、2つの別個の辺、または面を有するから自分の名前を取得します。他の不活性であり、一方の側には、触媒活性および分解反応を行うことができます。適切な溶解燃料分子の存在下では、得られた非対称の化学反応は、自己diffusiophoresis /電気泳動を介して運動を生成することができるコロイドの周りに勾配を生成する^。7

これらの急速に移動する物体のモーションを特徴づけることは茶ですこれまでのllenging、多くの実験観察は、2Dに限られていました。しかし、最終的なアプリケーションが3Dでバルク・ソリューション全体を移動するための触媒水泳デバイスの能力を悪用する可能性があります^。8この問題に対処するため、ここでは、決定すべき水泳デバイスの正確な3D軌道を可能にするプロトコルを記述します。この方法は、固定焦点の対物レンズ^、9で観察された焦点蛍光コロイドのうちによって生成される環構造の解釈に基づいており、従来の未修正の顕微鏡を使用して適用することが容易です。明らかに、ここでこの方法を記述することにより、この分野の他の研究者は、このような3D情報にアクセスできることによって利益を得るであろう。これは水泳デバイス用の運動特性に将来の洞察を支援します。このポテンシャルの証拠は、重力によって指示されている水泳機器、最も簡単に3Dトラッキングのアプリケーションを介して可視化することができる^10,11行動の最近の報告書で与えられる^。11

ove_contentは ">また、このペーパーでは、明らかに、これらのデバイスを調査して、既存の研究グループ全体の方法を標準化し、さらに水泳デバイスを作製し、調査に興味を持って新たな研究者を導くためにさらに有益であろう触媒ヤヌス粒子水泳デバイスを製造するための方法を提示します。

Protocol

注意：使用する前に、関連するすべての物質安全データシートを参照してください。このプロトコルで使用される過酸化水素は有害であり、白金に暴露された酸素ガスの発生は、爆発の危険をもたらします。過酸化物溶液（ヒュームフード）と個人用保護具（安全眼鏡、手袋、白衣）を処理しながら、技術管理など、このプロトコル中にすべての適切な安全管理を使用してください。

1.触媒ヤヌス粒子を製造します

1. スライドガラス基板を準備
   1. 脱イオン（DI）水、ガラス除染液とDI水で数分間ずつ、順次洗浄を使用して、未使用の標準的な顕微鏡スライドを清掃してください。エタノールのV混合物：その後70:30 Vで洗浄し、DI水、そして最後にきれいな空気/窒素気流中で乾燥吹きます。
   2. 表面は粒子汚染の証拠からきれい、自由であることを確認するために、顕微鏡下でスライドガラスを調べます。繰り返し手順1.1。1必要に応じて。
2. 堆積のためのコロイド分散液を準備します
   1. ピペットのエタノール990μlのに水性株価蛍光コロイド溶液（10重量％）の10μlの。約0.1％の重量のコロイド懸濁液に到着するために使用される原液の濃度に応じて、必要に応じてボリュームを調整します。
   2. 10秒間ボルテックスミックス。
3. スライドガラス基板上にスピンコートコロイド分散
   1. きれいなガラススライドでスピンコーターを装備。上記調製した希釈コロイド溶液の100μlをピペットチップを埋めます。 30秒間、2000回転サイクルを実行するためのプログラムスピンコーター。スピンコーターを起動し、アップが高速化するときに連続して回転スライドガラスの中央上に調製した溶液をピペット。
   2. 、スピンコーターからスライドガラスを取り外し、光学顕微鏡に戻り、主に非触​​れる別々のコロイドの均一な分散が中央領域Oをカバーしていることを確認スライドガラスF。
4. 真空コロイド装飾されたガラススライド上に白金金属を蒸発させます
   1. 金属蒸発器にコロイドコーティングされたガラススライドを挿入します。コロイド装飾された側が蒸発源に直面していることを確認します。白金金属蒸着源と白金金属の堆積物は15nmをインストールします。
      注意：金属蒸着後、サンプルは、不活性雰囲気下で保存する必要があります。

2.「水泳」ヤヌス粒子

1. 過酸化物を含む溶液にヤヌスコロイドを再懸濁
   1. レンズ組織の1×1cm角にカットし、DI水の10μlの終了を減衰させます。ピンセットで保持し、静かに（このステップは、物理的に基板からコロイドを削除）プラチナコーティングされたコロイド飾らスライドガラスの表面に沿ってこします。
   2. DI水1.5ミリリットルにレンズティッシュを挿入し、手動で密封されたTUで30秒間激しく振りますです。レンズ組織を削除します。
   3. ピペットV H ₂ O ₂のストック溶液/ W1 30mlのの％が充填された新たな容器に溶液を含有するコロイド1mlを、。静かに溶液を混合し、その後さらに25分間攪拌しない潜伏期間に続いて5分間、室温で超音波浴中に置きます。
      注意：このソリューションは、酸素を進化させることができます。密封しないでください。
   4. 残りの水性コロイド溶液の乾燥100μlのヤヌスコロイド構造のSEMの検証を可能にするために、走査型電子顕微鏡（SEM）スタブ上に¹⁴
2. 分析キュベットを準備
   1. 高速の推進を可能にするために、適切な燃料強（10％）に到達するために過酸化物と白金被覆されたコロイドを含むインキュベーション溶液に、DI水の追加の1ミリリットルを追加します。
      注意：インキュベーション前のステージは、白金触媒の表面を洗浄するために高濃度燃料の濃度で行いました。
   2. loの塗りつぶしインキュベーション溶液でワットボリューム長方形の石英ガラスキュベット。緩くプッシュインキャップを取付け。
      注意：爆発の危険 - スクリューキャップを使用しないでください。

3.顕微鏡観察

1. 関心の粒子の位置を確認します
   1. ロード適切な目的（ 例えば、20X）を装備した蛍光顕微鏡へのキュベットおよび適切なフィルタの組み合わせ（励起450〜490 nmの発光> 515 nm）を用いた蛍光体の発光を励起します。
   2. 手動でキュベット内の蛍光コロイドを検索します。
      注：過酸化物濃度を維持しながら、コロイド密度の調整が必要とされ得ます。例えば、コロイド濃度が高い場合には希釈が推奨され、およびフローを生成する多数の酸素の気泡​​が存在しています。約0.003％のコロイド体積濃度は、推奨出発点です。
   3. 3Dトラッキングのための光学設定を最適化：適切な照明条件の下で、私はnはコロイドは鋭い円形のオブジェクトとして表示されます焦点を当てます。推進球を中心明るいリングを変更する独特の大きさと焦点面からコロイドを移動するが、これは、zは3次元トラッキングを可能にするように調整するかを決定するために使用され、観察されます。
2. 録画映像
   1. 興味の粒子が焦点位置」の「粒子と、同心のリングを生成するようにビデオキャプチャを開始する前に、顕微鏡の焦点を合わせます。ビデオキャプチャ時の焦点面を移動しないでください。
   2. 関心の粒子の録画ビデオ。詳細な軌道再構成を可能にするために30ヘルツを超えるフレームレートで30秒の映像期間を使用します。
3. 3D軌道再建
   1. z軸をキャリブレーション
      1. 2％の重量を占めています。 60°Cに相当キュベット内の場所での蛍光ヤヌス粒子の懸濁液を含む水におけるジェランガム溶液それは、上記の使用、および固定静的コロイドを含む硬い透明なゲル状のサンプルを形成するように設定することができます。
      2. 上記選択したのと同じ照明条件を用いて、単一の固定コロイドに焦点を当て、今、この面に対して既知の変位によって発生するZ-フォーカスなどの一連の静止画像を記録します。
      3. 既知の各焦点位置¹¹でリングの半径を決定します。
         注：これは、静止フレーム、ビデオ最も効率的に実行されたすべてのキャリブレーションにバッチ処理として適用することができる画像解析アルゴリズムを使用することです。典型的なアプローチは、オブジェクトの中心のおおよその位置を識別するために画像、閾値を平滑化し、次いで、強度ピークのいずれかの環の面との間の距離を測定することにより、リングの中心の実際のx、y座標の位置を含みます。リングの中心から強度ピークまでの平均半径方向距離は、その後見つけることができます^。11これは明るいリングANの半径の両方を可能にしますD XYは、サブピクセル精度で決定される座標。焦点面からジェランガム固定ヤヌス球30μmのX、Y、Z位置を特定することによって、画像の時系列的に、粒子は、各軸に沿って±25nmの誤差で配置することができます。エラーは、画像のノイズに起因することができます。信号対雑音比、したがっては、位置アルゴリズムの精度は、検出された蛍光光の強度に依存します。ヤヌス球が遠い焦点面から、その強度は、例えば 、それを正確に追跡するために弱くなりすぎている場合、4.8μmの直径のコロイドのために約200ミクロンのz範囲が可能です。代替の非アルゴリズム的方法は、x、yの中心と半径の単純な手動測定を使用することですが、これは精度が低下します。
      4. z位置に半径を関連付けるために較正曲線をプロットし、補間を可能にするために、適切な機能（ 例えば 、三次方程式）に適合します^。11
   <李> 校正のx、yの軸
   1. まだ3.2で選択した同じ顕微鏡条件を用いて空間較正の目盛りの光学顕微鏡像をフレーム記録します。
   2. 空間較正の目盛りの画像から既知の実世界のサイズを持つオブジェクトの「ピクセル」寸法を測定し、X、Y画像平面のためのミクロン変換係数にピクセルを確立するためにこれを使用しています。
   2. 軌道を再構築
      1. 3.3.1.3に記載されているようにx、yを変換するために、Zに半径を変換するために3.3.1.4に見出される機能、および3.3.2.2に見られる較正係数を使用して、ビデオシーケンスの各フレームのx、y座標および半径を決定しますピクセルは、ミクロンに調整します。この手順は、時間の関数としての推進粒子の位置座標に正確なX、Y、Zをもたらすであろう^。11この手順は、アルゴリズムを使用して実装、または手動ですることができます。
      2. 派生Pを決定しますこのような観測された触媒水泳の程度を定量化するための平均速度としてroperties。

Representative Results

図1は、白金を堆積する前に、清浄なスライドガラス上のコロイドの典型的な分散を示している。 図2は、この撮影モードの下でプラチナコーティングされた領域は明るいコントラストを生成し、ヤヌススイマーコーティングされた半分のプラチナのための典型的な後方散乱SEM像を示します。希望の半球状の白金層は明らかである。3ディスプレイジェランガムで固定し、最適な照明条件の下で、一般的な蛍光ヤヌススイマーの外観図 。スイマーが対称リング機能として表示され、それが焦点位置にコロイドに対するz位置を決定するために使用することができるリングの半径である。 図4は、半径方向の輝度強度分布のための代表的な断面を示しています正確に中心とコロイドの見かけの半径を特定するために画像解析アルゴリズムと組み合わせて使用されている。 図5 グラム>は、焦点位置から明らかなコロイドサイズと距離を関連付けるために、固定コロイドサンプルおよび較正された顕微鏡のz並進ステージを使用して得られた検量線が含まれています。この曲線は、z座標に明らかな半径を変換するために使用されるキュービック関数に取り付けられています。最後に、 図6は、蛍光ヤヌス粒子スイマーのための典型的なX、Y、Zの軌跡が表示されます。

図 1.9ミクロン直径のポリスチレン微小球の 1 光学像。ミクロスフェアは、白金堆積前に洗浄したガラススライド上に分散しています。スケールバーは40μmで表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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1.9μmの直径のポリスチレン微小球の 図2 のSEM後方散乱画像。ミクロスフェアは、白金堆積後に示されています。スケールバーは2μmで表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ジェランガムに固定さ4.8μmの直径の蛍光ポリスチレン球の 図3. キャリブレーション画像は20Xの対物レンズ（0.4 NA）を使用して記録した。各画像の下の距離が球体上記の目的の焦点面までの距離を示しています。画像は明るいリングに明るいディスクの変更の0〜200μmでフォーカスの画像からデフォーカスしているように、半径が、そのうちのspher倍率に依存していますEサイズと焦点面からの距離。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4. X、Y、Z粒子追跡手順。自己書かれたアルゴリズムのセットは、第1の垂直と水平線のシリーズを抽出し、平均半ばを見つけることによって、明るいリングの（x、y）の中心の位置を特定するために使用されます明るいピーク（a）の間のポイント。リングの半径は、その後、リング中央（B）から放射状に平均画素グレー値にスプライン嵌合しのピーク強度から算出される。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5ジェランガムで固定球の明るいリング半径を測定したヤヌス球の校正チャートをZ座標（図3と図4を参照してください）。校正チャートは、z方向に測定されたリングの半径を変換するために、当社のアルゴリズムによって使用されています座標。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図6 の典型的な蛍光ヤヌス球水泳装置の軌道。移動水泳装置の画像シーケンスは、33ヘルツのフレームレートで30秒間にわたって記録しました。 （X、Y、Z）の軌跡の座標は明るいリング中心を配置することによって得た（FIグレ4（a））は、シーケンス内の各画像のキャリブレーションチャートを実測リング半径を比較する（ 図4（b）及び5）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

プラチナヤヌス粒子の準備のためのプロトコルには多くの変数が観測された軌道に影響を与えます。 2μmの直径の粒子を用いて説明したようなパラメータは、毎秒10ミクロンのオーダーで推進速度を与えます。より小さな粒子を使用する場合、速度が増加し、粒子径を大きくすると、推進速度を減少する一方¹²蒸発プロトコルの詳細も観察軌道を変化させます。この現在のプロトコルでは、コロイドのまばらな分布は、一緒にスライド方向に垂直金属蒸着で、推奨されます。これらの条件は、ブラウン回転拡散の制限内で線形軌道につながり、図2に示すように対称ヤヌス構造をもたらす^。13逆に、タイトなパックされたコロイドは角度堆積をかすめるの対象となっている場合は、ヤヌスキャップの対称性を破壊することができます紡糸挙動を誘発する^。14 PAここで生産rticlesはすべて3次元で比較的等方性の動きを表示します。厚い白金コーティング、またはより大きな粒子を使用する場合は、上方バイアスまたは重力走性を付与することができる。製造後ヤヌスコロイドの貯蔵の¹¹の詳細も観察水泳速度に影響し得ます。蒸発段階から出る高表面エネルギー清浄な白金表面は、炭化水素から、特にチオール、例えば汚染表面の影響を受けやすい^。15

また、ヤヌスコロイドを再懸濁された溶液の特性は、推進力を観察するために重要です。分解反応生成運動の速度が減少するように、低過酸化物濃度は、より遅い速度をもたらすであろう^。6また、塩の低濃度は、推進速度の劇的な減少をもたらす^。7

ここで生産コロイドの重要な特徴は、それらのねあります3Dトラッキングに適していますutral浮力、。一般的には水泳装置の分野では原因、部分的に緻密な金属から作られているいくつかの顕著な例に、3D効果にはほとんど注意を払っているそれら急速に沈殿物^、16にも起因し、必要な測定を行うことに伴う困難および費用にします。いくつかの確立された3次元追跡方法の明確な欠点は、これらの急速に移動するコロイドのために存在し、例えば、共焦点走査型レーザー顕微鏡軌跡を解決するために、画像の十分な数を記録するための時間分解能が不足していることができます。この文脈において、ここで本発明の方法は、結果的に高いフレームレートを可能にするz座標の推定を可能にするために単一のフレームを必要とする重要な利点を有しています。復興だけではなく、絶対蛍光強度よりも、単一のフレーム内のピンボケコロイドの相対的なコントラストに依存しているz座標としても、それは効果を急冷し、点滅に強いですフォアインチこれらの利点は、3D軌道の再構成が可能である上に、フィールドの減少深さ、及び十分に分離された非重複コロイドの要件を犠牲にして可能です。私たちは、彼らの水泳デバイスが直接的かつ高精度で、この情報にアクセスするためのプロトコルを記述すると、3D行動に興味を持つ他の研究グループを許可することを願っています。 3Dにこれらのデバイスの理解を拡大することは興味深い将来の現象やアプリケーションの重要な範囲を開くことは明らかです。軌道分析のさらなる詳細に興味のある読者は、推進システムとどのように推進速度の正確な定量を確保するために共通の成果物を説明文献17に向けられています。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Evaporator	Moorfield (UK)		Minilab 80 e-beam evaporator
Microscope	Nikon		Eclipse LV100
Fluorescence light source	Nikon		Nikon B2A filter cube
Objective	Nikon		20X, 0.45 NA
Cuvette	Hellma		fused quartz, 40 x 10 x 1 mm
Vortex mixer	IKA		Lab Dancer S2
Spin coater	Laurell Technologies Corp.		Model WS-400BZ-6NPP/Lite
Ultrasonic bath	Eumax		2 liter
Lens tissue	Whatman	2105 841
Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich	31642-1L	30 wt%
Platinum	Sigma-Aldrich	267171	0.25 mm, 99.99%
Colloids	Thermo Scientific		Fluoro-Max PS microspheres, d = 1.9 microns
Glass decontamination solution	Fisher Scientific	D/0025/15	Decon 90
Ethanol	Fisher Scientific	E/0600DF/17	Absolute Ethanol
DI water	Elga		Purelab Option filtration system (15 MW)
Gellan gum	Sigma-Aldrich	P8169-100G	"Phytagel"