Abstract
体外转录测定法已被开发并广泛使用了许多年，以研究参与转录的分子机制。这个过程需要多亚基DNA依赖性RNA聚合酶（RNAP）等一系列的，其作用的基因表达过程中调节RNA聚合酶的活性转录因子。放射性成绩单的测序凝胶电泳用于提供关于如何转录所得，哪些参数可以影响它的详细机理信息。在本文中，我们描述了协议来研究必不可少延伸因子的NusA如何调控转录暂停，以及一个以确定抗菌剂通过抑制RNA聚合酶全酶形成指定转录起始方法。这些方法可用于一个作为平台的额外方法的发展探索转录因子的作用机制仍然不清楚，以及新的抗菌阿根TS靶向转录这是在抗生素研发的未充分利用的药物靶标。
Introduction
转录是在其中RNA是从一个特定的DNA模板合成的过程。在真核细胞中有三个不同的RNAPs：RNA聚合酶我转录rRNA的前体，RNA聚合酶II负责mRNA和某些小核RNA的合成，和5S rRNA基因和tRNA的合成是通过RNA聚合酶III进行的。在细菌中，有负责RNA的所有类的转录只有一个RNAP。有转录三个阶段：起始，延伸和终止。转录是在细胞中最高度调节过程中的一个。 在转录周期各阶段表示基因表达1的调节一个检查点。为起始，RNA聚合酶具有与σ因子相关联，以形成全酶，这是需要以引导酶特定网站的所谓启动子2以形成一个开放的启动子复合物。随后，大套房的转录因子负责监管Ô在延伸和终止阶段˚FRNA聚合酶活性。这里研究的转录因子是高度保守的和必需的蛋白质，的NusA。它参与rRNA的合成3-5中调节转录暂停和终止，以及抗终止。
体外转录测定法已被开发作为有力工具转录6中学习复杂的调节步骤。在一般情况下，DNA的包括一个启动子区的线性片段是必需的作为模板进行转录。 DNA模板通常是通过PCR或通过线性化的质粒产生的。纯化的蛋白质和的NTPs（包括一个放射性标记的NTP为检测的目的），然后加入和产品分析培养所需要的时间以下。使用相应的模板和反应条件，一直在使用这种方法，它使得transcr详细的分子特征研究转录的各个阶段iption在过去的半个世纪7。在与RNA聚合酶的三维结构信息的组合，它也是可能探测由抗生素和抗生素引线转录抑制的分子机制，以及在新的，改进的药物8-10开发使用此信息。
在这项工作中，我们提供的转录分析如何可以被用来确定由转录延伸/终止因子的NusA，以及如何能够确定的一个新的转录起始抑制剂引线的作用机制的调节机制的例子。
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Protocol
注意：实验涉及使用放射性同位素32 p和没有工作应该进行，直到所有适当的安全条件已经具备。一般人员都必须参加安全课程，并接受之前，使用放射性试剂的实验监督的做法。请佩戴个人防护装备进行反应时（热释光剂量计，防护眼镜，手套，放射室实验室外套，全长裤，封闭趾鞋）。
1.试验材料的制备
- 获取所需的蛋白质转录分析。
- 对于这里所描述的实验中，过量产生和纯化大肠杆菌大肠杆菌 RNA聚合酶在实验室中描述11，或获得自商业来源（材料清单）。
注意：两个提供类似的结果。对于天然或亲和标记的RNA聚合酶的纯化的其他方法也可以使用12,13。适马/努沙登加因素可为d获得旁切在以前的工作14,15。
- 对于这里所描述的实验中，过量产生和纯化大肠杆菌大肠杆菌 RNA聚合酶在实验室中描述11，或获得自商业来源（材料清单）。
- 焦碳酸二乙酯的制备（DEPC）处理的水
注意：可替换地，可以从商业来源（材料清单）获得无RNase水。- 加入1ml焦碳酸二乙酯（DEPC），以1升纯化水（0.1％体积/体积）并混合过夜。
- 高压灭菌DEPC水和提示两次。
- DNA模板制备
- 使用质粒纯化试剂盒根据制造商的说明（材料清单）纯化质粒pSG1154 16和/或pIA226 17。
- 以放大决胜转录测定的模板（360 bp的片段包含在P XYL启动子区域），装配在冰上的PCR反应包括25微升2×PCR混合物（材料清单），每个引物2微升（5μM） ：5'-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3'（正向）和5'-CCCATTAACATCACCATC-3'（反向），1微升pSG1154质粒公关eparation（250μM）和20μl纯化水）。
- 或者可以选择，对于单轮转录实验，扩增447 bp的片段从pIA226 17涵盖了λP R启动区。设置用25微升2×PCR混合物，2微升的各引物（5μM）在冰上的PCR反应：5'-GTGCTCATACGTTAAATCT-3'（正向）和5'-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3'（反向），1微升pIA226 17质粒制备（250μM）和20μl纯化水）。
注意：此模板缺乏胞嘧啶，直到+26 NT位置，这是从转录起始位点的26 日核苷酸。因此，在使用该模板将允许启动，启动子间隙和在+26核苷酸失速，以形成一个稳定的转录延伸复合物（EC），当只有ATP，UTP和GTP存在于反应转录。
- 或者可以选择，对于单轮转录实验，扩增447 bp的片段从pIA226 17涵盖了λP R启动区。设置用25微升2×PCR混合物，2微升的各引物（5μM）在冰上的PCR反应：5'-GTGCTCATACGTTAAATCT-3'（正向）和5'-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3'（反向），1微升pIA226 17质粒制备（250μM）和20μl纯化水）。
- 设置了满足以下条件的PCR反应：95℃;℃，30秒，50℃，30秒，72℃30秒，重复30个循环。
- 纯化使用根据一个PCR清理试剂盒（材料清单）制造商的指导产品并在用于转录分析100μl的转录缓冲液洗脱。
- 确定使用fluorospectrometer（材料清单）模板DNA的浓度。
- NTP准备
注意：的NTPs可从不同的商业来源（材料列表）来获得。- 溶解于DEPC处理过的水的NTPs（≥99％纯），以使1M的库存，等分试样1ml溶液进入1.5毫升管（50微升在每个管），并存储在-20℃。
- 为了α-32 p UTP（3000居里/毫摩尔）在实验前32 P具有14.29天的半衰期短。
注意：使用阿尔法 - 标记的UTP避免比较不同长度带的强度。
- RNA梯子准备
- 组装后续在室温下ING反应：0.5微克的RNA模板混合（材料清单），80毫米的HEPES缓冲液pH7.5的12毫氯化镁 ，10毫摩尔NaCl，10毫摩尔DTT，2毫摩尔ATP / CTP / GTP，0.5mM的UTP，2微升α-32 p UTP，0.5微升T7 RNA聚合酶（材料清单），DEPC处理过的水到20微升。
- 允许反应在37℃进行1小时。立即使用或在-80℃保存。
2. RNA测序凝胶的制备
- 凝胶制备
- 清洗从测序凝胶装置（材料清单）用70％的乙醇与纯净水两次板，并用梳子和两个间隔件组装的单元格。
注意：一个盘可以与硅化试剂（材料列表）进行包衣，以促进在步骤4.2凝胶去除。 - 溶解33.6克脲在22ml水和16.4 5倍的Tris /硼酸盐/ EDTA（TBE）缓冲液（54克亚磷酸三（羟甲基）氨基甲烷的溶液27.5克硼酸10毫升1M的乙二胺四乙酸（EDTA），pH为7.4在1L水）用磁力搅拌器。
- 将16毫升40％丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液（19：1）的尿素溶液，并通过0.45μm的过滤器进行过滤。
- 添加514微升10％（重量/体积）新鲜制备的过硫酸铵在水中，随后51.4微升N，N，N'，N'四甲基乙二胺（TEMED），以过滤后的溶液。
- 轻轻颠倒凝胶溶液以避免过度通气和立即顺利注入从底部喷射孔的水平定位预包装测序细胞。注意避免在注射过程中制作气泡。
- 允许1-1.5小时，直到凝胶在转录实验使用前完全设置。当与在测序细胞的顶部水的湿纸巾包装的凝胶可以在室温下贮存两年或三天。
- 清洗从测序凝胶装置（材料清单）用70％的乙醇与纯净水两次板，并用梳子和两个间隔件组装的单元格。
3.转录反应
- 转录延长暂停试验
- 一个转录延伸复合物的形成
- 加入1μlRNAP核心酶（转录缓冲1μM股票）以1.5 ml管。
- 加入1μl纯化的Σ-70因子（σ70;在转录缓冲液为3μM股票）的RNA聚合酶，并在冰上孵育10分钟，以形成RNA聚合酶全酶。
- 添加在转录缓冲液3微升500nM的纯化的模板DNA（来自pIA226 PCR产物λP R启动）到RNAP全酶，并在37ºC孵育5分钟，以形成开放的复杂。
- 制备反应成分的混合物中，用5微升10×转录缓冲液（材料清单另外150毫升管：400毫的Tris-HCl，1.6M的氯化钾，100mM的MgCl 2的，10毫摩尔DTT，50％甘油，pH值7.9中DEPC处理水），2微升250μM每个GTP和UTP，1微升1毫米ATP和1微升α-32 p UTP（3000居里/毫摩尔）的。 DEPC处理水加至41微升。
没有德：RNase抑制剂（材料清单）可以被用于最小化RNase污染。 - 该混合物溶液转移到含有开放的复杂的管，并在37ºC孵育15分钟，以形成转录延伸复杂在+26停止核苷酸。
- 移动至反应至室温（〜21℃）并加入1微升的2.5毫克/毫升利福平至50微克/毫升的最终浓度。
- 加入1微升0.1mM的纯化的NusA到反应混合物中的孵育在室温下5分钟。
- 添加2微升250微米的CTP到反应混合物中，以使50微升的最终体积，并使用定时器测量的反应时间。
- 转移5μl反应溶液加入到2微升的RNA凝胶上样缓冲液（95％甲酰胺，0.05％溴酚蓝和0.05％二甲苯青），在30，60，120，240，480，和1200秒以猝灭反应。
- 处置的放射性废物的续32磷UTP提示和管ainer。
- 一个转录延伸复合物的形成
- 转录起始含量
- 在开放的复杂的形成
- σ70稀释纯化至0.5微米。
- 重复步骤3.1.1.1至3.1.1.3使用0.5微米（而不是3μM）σ70精制后，DNA模板（从pSG1154 PCR产物在P XYL启动子区）。
- 转录起始试验的抑制
- 添加旨在防止RNA聚合酶全酶形成到RNAP核心酶之前加入σ70（步骤3.1.1.1之后）抑制剂，接着步骤3.1.1.2和3.1.1.3检查抑制剂是否能够破坏全酶形成。
- 另外，步骤3.1.1.2后，添加抑制剂来检查它是否能够竞争性抑制σ70结合RNA聚合酶。
- 使用二甲基亚砜，抑制剂的溶剂相同量，而不是抑制剂小号滴答控制的反应。
- 在反应完成
- 溶于水肝素到在-20℃的储备浓度为1mg / ml和库存。
注意：肝素是DNA的竞争者能够螯合尚未形成一个开放的复杂RNA聚合酶。一旦开放的复杂形成，肝素不能进入RNA聚合酶的DNA结合位点，并从预形成的开放的复杂抑制转录。因此，肝素只需要单轮试验;它并不需要用于多轮测定。 - 制备使用5微升的10×转录缓冲液（材料清单），1微升的1毫克/毫升肝素溶液，1微升10毫每个ATP，GTP，和CTP，2.5mM的UTP的，和1μl的α-32的反应混合物P UTP（3000居里/毫摩尔）。 DEPC处理水加至45微升。
- 混合与转录开放的复杂，脉冲自旋反应混合物中并在37℃孵育20分钟。
- 转移反应的10微升这样lution入5微升的RNA凝胶上样缓冲液（95％甲酰胺，0.05％溴酚蓝和0.05％二甲苯青），以淬灭反应。
- 溶于水肝素到在-20℃的储备浓度为1mg / ml和库存。
- 在开放的复杂的形成
4. RNA凝胶的运行与发展
- 运行变性聚丙烯酰胺凝胶
- 运行在50ºC在1×TBE缓冲液中的凝胶和50瓦为约1.5小时，直至凝胶的温度和缓冲液是稳定的，在50ºC。
- 在90ºC30秒热样品并且将它们移动到冰之前装载到凝胶上。
- 负载样品插入凝胶的顶部旁边含有2微升的RNA梯一个车道的孔（1：100稀释）。
- 在50瓦和50ºC在1×TBE缓冲液中运行该凝胶直到溴酚蓝染料到达〜2/3的向下的凝胶。
- 凝胶处理
- 打开缓慢而仔细地上部板从测序细胞中分离出来。采取非常谨慎，以避免破坏凝胶。
- 切chromatograpHY纸（材料清单）从顶部至溴酚蓝染料匹配凝胶尺寸。用一个盖革计数器确认放射性标记的RNA转录物的大致位置。
- 小心盖上滤纸上的凝胶，然后用力按压，直到凝胶粘附在滤纸。切断并丢弃凝胶底部放射性废物的未掺入的NTPs运行到凝胶底部，它可以是非常热。
- 放置在真空干燥机的干燥床的类似大小的一片滤纸，并小心地放置凝胶涂布纸到它与凝胶的一面朝上。
- 覆盖保鲜膜和干燥在60℃下1.5小时的凝胶。
- 用保鲜膜包住凝胶涂覆的滤纸的另一侧，并将其放置于在成像情况下的光激励荧光体板，用适当的曝光时间，这可以从1小时变化到过夜根据反应的效率。
- 图像使用荧光板根据制造商的说明的成像器扫描仪。决定根据软件说明书使用ImageJ软件相对带强度。
- 用一个盖革计数器来检查放射性污染在工作区，擦拭可疑物品和面积与组织和清洗剂和处置的组织中的处置容器。
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Representative Results
转录效率可以通过测量在不同时间点的频段辐射水平来确定。的暂停检测来测试启用暂停，终止的可视化的NusA因子的功能，和径流制品（ 图1A）。在的NusA的N-末端结构域的存在（的NusA NTD;氨基酸残基1-137）时，RNA产物的外观相比缺乏的NusA对照实验显著延迟。的的NusA片段，或改变的一系列氨基酸的丙氨酸的氨基酸残基104-137（螺旋3）缺失（残基K36，K37，R104，Q108，K111，Q112，Q116和R119）导致完全的NusA暂停活性损失。螺旋3的残基R104和K111被证明是对的NusA NTD暂停活动并与R104A和K111A构建体给予类似暂停半衰期值到控制那里的NusA NTD缺席（ 图1B）是必不可少的。它的HOULD指出螺旋3的该缺失或改变这两个氨基酸残基对的NusA结合RNA聚合酶15没有任何影响。结果表明，R104和K111是对的NusA暂停活动的调节所需的关键氨基酸。
同样地， 如图2A所示，剂量-响应曲线表明在体外转录（多轮）的使用不同浓度的一个新发现的细菌转录抑制剂的C5 14的抑制。 C5被认定以下的从项目合理目标与RNA聚合酶的主要结合位点σ70相互作用硅片屏幕称为钳位螺旋区域18。与另外的C5到转录反应，该化合物可以抗衡σ70用于结合RNA聚合酶，从而抑制转录。机械地，除了C5到RNAP随后σ<SUP> 70因子到反应混合物中是转录抑制比形成RNA聚合酶全酶的（ 图2B）后使用的C5实验显著更有效。这些结果表明，σ70不能取代的C5结合于RNA聚合酶，或C 5不能有效地置换在一个单轮法结合到RNA聚合酶σ70。
图 1： 转录突变的NusA NTD的影响 （A）的转录暂停测定而不的NusA，使用的NusA NTD（+的NusA）的NusA NTD与螺旋3删除（Δ螺旋），和的NusA NTD用丙氨酸取代在残基K36，K37 ，R104，Q108，K111，Q112，Q116，R119和（所有丙氨酸）。 P，暂停网站; T，终止位; RO，径流。凝胶上述楔表明采样的时间点（0.5,1，1.5％，2，5和10分钟）15; （B）中的NusA NTD相对于野生型蛋白质突变体的半衰期的暂停活性。 3次实验用SD平均水平。这个数字已经从核酸研究修改。43（5），2829年至2840年（2015年）。 请点击此处查看本图的放大版本。
图 2： 大肠杆菌的转录抑制复合C5（A）抑制曲线大肠杆菌 RNA聚合酶的转录由化合物C5在多轮测定14。转录的抑制百分率相对于对反应中所用的C5浓度的对照（无C5存在）的RNA产物来确定。 （ 二 ）单轮TR复合C5的百分比抑制活性anscription测定与另外的C5之前（络合物+σ70;灰色）和之后（全酶+ -C 5;黑色）全酶形成。这个数字已经从ACS传染修改。 DIS; 2，39-46（2016）。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
在所有生物中，转录是一严格调节的过程。 在体外已经开发转录测定，以用于测试的转录因子，小分子和转录抑制剂的影响提供了平台。在该方法中纸张，被描述为一般细菌转录的测定法。因为它们允许沿时间线中的所有转录产物可视化转录实验与成绩单的测序凝胶电泳结合是机理研究非常重要。其结果是，这种方法是能够识别的在反应条件下小的变化的影响，并露出动作的一个可行的机制。此外，它变得可行关于转录因子与未知作用机制的功能，设计特异性转录测定。
在本文中，我们还描述的方法，以确认RNA聚合酶holoen的抑制剂的作用机制ZYME形成。这里所描述的方法，可以显示每个RNA转录物随时间的变化，并用适当的修改可以使抗菌剂的对转录的各步骤适当的测试。多轮测定可用于作为相对简单的筛选方法，以确定新的转录靶向抑制剂，而单轮法可用于研究抑制剂，如竞争性/非竞争性的机制。需要注意的是小分子的聚集可引起假阳性命中在药物发现过程非竞争性抑制剂和单轮机理研究可以为打击对铅评价一个全面的方法。其结果是，该受控转录过程是能够精确地揭示的抑制剂如何影响转录，它可以与合理化从头药物设计帮助。连同在抑制剂的结合位点用X射线晶体学STU高分辨率信息死亡的，基于结构的合理药物设计将成为药物发现目标转录应用程序非常适合。
虽然高通量结果不能用体外转录测定法来获得，它们是在解剖与转录的控制相关联的确切机制是非常有用的。的组件和测定条件，可以容易地修改为个人需要。各种因素（ 例如 ，的NusA）4，15，小分子（ 例如，ppGpp的）感兴趣20可以被添加到测试在转录调节它们的功能19和/或转录抑制剂（ 如 ，利福平）。 DNA模板应单独设计，具有很强的推动者，暂停序列和终止的精心选择。为了实现高的测定的再现性，蛋白质必须高度纯化并从残余RNase活性自由，和转录缓冲液，DNA模板，并必须于DEPC进行NTP底物储备溶液处理过的水。使用放射性的NTPs的本文所述，但是荧光核苷酸也可以采用21。 DNA模板的质量为转录测定法的成功是至关重要的。启动子/暂停/终止子之间有足够的间隔必须包括，允许各种转录产物进行适当分离，检测。测序凝胶必须正确倾并且必须使用相对新鲜TBE缓冲液电泳实现RNA转录的尽可能高的分辨率。如果转录产物的降解注意到，高品质的RNA酶抑制剂必须在转录反应混合物中引入。管和枪头必须双高压灭菌和手套必须在任何时候都在进行试验时穿，以尽量减少引入RNA酶的。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Obtain the proteins required for transcription assay | |||
| E. coli RNAP | Epicentre | S90250 | |
| Preparation of DEPC-treated water | |||
| diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free water | |||
| Ambion Nuclease-Free Water | ThermoFisher | AM9937 | |
| DNA template preparation | |||
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1330 | |
| ACCUZYME Mix | Bioline | BIO-25028 | |
| PCR primers | |||
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| NanoDrop 3300 fluorospectrometer | Thermo Scientific | ND-3300 | |
| NTP Preparation | |||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| UTP | Sigma-Aldrich | U1006 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G3776 | |
| CTP | Sigma-Aldrich | C9274 | |
| High Purity rNTPs | GE Healthcare | 27-2025-01 | |
| α-32P UTP | PerkinElmer | BLU007C001MC | Radioactive compound |
| RNA ladder preparation | |||
| Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1–1 kb | Millipore | 69003 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| T7 RNAP | Promega | P2075 | |
| Gel preparation | |||
| Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell | Bio-Rad | 165-3804 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U6504 | |
| tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 154563 | |
| boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED | |
| 40% Acrylamide/bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | A9926 | |
| ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Transcription Assay | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | 84020 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Transcription buffer | |||
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Filter paper | |||
| Whatman 3MM Chr Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Radioactive decontaminant | |||
| Decon 90 | decon | decon90 | |
| Gel Treatment | |||
| Typhoon Trio+ imager | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-89 |
References
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