Abstract
In vitro transcriptie assays ontwikkeld en op grote schaal gebruikt voor vele jaren de moleculaire mechanismen van transcriptie bestuderen. Dit proces vereist meerdere subeenheden DNA-afhankelijke RNA polymerase (RNAP) en een aantal transcriptiefactoren die fungeren om de activiteit van RNAP moduleren tijdens genexpressie. Sequencing gelelektroforese radiogelabeld transcripten op gedetailleerde mechanistische informatie over transcriptie verloopt en welke parameters kan beïnvloeden verschaffen. In dit artikel beschrijven we het protocol te onderzoeken hoe de essentiële verlengingsfactor Nuša reguleert transcriptie onderbreken, evenals een methode om een antibacterieel middel gericht transcriptie-initiatie door remming van RNAP holo vorming identificeren. Deze werkwijzen kunnen worden gebruikt als een platform voor de ontwikkeling van additionele benaderingen voor het werkingsmechanisme van de transcriptiefactoren die nog onduidelijk, evenals nieuwe antibacteriële agen staandts richt transcriptie dat is een weinig gebruikte drug target in antibiotische onderzoek en ontwikkeling.
Introduction
Transcriptie is het proces waarbij RNA wordt gesynthetiseerd uit een specifieke DNA-matrijs. In eukaryote cellen zijn er drie verschillende RNAPs: RNAP I transcribeert rRNA precursors, RNAP II verantwoordelijk is voor de synthese van mRNA en bepaalde kleine nucleaire RNA's worden gesynthetiseerd 5S rRNA en tRNA wordt uitgevoerd door RNAP III. In bacteriën, is er slechts één RNAP verantwoordelijk voor de transcriptie van alle klassen van RNA. Er zijn drie fasen van de transcriptie: initiatie, verlenging en beëindiging. Transcriptie is een van de meest gereguleerde processen in de cel. Elke fase in de transcriptie cyclus vertegenwoordigt een controlepost voor de regulering van genexpressie 1. Bij het opstarten, RNAP te associëren met een sigma factor holo vormen, die nodig is om het enzym aan specifieke plaatsen tussen genoemd promoters 2 een open promoter complex. Vervolgens werd een grote suite van transcriptiefactoren verantwoordelijk zijn voor de regulering oactiviteiten f RNAP tijdens de verlenging en beëindiging fasen. De transcriptiefactor hier onderzocht is de sterk geconserveerd en essentiële eiwitten, Nusa. Het is betrokken bij het reguleren van transcriptie pauzeren en terminatie, evenals anti-beëindiging tijdens rRNA synthese 3-5.
In vitro transcriptie assays zijn ontwikkeld als krachtige hulpmiddelen om de complexe regulerende stappen bestuderen bij transcriptie 6. In het algemeen wordt een lineair fragment van DNA omvattende een promotergebied vereist als de matrijs voor transcriptie. De DNA-matrijs wordt doorgaans gegenereerd door PCR of door het lineariseren van een plasmide. Gezuiverde eiwitten en NTP's (waaronder een radioactief gemerkte NTP voor detectie doeleinden) worden dan toegevoegd en product geanalyseerd volgens de vereiste incubatietijd. Met behulp van geschikte templates en reactie-omstandigheden, hebben alle stadia van transcriptie onderzocht met behulp van deze aanpak, die gedetailleerde moleculaire karakterisering van transcr heeft ingeschakeldiption in de afgelopen halve eeuw 7. In combinatie met informatie over de 3-dimensionale structuur van RNAP is het ook mogelijk zijn om het moleculaire mechanisme van transcriptie remming door antibiotica en antibiotica leads sonde, en deze informatie in de ontwikkeling van nieuwe, verbeterde geneesmiddelen 8-10.
In dit werk geven we voorbeelden van hoe transcriptie assays kunnen worden gebruikt voor het regulatiemechanisme van transcriptie elongatie / beëindiging factor Nuša en hoe het werkingsmechanisme van een nieuwe transcriptie-initiatie remmer lood kan worden bepaald.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Let op: Experimenten gepaard met het gebruik van de radioactieve isotoop 32 P en geen werk moet worden verricht voordat alle passende veiligheidsmaatregelen voorwaarden is voldaan. In het algemeen het personeel zijn verplicht om een veiligheids-cursus bij te wonen en te ondergaan onder toezicht praktijk voorafgaand aan experimenten met behulp van radioactieve reagentia. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen (thermoluminescente dosimeter, veiligheidsbril, handschoenen, straling kamer lab jassen, volledige lengte broek, dichte schoenen) bij het uitvoeren van de reactie.
1. Bereiding van proefmaterialen
- Het verkrijgen van de Eiwitten Vereiste voor transcriptie assay.
- Voor het hier beschreven experiment overproduceren en zuiveren E. coli RNAP in het laboratorium zoals beschreven 11, of het verkrijgen van een commerciële bron (Materials List).
Opmerking: Beide soortgelijke resultaten. Andere werkwijzen voor het zuiveren van natieve of affiniteit gelabelde RNAP kan ook worden gebruikt 12,13. Sigma / NUSA factoren kunnen worden verkregen als described in eerdere werk 14,15.
- Voor het hier beschreven experiment overproduceren en zuiveren E. coli RNAP in het laboratorium zoals beschreven 11, of het verkrijgen van een commerciële bron (Materials List).
- Bereiding van diethylpyrocarbonaat (DEPC) behandeld water
Let op: U kunt RNase-free water worden verkregen uit commerciële bronnen (Materials List).- Voeg 1 ml met diethylpyrocarbonaat (DEPC) tot 1 liter gezuiverd water (0,1% v / v) en meng gedurende de nacht.
- Autoclaaf DEPC water en tips tweemaal.
- DNA Template Voorbereiding
- Zuiver plasmide pSG1154 16 en / of 17 pIA226 met een plasmide zuivering kit (Materials List) volgens de instructies van de fabrikant.
- Om de sjabloon voor run-off transcriptie assays versterken (een 360 bp fragment dat de P Xyl promoter regio), assembleren een PCR-reactie op ijs met 25 pi 2x PCR-mix (Materials List), 2 pi van elk van de primers (5 uM) : 5'-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3 '(voorwaarts) en 5'-CCCATTAACATCACCATC-3' (omgekeerde), 1 ui pSG1154 plasmide preparation (250 pm) en 20 pi gezuiverd water).
- Of als alternatief, voor enkele ronde transcriptie assays, versterken van een 447 bp fragment dat de λ P R promotorregio van pIA226 17. Stel een PCR reactie op ijs met behulp van 25 pi 2x PCR mix, 2 pi elk van de primers (5 uM): 5'-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 '(voorwaarts) en 5'-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3' (omgekeerde), 1 gl pIA226 17 plasmide voorbereiding (250 pm) en 20 pi gezuiverd water).
Opmerking: Dit sjabloon mist cytosine tot 26 nt positie, dat is de 26 ste nucleotide van de transcriptie startplaats. Daarom transcriptie met deze sjabloon initiatie, promotor klaring mogelijk en blokkering bij 26 nt een stabiele transcriptie elongatie complex (EG) vormen wanneer alleen ATP, UTP en GTP in het reactiemengsel aanwezig zijn.
- Of als alternatief, voor enkele ronde transcriptie assays, versterken van een 447 bp fragment dat de λ P R promotorregio van pIA226 17. Stel een PCR reactie op ijs met behulp van 25 pi 2x PCR mix, 2 pi elk van de primers (5 uM): 5'-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 '(voorwaarts) en 5'-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3' (omgekeerde), 1 gl pIA226 17 plasmide voorbereiding (250 pm) en 20 pi gezuiverd water).
- Opzetten van een PCR-reactie onder de volgende omstandigheden: 95 °; C gedurende 30 sec, 50 ° C gedurende 30 sec, 72 ° C gedurende 30 seconden, het herhalen van 30 cycli.
- Zuiver het product met behulp van een PCR clean-up kit (Materials List) volgens de instructies van de fabrikant en geëlueerd in 100 ul transcriptie buffer voor de transcriptie assay.
- Bepaal de template DNA-concentratie met behulp van een fluorospectrometer (Materials List).
- NTP Voorbereiding
Opmerking: NTP's kan worden verkregen bij verschillende commerciële bronnen (Materials List).- Oplossen NTP (≥99% zuiver) in DEPC-behandeld water 1 M voorraad, aliquot 1 ml van de oplossing te maken in 1,5 ml buizen (50 ui per buisje) en bewaar bij -20 ° C.
- Order α- 32P UTP (3000 Ci / mmol) voorafgaand aan het experiment. 32P heeft een korte halfwaardetijd van 14,29 dagen.
Opmerking: Met-alpha gelabelde UTP vermijdt de intensiteit voor banden met verschillende lengte.
- RNA Ladder Bereiding
- Monteer de following reactie bij kamertemperatuur: 0,5 ug RNA sjabloon Mix (Materials List), 80 mM HEPES buffer pH 7,5, 12 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 10 mM DTT, 2 mM ATP / CTP / GTP, 0,5 mM UTP, 2 il a-32P UTP, 0,5 pi T7 RNAP (Materials List), DEPC-behandeld water tot 20 ul.
- Sta reactie verlopen bij 37 ° C gedurende 1 uur. Onmiddellijk gebruiken of op te slaan bij -80 ° C.
2. Bereiding van RNA Sequencing Gel
- gelbereiding
- Reinig de platen van een sequencing gel apparaat (Materials List) tweemaal met 70% ethanol en gezuiverd water, en monteer de cel met een kam en twee afstandhouders.
Opmerking: Een plaat kan worden gecoat met siliconiseerproces reagens (Materials List) om gel te verwijderen in stap 4.2 te vergemakkelijken. - Ontbinden 33,6 g ureum in 22 ml water en 16,4 ml 5x Tris / boraat / EDTA (TBE) buffer (54 g tris (hydroxymethyl) aminomethaan; 27,5 g boorzuur, 10 ml 1 M ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), pH 7,4 in 1 L water) met een magneetroerder.
- Voeg 16 ml 40% acrylamide / bis-acrylamide-oplossing (19: 1) om de ureumoplossing en filtreer door een 0,45 urn filter.
- Voeg 514 ul 10% (w / v) vers bereid ammoniumpersulfaat in water, gevolgd door 51,4 ul N, N, N ', N'-tetramethylethyleendiamine (TEMED) aan de gefiltreerde oplossing.
- Keer de geloplossing overmatige beluchting vermijden en injecteer onmiddellijk en soepel in de horizontale stand voorverpakte sequencing cel onder injectiegat. Wees voorzichtig om te voorkomen dat bellen tijdens de injectie.
- Sta 1-1,5 uur totdat de gel volledig is ingesteld voor gebruik in een transcriptie assay. De gel kan worden bewaard bij kamertemperatuur gedurende twee of drie dagen wanneer omwikkeld met water vochtige weefsel aan de bovenkant van de cel sequencing.
- Reinig de platen van een sequencing gel apparaat (Materials List) tweemaal met 70% ethanol en gezuiverd water, en monteer de cel met een kam en twee afstandhouders.
3. transcriptiereactie
- Transcriptie Rek onderbreken Assay
- Vorming van een transcriptie elongatie complex
- Voeg 1 ui van RNAP kern enzym (1 uM voorraad in transcriptie buffer) naar een 1,5 ml buis.
- Voeg 1 pl gezuiverd sigma-70 factor (σ 70, 3 pM voorraad op transcriptie buffer) aan de RNAP en incubeer op ijs gedurende 10 min RNAP holoenzym te vormen.
- Voeg 3 ul 500 nM gezuiverd matrijs DNA (λ PR promoter van het pIA226 PCR product) in transcriptiebuffer de RNAP holoenzym en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 min naar de open complex.
- Maak een mengsel van reactiecomponenten in een 1,5 ml buis met behulp van 5 ui 10 x transcriptiebuffer (Materials List: 400 mM Tris-HCl, 1,6 M KCI, 100 mM MgCl2, 10 mM DTT, 50% glycerol, pH 7,9 in DEPC behandeld water), 2 pi van 250 pM elk GTP en UTP, 1 ui 1 mM ATP en 1 pi α- 32P UTP (3000 Ci / mmol). Voeg DEPC behandeld water tot 41 ul.
Neete: RNase inhibitor (Materials List) kan worden gebruikt om de RNase besmetting te minimaliseren. - Breng de gemengde oplossing aan de buis met de open complex en incubeer bij 37 ° C gedurende 15 min ter vorming van de transcriptie elongatie complex gestopt bij 26 nt.
- Beweeg de reactie tot kamertemperatuur (~ 21 ° C) en voeg 1 pl 2,5 mg / ml rifampicine om een eindconcentratie van 50 ug / ml.
- Voeg 1 pl 0,1 mM gezuiverd Nuša aan het reactiemengsel en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 2 pl 250 uM CTP in het reactiemengsel tot een eindvolume van 50 pl te meten en de reactietijd met een timer.
- Breng 5 ul van de reactieoplossing in 2 ui RNA gel laadbuffer (95% formamide, 0,05% broomfenolblauw en 0,05% xyleencyanol) en 30, 60, 120, 240, 480 en 1200 sec om de reactie te blussen.
- Gooi de 32P UTP tips en buizen in een radioactief afval container.
- Vorming van een transcriptie elongatie complex
- Transcriptie initiatie Assay
- De vorming van de Open Complex
- Verdunde gezuiverde σ 70-0,5 uM.
- Herhaal stap 3.1.1.1 tot 3.1.1.3 behulp 0,5 pM (in plaats van 3 uM) gezuiverd σ 70, en de DNA matrijs (P xyl promotorgebied van pSG1154 PCR product).
- Remming van transcriptie initiatie assay
- Voeg de remmer ontworpen RNAP holo formatie RNAP kern enzym voorafgaand voorkomen toevoeging van 70 σ (na stap 3.1.1.1), gevolgd door stap 3.1.1.2 en 3.1.1.3 te onderzoeken of de remmer kan holo formatie verstoren.
- Als alternatief na stap 3.1.1.2, voeg de remmer om te onderzoeken of het in staat is om competitief te remmen σ 70 binding aan RNAP.
- Met dezelfde hoeveelheid DMSO, het oplosmiddel van de remmer, in plaats van de remmer stock in control reacties.
- Voltooiing van de reactie
- Ontbinden heparine in water tot een voorraad concentratie van 1 mg / ml en voorraad bij -20 ° C.
Opmerking: Heparine is een concurrent van DNA dat RNAP dat geen open complex heeft gevormd kunnen afzonderen. Zodra de open complex wordt gevormd, kan heparine niet in de DNA-bindingsplaats van RNAP en remmen de transcriptie van voorgevormde geopend complex. Daarom is heparine alleen vereist voor één ronde assays; Het is niet noodzakelijk voor multi-round assays. - Bereid het reactiemengsel gebruikt 5 ui 10 x transcriptiebuffer (Materials List), 1 ui 1 mg / ml heparine-oplossing, 1 ui 10 mM elk ATP, GTP en CTP, 2,5 mM UTP en 1 pl 32 α- P UTP (3000 Ci / mmol). Voeg DEPC behandeld water tot 45 ul.
- Meng het reactiemengsel met de transcriptie geopende complex puls spin en incubeer bij 37 ° C gedurende 20 min.
- Overdracht 10 ul van het reactiemengsel zolutie in 5 ui van RNA gel laadbuffer (95% formamide, 0,05% broomfenolblauw en 0,05% xyleencyanol) om de reactie te blussen.
- Ontbinden heparine in water tot een voorraad concentratie van 1 mg / ml en voorraad bij -20 ° C.
- De vorming van de Open Complex
4. RNA Gel Running and Development
- Het uitvoeren van de Denaturing Polyacrylamide Gel
- Voer het gel bij 50 ° C en 50 W in 1x TBE buffer gedurende ongeveer 1,5 uur tot de temperatuur van de gel en de buffer is stabiel bij 50 ° C.
- Warmte monsters bij 90 ° C gedurende 30 seconden en zet ze op ijs vóór het laden op het gel.
- samples lading in de putjes op de bovenkant van de gel langs een rijstrook met 2 pl RNA ladder (1: 100 verdunning).
- Voer de gel bij 50 W en 50 ºC in 1x TBE buffer tot de broomfenolblauw kleurstof langs de gel bereikt ~ 03/02.
- gel Behandeling
- Open langzaam en voorzichtig scheiden de bovenste plaat uit de sequencing cel. Wees extra voorzichtig om te voorkomen dat het breken van de gel.
- Cut chromatography papier (Materials List) om de gel grootte overeenkomen van boven naar broomfenol blauwe kleurstof. Gebruik een geigerteller om de geschatte positie van radioactief gelabeld RNA-transcripten te bevestigen.
- bedekken voorzichtig de gel met het filter, en druk stevig totdat de gel hecht aan het filter papier. Afgesneden en gooi de onderkant van de gel radioactief afval als de niet opgenomen NTPs ren naar de onderkant van de gel, die erg warm worden.
- Plaats een vergelijkbare grootte stuk filtreerpapier op het droogbed van een vacuüm droger, en voorzichtig leg de gel-gecoat papier op het met de gel naar boven.
- Bedek de gel met een plasticfolie en droog bij 60 ° C gedurende 1,5 uur.
- Wikkel de andere zijde van de gel bekleed filterpapier met plastic folie en plaats op een fotostimuleerbare fosforplaat in de beeldvormende geval, met de juiste belichtingstijd, die kan variëren van 1 uur tot overnacht afhankelijk van de reactie-efficiëntie.
- Afbeelding de fosfor plaat met behulp vaneen beeldvormer scanner volgens de instructies van de fabrikant. Bepaal de relatieve intensiteit band met behulp van ImageJ software volgens de software handleiding.
- Gebruik een geigerteller om de radioactieve besmetting in het werkgebied controleren, veeg de verdachte items en met weefsel en een reinigingsmiddel en gooi het weefsel in de afvalcontainer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Transcriptie efficiëntie kan worden bepaald door de mate van straling in de banden op verschillende tijdstippen. De pauzeren test om de functie van Nusa factor mogelijk visualisatie van de pauze, beëindiging te testen, en run-off producten (Figuur 1A). In aanwezigheid van het N-terminale domein van NUSA (Nusa NBD; aminozuurresten 1-137), werd het uiterlijk van de RNA-producten aanzienlijk vertraagd vergeleken met de controleproef ontbreken NUSA. Deletie van aminozuurresiduen 104-137 (Helix 3) van de Nusa fragment of wijziging van alanine van een reeks aminozuren (resten K36, K37, R104, V108, K111, Q112, Q116, en R119) resulteerde in een totale verlies van Nusa pauze activiteit. Helix 3 residuen R104 en K111 werden getoond van essentieel belang voor Nusa NTD pauze activiteit en met de R104A en K111A constructies die vergelijkbare pauze halfwaardetijd waarden aan de controle, waar Nusa NTD afwezig was (figuur 1B) te zijn. Het should worden dat deletie van Helix 3 of wijziging van deze twee aminozuurresiduen heeft geen invloed op binding aan Nuša RNAP 15. Het resultaat suggereerde dat R104 en K111 waren de belangrijkste aminozuren die nodig zijn voor de regulering van Nusa pauze activiteit.
Evenzo, zoals getoond in figuur 2A, de dosis-respons curve toonde de remming van in vitro transcriptie (multi-round) met verschillende concentraties van een nieuw geïdentificeerde bacteriële transcriptie remmer C5 14. C5 werd geïdentificeerd naar aanleiding van een in silico scherm van project tot rationeel richten op de interactie van σ 70 met haar belangrijkste bindingsplaats op RNAP noemde de regio Clamp-Helix 18. Onder toevoeging van C5 in de transcriptiereactie, kan deze verbinding concurreren σ 70 voor binding aan RNAP en daardoor transcriptie geremd. Mechanistisch toevoeging van C5 tot RNAP gevolgd door σ <sup> 70 factor aan het reactiemengsel was significant efficiënter voor transcriptie remming dan experiment met C5 na de vorming van RNAP holoenzyme (figuur 2B). Deze resultaten toonden aan dat 70 niet σ C5 kan verdringen gebonden aan RNAP of C5 die kon niet efficiënt σ 70 gebonden aan RNAP in één ronde assay verdringen.
Figuur 1:. Effecten van Mutant Nusa NTD in transcriptie (A) transcriptie pauze assays zonder Nusa, met behulp van NUSA NTD (+ Nusa), Nusa NTD met helix 3 geschrapt (Δ Helix), en Nusa NTD met alanine substituties op residuen K36, K37 , R104, Q108, K111, Q112, Q116, en R119 (All Ala). P, pauze site; T, de beëindiging site; RO, run-off. Wiggen boven de gel tonen de tijdstippen bemonsterd (0,5, 1, 1,5, 2, 5 en 10 minuten) 15; (B) Pauze activiteit van halfwaardetijden van mutant Nusa NBD opzichte van het wild-type eiwit. Gemiddelde van 3 experimenten met SD. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Nucleic Acids Res. 43 (5), 2829-2840 (2015). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Transcriptie remming door verbinding C5 (A) Remming curve van E. coli RNAP transcriptie van verbinding C5 in een multi-round assay 14. Het percentage remming van transcriptie werd bepaald door het RNA-product ten opzichte van een controle (geen C5 aanwezig) tegen de concentratie van C5 gebruikt in de reactie. (B) Procent remmende activiteit van verbinding C5 in single-round transcription assays onder toevoeging van C5 voor (complex + σ 70, grijs) en na (holoënzym C5 +; zwart) holo formatie. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In alle organismen, transcriptie strak gereguleerd proces. In vitro transcriptie assays zijn ontwikkeld om een platform voor het testen van de effecten van transcriptiefactoren, kleine moleculen en transcriptie remmers. Bij deze werkwijze document, een bepaling voor algemene bacteriële transcriptie beschreven. Transcriptie assays gecombineerd met sequentie gelelektroforese transcripten zijn zeer belangrijk voor mechanistische studies mocht visualisatie van de transcriptie producten langs een tijdlijn toestaan. Daardoor is deze werkwijze in staat is de invloed van kleine veranderingen in reactieomstandigheden en onthullen aannemelijk werkingsmechanisme. Bovendien wordt het mogelijk om specifieke transcriptie assays te ontwerpen met betrekking tot de functie van transcriptiefactoren met onbekende werkingsmechanismen.
In dit artikel beschrijven we ook de werkwijze voor het werkingsmechanisme van een remmer van RNAP holoen bevestigenZyme formatie. De hier beschreven methode kan de verandering van elk RNA-transcript met de tijd weer, en met geschikte modificatie kan het testen van antibacteriële middelen tegen elke stap van transcriptie eventueel mogelijk. De multi-round assay kan worden gebruikt als een relatief eenvoudige screeningsmethode nieuwe transcriptie richt remmers te identificeren en de enkele ronde test kan worden gebruikt om het mechanisme van remmers, zoals competitieve / niet-competitieve eigenschappen te bestuderen. Merk op dat kleine moleculaire aggregatie vals positieve treffers als niet-competitieve remmers in de drug discovery-proces en de enkele ronde mechanistische studie kan een alomvattende aanpak voor de hit-to-lead evaluatie bieden kan veroorzaken. Daardoor is deze gecontroleerde transcriptieproces kan precies onthullen hoe een remmer beïnvloedt transcriptie, die kunnen helpen bij de novo rationele ontwerpen van geneesmiddelen. Samen met een hoge-resolutie informatie over remmer bindingsplaatsen door X-ray kristallografische stusterft, structure-based rationele drug design wordt zeer vatbaar voor toepassing in drug discovery targeting transcriptie zijn.
Hoewel de hoge-doorvoer resultaten niet kunnen worden verkregen met in vitro transcriptie assays, ze zijn zeer bruikbaar bij het ontleden van de precieze mechanismen geassocieerd met de besturing van transcriptie. De componenten en bepalingsomstandigheden kunnen gemakkelijk worden aangepast voor individuele behoeften. Verschillende factoren (bijvoorbeeld Nusa) 4, 15, kleine moleculen (bijvoorbeeld ppGpp) 19 en / of transcriptie remmers (bijvoorbeeld rifampicine) 20 plaats kunnen worden toegevoegd om hun functies te testen in transcriptieregulatie. De DNA-template moet individueel worden ontworpen, met een zorgvuldige keuze van de sterke promotors, pauzesequentie en terminators. Om een hoge reproduceerbaarheid van de test te bereiken moeten eiwitten sterk worden gezuiverd en vrij van residuele RNase-activiteit, en de transcriptie buffer, DNA-matrijs, enstock oplossing van NTP ondergronden moeten worden gedaan in DEPC behandeld water. Het gebruik van radioactieve NTP beschreven in dit document echter fluorescerende nucleotiden kunnen ook worden toegepast 21. Kwaliteit van het DNA template is essentieel voor het succes van transcriptie assay. Voldoende afstand tussen de promotor / pause / terminator moet worden opgenomen, zodat de verschillende transcriptie producten goed worden gescheiden en onderzocht. De sequencing gel moet goed gegoten en relatief verse TBE buffer worden gebruikt voor elektroforese hoog mogelijke resolutie van RNA transcripten te bereiken. Als de afbraak van transcriptieproduct wordt opgemerkt, moet hoogwaardige RNase inhibitor in de transcriptie reactiemengsel worden opgenomen. Buizen en pipetpunten moeten dubbel worden geautoclaveerd en handschoenen moeten worden gedragen ten alle tijden bij het uitvoeren van de test, met het oog op de invoering van RNase te minimaliseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Obtain the proteins required for transcription assay | |||
| E. coli RNAP | Epicentre | S90250 | |
| Preparation of DEPC-treated water | |||
| diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free water | |||
| Ambion Nuclease-Free Water | ThermoFisher | AM9937 | |
| DNA template preparation | |||
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1330 | |
| ACCUZYME Mix | Bioline | BIO-25028 | |
| PCR primers | |||
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| NanoDrop 3300 fluorospectrometer | Thermo Scientific | ND-3300 | |
| NTP Preparation | |||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| UTP | Sigma-Aldrich | U1006 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G3776 | |
| CTP | Sigma-Aldrich | C9274 | |
| High Purity rNTPs | GE Healthcare | 27-2025-01 | |
| α-32P UTP | PerkinElmer | BLU007C001MC | Radioactive compound |
| RNA ladder preparation | |||
| Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1–1 kb | Millipore | 69003 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| T7 RNAP | Promega | P2075 | |
| Gel preparation | |||
| Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell | Bio-Rad | 165-3804 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U6504 | |
| tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 154563 | |
| boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED | |
| 40% Acrylamide/bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | A9926 | |
| ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Transcription Assay | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | 84020 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Transcription buffer | |||
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Filter paper | |||
| Whatman 3MM Chr Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Radioactive decontaminant | |||
| Decon 90 | decon | decon90 | |
| Gel Treatment | |||
| Typhoon Trio+ imager | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-89 |
References
- Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation. J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).
- Burgess, R. R., Anthony, L. How sigma docks to RNA polymerase and what sigma does. Curr. Opin. Microbiol. 4 (2), 126-131 (2001).
- Gusarov, I., Nudler, E. Control of intrinsic transcription termination by N and NusA: the basic mechanisms. Cell. 107 (4), 437-449 (2001).
- Ha, K. S., Toulokhonov, I., Vassylyev, D. G., Landick, R. The NusA N-terminal domain is necessary and sufficient for enhancement of transcriptional pausing via interaction with the RNA exit channel of RNA polymerase. J. Mol. Biol. 401 (5), 708-725 (2010).
- Yang, X., Lewis, P. J. The interaction between RNA polymerase and the elongation factor NusA. RNA Biol. 7 (3), 272-275 (2010).
- Artsimovitch, I., Henkin, T. M. In vitro approaches to analysis of transcription termination. Methods. 47 (1), 37-43 (2009).
- Decker, K. B., Hinton, D. M. Transcription regulation at the core: Similarities among bacterial, archaeal, and eukaryotic RNA polymerases. Annu. Rev. Microbiol. 67, 113-139 (2013).
- Artsimovitch, I., Vassylyev, D. G. Is it easy to stop RNA polymerase? Cell Cycle. 5 (4), 399-404 (2006).
- Murakami, K. S. Structural biology of bacterial RNA polymerase. Biomolecules. 5 (2), 848-864 (2015).
- Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription as a target for antibacterial drug development. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80 (1), 139-160 (2016).
- Yang, X., Ma, C., Lewis, P. A vector system that allows simple generation of mutant Escherichia coli RNA polymerase. Plasmid. 75, 37-41 (2014).
- Burgess, R. R. A new method for the large scale purification of Escherichia coli deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase. J. Biol. Chem. 244, 6160-6167 (1969).
- Artsimovitch, I., Svetlov, V., Murakami, K. S., Landick, R. Co-overexpression of Escherichia coli RNA polymerase subunits allows isolation and analysis of mutant enzymes lacking lineage-specific sequence insertions. J. Biol. Chem. 278 (14), 12344-12355 (2003).
- Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription inhibitor of RNA polymerase holoenzyme formation by structure-based drug design: From in silico screening to validation. ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016).
- Ma, C., Mobli, M., Yang, X., Keller, A. N., King, G. F., Lewis, P. J. RNA polymerase-induced remodelling of NusA produces a pause enhancement complex. Nucleic Acids Res. 43 (5), 2829-2840 (2015).
- Lewis, P. J., Marston, A. L. GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis. Gene. 227 (1), 101-110 (1999).
- Artsimovitch, I., Landick, R. Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (13), 7090-7095 (2000).
- Vassylyev, D. G., et al. Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 Å resolution. Nature. 417, 712-719 (2002).
- Artsimovitch, I., et al. Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp. Cell. 117 (3), 299-310 (2004).
- Bordier, C. Inhibition of rifampicin-resistant RNA synthesis by rifampicin-RNA polymerase complexes. FEBS lett. 45 (1-2), 259-262 (1974).
- Tang, G. Q., Anand, V. S., Patel, S. S. Fluorescence-based assay to measure the real-time kinetics of nucleotide incorporation during transcription elongation. J. Mol. Biol. 405 (3), 666-678 (2011).
