Abstract
Les essais in vitro de transcription ont été mis au point et largement utilisé depuis de nombreuses années pour étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans la transcription. Ce processus nécessite plusieurs sous-unités d'ARN-polymérase ADN-dépendante (RNAP) et une série de facteurs de transcription qui agissent pour moduler l'activité de RNAP pendant l'expression génique. gel de séquençage électrophorèse des transcrits radiomarqués est utilisé pour fournir des informations mécaniste détaillées sur la façon de transcription produit et quels paramètres peuvent l'affecter. Dans cet article, nous décrivons le protocole pour étudier la manière dont le facteur d'élongation essentiel NusA régule la transcription de pause, ainsi qu'une méthode pour identifier un agent antibactérien ciblage initiation de la transcription par l'inhibition de la formation holoenzyme RNAP. Ces méthodes peuvent être utilisées comme une plate-forme pour le développement d'approches supplémentaires pour explorer le mécanisme d'action des facteurs de transcription qui restent encore peu clair, ainsi que de nouvelles agen antibactériennets ciblant la transcription qui est une cible de médicament sous-utilisé dans la recherche et le développement d'antibiotiques.
Introduction
La transcription est le processus dans lequel l'ARN est synthétisé à partir d'une matrice d'ADN spécifique. Dans les cellules eucaryotes, il existe trois RNAPs distincts: I ARNP transcrit précurseurs ARNr ARNP II est responsable de la synthèse de l'ARNm et de certains petits ARN nucléaires, ainsi que la synthèse de l'ARNr 5S et ARNt est réalisée par ARNP III. Chez les bactéries, il n'y a qu'un seul ARNP responsable de la transcription de toutes les classes d'ARN. Il y a trois étapes de transcription: initiation, l'élongation et la terminaison. La transcription est l'un des procédés les plus réglementés dans la cellule. Chaque étape du cycle de transcription représente un point de contrôle pour la régulation de l' expression des gènes 1. Pour l' initiation, ARNP doit associer à un facteur sigma pour former une holoenzyme, qui est nécessaire pour diriger l'enzyme à des sites spécifiques appelés promoteurs 2 pour former un complexe promoteur ouvert. Par la suite, une grande suite de facteurs de transcription sont responsables de la réglementation oactivités f RNAP pendant l'allongement et de terminaison phases. Le facteur de transcription examiné ici est la protéine hautement conservée et essentielle, NusA. Il est impliqué dans la régulation de la transcription en pause et la résiliation, ainsi que des anti-terminaison au cours de la synthèse de l' ARNr 3-5.
Les essais in vitro de transcription ont été développés comme des outils puissants pour étudier les étapes réglementaires complexes lors de la transcription 6. D'une manière générale, un fragment linéaire d'ADN comprenant une région promotrice est requise en tant que matrice pour la transcription. La matrice d'ADN est habituellement généré par PCR ou par linéariser un plasmide. les protéines et les PNT (y compris une NTP radiomarqué à des fins de détection) purifiés sont ensuite ajoutés et le produit analysé après la période d'incubation requise. Utilisation de modèles appropriés et des conditions de réaction, toutes les étapes de la transcription ont été examinés en utilisant cette approche qui a permis la caractérisation moléculaire détaillée de transcription au cours du dernier demi - siècle 7. En combinaison avec des informations sur la structure en 3 dimensions de RNAP il a également été possible de sonder le mécanisme moléculaire de l' inhibition de la transcription par les antibiotiques et conduit aux antibiotiques, et utiliser cette information dans le développement de nouveaux médicaments améliorés 8-10.
Dans ce travail, nous fournissons des exemples de tests de transcription peuvent être utilisés pour déterminer le mécanisme de régulation par allongement de la transcription / facteur de terminaison NusA, et comment le mécanisme d'action d'une nouvelle initiation de la transcription inhibiteur de plomb peut être déterminée.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Attention: Les expériences impliquent l'utilisation de l'isotope radioactif 32 P et aucun travail devraient être entrepris avant que toutes les conditions de sécurité appropriées ont été respectées. En général, le personnel sont tenus d'assister à un cours de sécurité et se soumettre à la pratique supervisée avant des expériences en utilisant des réactifs radioactifs. S'il vous plaît porter un équipement de protection individuelle (dosimètre thermoluminescent, des lunettes de sécurité, gants, salle de rayonnement sarraus de laboratoire, pantalon de longueur, fermé orteils chaussures) lors de l'exécution de la réaction.
1. Préparation des matériaux de dosage
- Obtenir les protéines requises pour le dosage de transcription.
- Pour l'expérience décrite ici, surproduire et purifier E. coli RNAP dans le laboratoire tel que décrit 11, ou d' obtenir à partir d' une source commerciale (liste des matières).
Remarque: Les deux fournissent des résultats similaires. D' autres procédés de purification de RNAP native ou une affinité marquée peut également être utilisé 12,13. Sigma / facteurs Nusa peuvent être obtenus sous forme described dans les travaux antérieurs 14,15.
- Pour l'expérience décrite ici, surproduire et purifier E. coli RNAP dans le laboratoire tel que décrit 11, ou d' obtenir à partir d' une source commerciale (liste des matières).
- Préparation de l'eau de diéthylpyrocarbonate (DEPC de) Traitées
Remarque: Vous pouvez également, l'eau sans RNase peuvent être obtenus auprès de sources commerciales (Liste des matériaux).- Ajouter 1 ml de pyrocarbonate de diéthyle (DEPC) et 1 L d'eau purifiée (0,1% v / v) et on mélange pendant une nuit.
- eau DEPC Autoclave et conseils deux fois.
- Modèle Préparation ADN
- Purifier plasmide pSG1154 16 et / ou pIA226 17 en utilisant un kit de purification de plasmide (liste des matières) selon les instructions du fabricant.
- Pour amplifier le gabarit pour les essais de transcription de run-off (un fragment de 360 pb englobant la région du promoteur xyl P) assembler une réaction de PCR sur de la glace , y compris 25 ul mélange 2x PCR (Voir Matériaux), 2 pl de chacune des amorces (5 uM) : 5'-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3 '(avant) et 5'-CCCATTAACATCACCATC-3' (inverse), 1 pl pSG1154 plasmide pra séparation (250 uM) et 20 pi d'eau purifiée).
- Ou encore, pour simples essais de transcription rondes, amplifier un fragment de 447 pb englobant la région R de promoteur λ P de pIA226 17. Mettre en place une réaction PCR sur la glace en utilisant 25 pi de mélange 2x PCR, 2 pl chacune des amorces (5 uM): 5'-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 '(avant) et 5'-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3' (inverse), 1 pl pIA226 17 préparation de plasmide (250 pm) et 20 pi d'eau purifiée).
Remarque: Ce modèle manque cytosine jusqu'à la position 26 nt, qui est le 26 ème nucléotide du site d'initiation de la transcription. Par conséquent, la transcription en utilisant ce modèle permettra l'initiation, la clairance de promoteur et de décrochage au +26 nt pour former un complexe d'élongation de transcription stable (CE) lorsque seul ATP, UTP et GTP sont présents dans la réaction.
- Ou encore, pour simples essais de transcription rondes, amplifier un fragment de 447 pb englobant la région R de promoteur λ P de pIA226 17. Mettre en place une réaction PCR sur la glace en utilisant 25 pi de mélange 2x PCR, 2 pl chacune des amorces (5 uM): 5'-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 '(avant) et 5'-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3' (inverse), 1 pl pIA226 17 préparation de plasmide (250 pm) et 20 pi d'eau purifiée).
- Mettre en place une réaction PCR avec les conditions suivantes: 95 °; C pendant 30 secondes, 50 ° C pendant 30 secondes, 72 ° C pendant 30 secondes, en répétant 30 cycles.
- On purifie le produit PCR en utilisant un kit de nettoyage (liste de matériaux) selon les instructions du fabricant et éluer dans 100 ul de tampon de transcription pour le dosage de la transcription.
- Déterminer la concentration d'ADN de matrice en utilisant une fluorospectromètre (Voir Matériaux).
- NTP Préparation
Remarque: les PNT peuvent être obtenus à partir de différentes sources commerciales (Liste des matériaux).- Dissoudre PNT (≥99% pures) dans l'eau traitée par DEPC pour faire 1 M Stock, aliquote de 1 ml de la solution dans 1,5 ml tubes (50 ul dans chaque tube) et conserver à -20 ° C.
- Commande α- 32 P UTP (3000 Ci / mmol) avant l'expérience. 32 P a une demi-vie courte de 14,29 jours.
Remarque: L'utilisation de l'UTP marqué alpha évite comparant l'intensité des bandes avec des longueurs différentes.
- Préparation de l'ARN Ladder
- Assembler le suiviréaction tion à la température ambiante: 0,5 pg d' ARN Modèle Mix (liste des matières), 80 mM HEPES pH 7,5 tampon, 12 mM de MgCl2, 10 mM de NaCl, 10 mM de DTT, 2 mM ATP / CTP / GTP, mM UTP 0,5, 2 ul 32P UTP, 0,5 ul T7 RNAP (liste des matières), l' eau traitée par DEPC à 20 pi.
- Permettre à la réaction de se dérouler à 37 ° C pendant 1 heure. Utilisez immédiatement ou conserver à -80 ° C.
2. Préparation de l'ARN Séquençage Gel
- Préparation du gel
- Nettoyer les plaques à partir d'un appareil de gel de séquençage (liste des matières) deux fois avec 70% d'éthanol et de l'eau purifiée, et d'assembler la cellule avec un peigne et deux entretoises.
Remarque: Une plaque peut être revêtue avec un réactif de siliconage (Voir Matériaux) pour faciliter le retrait du gel à l'étape 4.2. - Dissoudre 33,6 g d'urée dans 22 ml d'eau et 16,4 ml de 5 x Tris / Borate / EDTA (TBE) (54 g de tris (hydroxyméthyl) aminométhane, 27,5 g d'acide borique, 10 ml de 1 M d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), pH 7,4 dans 1 litre d'eau) à l'aide d'un agitateur magnétique.
- Ajouter 16 ml de bis-acrylamide, l'acrylamide solution à 40% / (19: 1) pour la solution d'urée et filtrer à travers un filtre de 0,45 um.
- Ajouter 514 ul de 10% (p / v) de persulfate d'ammonium fraîchement préparée dans de l' eau suivi par 51,4 ul de N, N, N ', N' -tétraméthyléthylènediamine (TEMED) à la solution filtrée.
- Retourner doucement la solution de gel pour éviter une aération excessive et injecter immédiatement et sans à-coup dans la cellule de mise en séquence pré-emballé placé horizontalement à partir du trou d'injection inférieur. Prenez soin d'éviter de faire des bulles lors de l'injection.
- Permettre 1-1,5 h jusqu'à ce que le gel est complètement fixé avant l'utilisation dans un dosage de transcription. Le gel peut être conservé à température ambiante pendant deux ou trois jours lorsqu'elle est enroulée avec le tissu mouillé à l'eau sur la partie supérieure de la cellule de séquençage.
- Nettoyer les plaques à partir d'un appareil de gel de séquençage (liste des matières) deux fois avec 70% d'éthanol et de l'eau purifiée, et d'assembler la cellule avec un peigne et deux entretoises.
3. Réaction de transcription
- Allongement Transcription Assay Pause
- Formation d'un complexe d'élongation de la transcription
- Ajouter 1 pl de RNAP core enzyme (1 uM disponible dans un tampon de transcription) à un tube de 1,5 ml.
- Ajouter 1 pi de 70 purifié sigma-facteur (σ 70; 3uM stocks dans un tampon de transcription) à la RNAP et laisser incuber sur de la glace pendant 10 minutes pour former une holoenzyme ARNP.
- Ajouter 3 pi de 500 nM ADN matrice purifié (λ P R promoteur du produit pIA226 PCR) dans un tampon de transcription à l'holoenzyme ARNP et incuber à 37 ° C pendant 5 min pour former le complexe ouvert.
- Préparer un mélange des composants de la réaction dans un autre tube de 1,5 ml en utilisant 5 ul de 10 x tampon de transcription (Liste des matériaux: 400 mM de Tris-HCl, 1,6 M de KCl, 100 mM MgCl2, 10 mM de DTT, 50% de glycerol, pH 7,9 dans traitée au DEPC eau), 2 ul de 250 uM chaque de GTP et UTP, 1 pi d'ATP 1 mM, et 1 ul d'α- 32P UTP (3000 Ci / mmol). Ajouter de l'eau traitée DEPC à 41 pi.
Nonte: inhibiteur de RNase (liste des matières) peut être utilisé pour réduire au minimum la contamination de RNase. - Transférer la solution de mélange dans le tube contenant le complexe ouvert et incuber à 37 ° C pendant 15 min pour former le complexe de transcription d'allongement arrêté à +26 nt.
- Déplacer la réaction à la température ambiante (~ 21 ° C) et ajouter 1 pi de 2,5 mg / ml de rifampicine à une concentration finale de 50 pg / ml.
- Ajouter 1 pi de 0,1 mM purifié NusA au mélange réactionnel et on incube pendant 5 minutes à température ambiante.
- Ajouter 2 ul de 250 uM PTP dans le mélange réactionnel pour obtenir un volume final de 50 ul et de mesurer le temps de réaction à l'aide d'une minuterie.
- Transférer 5 pl de la solution réactionnelle dans 2 ul de tampon d'ARN de charge de gel (95% de formamide, 0,05% de bleu de bromophénol et 0,05% de xylene cyanol) à 30, 60, 120, 240, 480 et 1200 secondes pour arrêter la réaction.
- Evacuer les conseils 32 P UTP et tubes dans une suite de déchets radioactifsAINER.
- Formation d'un complexe d'élongation de la transcription
- Transcription Initiation Assay
- La formation du complexe ouvert
- Diluer purifiée σ 70 à 0,5 uM.
- Répéter les étapes 3.1.1.1 3.1.1.3 à l' aide de 0,5 pm ( au lieu de 3 uM) purifié σ 70 et la matrice d'ADN (la région du promoteur xyl P du produit pSG1154 PCR).
- L'inhibition de l'essai d'initiation de la transcription
- Ajouter l'inhibiteur destiné à empêcher la formation de RNAP holoenzyme à RNAP core enzyme avant l'addition de σ 70 (après l' étape 3.1.1.1), suivi par étapes 3.1.1.2 et 3.1.1.3 d'examiner si l'inhibiteur est capable de perturber holoenzyme formation.
- En variante, après l' étape 3.1.1.2, ajouter l'inhibiteur d'examiner si elle est capable d'inhiber la concurrence σ 70 lier à RNAP.
- Utiliser la même quantité de DMSO, le solvant de l'inhibiteur, à la place de l'inhibiteur detac dans des réactions de contrôle.
- Achèvement de la réaction
- Dissoudre l'héparine dans l'eau à une concentration stock de 1 mg / ml et le stock à -20 ° C.
Note: L'héparine est un concurrent d'ADN qui peut séquestrer RNAP qui n'a pas formé un complexe ouvert. Une fois que le complexe ouverte est formée, l'héparine ne peut pas entrer dans le site de liaison d'ADN de RNAP et inhiber la transcription du complexe ouvert pré-formé. Par conséquent, l'héparine est nécessaire uniquement pour les essais à un tour; on n'a pas besoin pour des essais à plusieurs ronds. - Préparer le mélange de réaction en utilisant 5 pi de 10 x tampon de transcription (Voir Matériaux), 1 pi de 1 mg / ml de solution d' héparine, 1 pi de 10 mM de chaque ATP, GTP et CTP mM UTP 2,5 et 1 pi d'α- 32 P UTP (3000 Ci / mmol). Ajouter de l'eau traitée DEPC à 45 pi.
- Mélanger le mélange réactionnel avec le complexe ouvert de la transcription, l'impulsion de spin et incuber à 37 ° C pendant 20 min.
- Transférer 10 ul de la réaction de telle sortelution dans 5 pi de tampon de charge de gel d'ARN (95% de formamide, 0,05% de bleu de bromophénol et 0,05% de xylene cyanol) pour tremper la réaction.
- Dissoudre l'héparine dans l'eau à une concentration stock de 1 mg / ml et le stock à -20 ° C.
- La formation du complexe ouvert
4. ARN Gel Exécution et développement
- Exécution du gel de polyacrylamide dénaturant
- Exécuter le gel à 50 ° C et 50 W dans un tampon TBE 1x pendant environ 1,5 heure jusqu'à ce que la température du gel et le tampon est stable à 50 ° C.
- échantillons de chaleur à 90 ° C pendant 30 secondes et déplacez-les sur de la glace avant le chargement sur le gel.
- Charger les échantillons dans les puits sur la partie supérieure du gel le long d'une voie contenant 2 ul d'ARN échelle (1: 100 de dilution).
- Exécutez le gel à 50 W et 50 ° C dans un tampon TBE 1x jusqu'à ce que le colorant bleu de bromophénol atteint ~ 2/3 sur le gel.
- Traitement Gel
- Ouvrir lentement et soigneusement séparer la plaque supérieure de la cellule de séquençage. Prenez grand soin pour éviter de casser le gel.
- Cut chromatograppapier hy (liste des matières) pour correspondre à la taille du gel du haut vers le colorant bleu de bromophénol. Utiliser un compteur Geiger pour confirmer la position approximative des transcrits d'ARN radiomarquées.
- couvrir délicatement le gel avec le papier filtre, et appuyez fermement jusqu'à ce que le gel adhère au papier filtre. Couper et jeter le fond du gel aux déchets radioactifs que les PNT non constituées en société courent au fond du gel, qui peut être très chaud.
- Placez un morceau de taille similaire de papier filtre sur le lit de séchage d'une machine de séchage sous vide, et posez délicatement le papier revêtu de gel sur elle avec le gel vers le haut.
- Couvrir le gel avec une pellicule plastique et sèche à 60 ° C pendant 1,5 heure.
- Enveloppez l'autre côté du papier filtre de gel recouvert d'une pellicule plastique et placer sur une plaque de phosphore photostimulable dans le cas de l'imagerie, avec le temps d'exposition appropriée, qui peut varier de 1 h à fonction nuit à l'efficacité de la réaction.
- L'image de la plaque luminescente à l'aideun scanner d'imagerie selon les instructions du fabricant. Déterminer l'intensité de la bande par rapport à l'aide du logiciel ImageJ selon le manuel du logiciel.
- Utilisez un compteur Geiger pour vérifier la contamination radioactive dans la zone de travail, essuyez les éléments suspects et de la zone avec le tissu et un agent de nettoyage et éliminer le tissu dans le récipient d'élimination.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
l'efficacité de la transcription peut être déterminée en mesurant le niveau de rayonnement dans les bandes à des instants différents. Le dosage pause pour tester la fonction du facteur NusA visualisation de la pause, la terminaison est activée, et le ruissellement des produits (figure 1A). En présence du domaine N-terminal de NusA (NTD NusA, les résidus d'acides aminés 1-137), l'apparence des produits d'ARN a été sensiblement retardée par rapport à l'expérience témoin dépourvu NusA. Deletion de résidus d'amino-acides 104-137 (hélice 3) du fragment NusA, ou une modification de l'alanine en une série d'acides aminés (résidus K36, K37, R104, Q108, K111, Q112, Q116 et R119) a abouti à l'intégralité perte d'activité de pause NusA. Helix 3 résidus R104 et K111 se sont avérés être essentiels pour l' activité de pause NusA NTD et avec le R104A et des constructions K111A donnant pause similaires demi-vie au contrôle où NusA NTD était absent (figure 1B). Il esthould noter que la suppression d'hélice 3 ou la modification de ces deux résidus d'acides aminés n'a aucun effet sur la liaison à NusA ARNP 15. Le résultat a suggéré que R104 et K111 étaient les acides aminés essentiels nécessaires à la régulation de l'activité de pause NusA.
De même, comme le montre la figure 2A, la courbe dose-réponse a démontré l'inhibition de la transcription in vitro (multi-tour) en utilisant différentes concentrations d'un inhibiteur de la transcription bactérienne nouvellement identifiée C5 14. C5 a été identifié suite à un dans l' écran de silico du projet pour cibler rationnellement l'interaction de σ 70 avec son site de liaison majeur sur RNAP appelé la région Clamp-Helix 18. Avec l' addition de C5 dans la réaction de transcription, ce composé peut rivaliser avec σ 70 pour la liaison à ARNP et donc la transcription inhibée. Mécaniquement, l'addition de C5 à ARNP suivie par σ <sup> 70 facteur au mélange de réaction a été significativement plus efficace pour l' inhibition de la transcription de l'expérience en utilisant C5 après la formation de RNAP holoenzyme (figure 2B). Ces résultats ont démontré que σ 70 ne pouvait pas déplacer C5 lié à RNAP, ou C5 ne pouvait pas déplacer efficacement σ 70 lié à RNAP dans un essai à un tour.
Figure 1:. Effets de Mutant NusA NTD dans la transcription (A) des essais de pause de transcription sans NusA, en utilisant NusA NTD (+ NusA), Nusa NTD avec hélice 3 supprimé (Δ Helix), et Nusa NTD avec des substitutions d'alanine au niveau des résidus K36, K37 , R104, Q108, K111, Q112, Q116 et R119 (All Ala). P, site de pause; T, site de terminaison; RO, run-off. Clavettes au-dessus du gel démontrent les points de temps de l'échantillon (0,5, 1, 1,5, 2, 5 et 10 min) 15; (B) l' activité de pause de demi-vie de mutant NusA NTD par rapport à la protéine de type sauvage. Moyenne de 3 expériences avec SD. Ce chiffre a été modifié depuis Nucleic Acids Res. 43 (5), 2829-2840 (2015). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. Inhibition de la transcription par le composé C5 (A) courbe d'inhibition de E. coli RNAP transcription par le composé C5 dans un essai multi-tour 14. Le pourcentage d'inhibition de la transcription a été déterminé par le produit de l'ARN par rapport à un témoin (pas de C5 présent) par rapport à la concentration en C5 utilisé dans la réaction. (B) Pourcentage d'activité inhibitrice du composé C5 à un seul tour tressais de anscription avec addition de C5 avant (complexe + σ 70; gris) et après (Holoenzyme + C5; noir) holoenzyme formation. Ce chiffre a été modifié depuis ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dans tous les organismes, la transcription est un processus étroitement régulé. Les essais in vitro de transcription ont été développés pour fournir une plate - forme pour tester les effets des facteurs de transcription, des petites molécules et les inhibiteurs de la transcription. Dans cette méthode, le papier, un test pour la transcription bactérienne générale a été décrite. essais de transcription combinés avec un gel de séquençage électrophorèse des transcrits sont très importants pour les études mécanistiques car ils permettent la visualisation de tous les produits de transcription le long d'une ligne de temps. Par conséquent, cette méthode est capable d'identifier l'influence des variations mineures dans les conditions de la réaction et en révélant un mécanisme plausible d'action. En outre, il devient possible de concevoir des essais de transcription spécifiques en ce qui concerne la fonction des facteurs de transcription avec des mécanismes d'action inconnu.
Dans cet article, nous avons décrit également la méthode pour confirmer le mécanisme d'action d'un inhibiteur de RNAP holoenformation zyme. La méthode décrite ici peut afficher le changement de chaque transcrit d'ARN avec le temps et avec une modification appropriée peut permettre à l'essai d'agents antibactériens contre chaque étape de la transcription, le cas échéant. Le dosage multi-tour peut être utilisé comme une méthode de dépistage simple par rapport à identifier de nouveaux inhibiteurs de la transcription de ciblage, alors que le dosage seul tour peut être utilisé pour étudier le mécanisme des inhibiteurs, tels que les propriétés concurrentielles / non-compétitifs. Notez que petite agrégation moléculaire peut provoquer des résultats faussement positifs que les inhibiteurs non compétitifs dans le processus de découverte de médicaments et l'étude mécanistique tour unique peut fournir une approche globale pour l'évaluation hit-to-lead. En conséquence, ce processus de transcription contrôlée est capable de révéler précisément comment un inhibiteur affecte la transcription, qui peut aider à rationaliser la conception de novo de la drogue. Avec des informations de haute résolution sur un inhibiteur des sites de liaison par X-ray stu cristallographiquemeurt, la conception rationnelle de médicaments basée sur la structure sera prête très bien pour une application dans la découverte de médicaments ciblant la transcription.
Bien que les résultats à haut débit ne peuvent pas être obtenus avec les tests de transcription in vitro, ils sont extrêmement utiles pour disséquer les mécanismes précis associés au contrôle de la transcription. Les composants et les conditions d'essai peuvent être facilement modifiés pour les besoins individuels. Divers facteurs (par exemple, NusA) 4, 15, de petites molécules (par exemple, ppGpp) 19 et / ou de transcription des inhibiteurs (par exemple, la rifampicine) 20 d'intérêt peuvent être ajoutés pour tester leurs fonctions dans la régulation de la transcription. La matrice d'ADN doit être conçu de façon individuelle, avec un choix judicieux des promoteurs forts, séquence de pause et terminateurs. Afin d'obtenir une haute reproductibilité de l'analyse, les protéines doivent être hautement purifié et exempt d'activité RNase résiduel, et le tampon de transcription, une matrice d'ADN, etsolution mère de substrats NTP doivent être faites dans DEPC eau traitée. L'utilisation de PNT radioactifs a été décrite dans le présent document, mais les nucléotides fluorescents peuvent également être utilisés 21. La qualité de la matrice d'ADN est essentielle pour la réussite du test de transcription. espacement suffisant entre le promoteur / pause / terminateur doit être inclus, permettant aux différents produits de transcription soient correctement séparés et examinés. Le gel de séquençage doit être correctement versé et le tampon de TBE relativement frais doit être utilisé pour l'électrophorèse pour obtenir la plus haute résolution possible de transcrits d'ARN. Si la dégradation du produit de transcription est constatée, un inhibiteur de la RNase de haute qualité doit être incorporé dans le mélange réactionnel de transcription. Tubes et embouts de pipette doivent être à double autoclave et des gants doivent être portés en tout temps lors de la réalisation du test, afin de minimiser l'introduction de RNase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Obtain the proteins required for transcription assay | |||
| E. coli RNAP | Epicentre | S90250 | |
| Preparation of DEPC-treated water | |||
| diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free water | |||
| Ambion Nuclease-Free Water | ThermoFisher | AM9937 | |
| DNA template preparation | |||
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1330 | |
| ACCUZYME Mix | Bioline | BIO-25028 | |
| PCR primers | |||
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| NanoDrop 3300 fluorospectrometer | Thermo Scientific | ND-3300 | |
| NTP Preparation | |||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| UTP | Sigma-Aldrich | U1006 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G3776 | |
| CTP | Sigma-Aldrich | C9274 | |
| High Purity rNTPs | GE Healthcare | 27-2025-01 | |
| α-32P UTP | PerkinElmer | BLU007C001MC | Radioactive compound |
| RNA ladder preparation | |||
| Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1–1 kb | Millipore | 69003 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| T7 RNAP | Promega | P2075 | |
| Gel preparation | |||
| Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell | Bio-Rad | 165-3804 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U6504 | |
| tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 154563 | |
| boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED | |
| 40% Acrylamide/bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | A9926 | |
| ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Transcription Assay | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | 84020 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Transcription buffer | |||
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Filter paper | |||
| Whatman 3MM Chr Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Radioactive decontaminant | |||
| Decon 90 | decon | decon90 | |
| Gel Treatment | |||
| Typhoon Trio+ imager | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-89 |
References
- Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation. J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).
- Burgess, R. R., Anthony, L. How sigma docks to RNA polymerase and what sigma does. Curr. Opin. Microbiol. 4 (2), 126-131 (2001).
- Gusarov, I., Nudler, E. Control of intrinsic transcription termination by N and NusA: the basic mechanisms. Cell. 107 (4), 437-449 (2001).
- Ha, K. S., Toulokhonov, I., Vassylyev, D. G., Landick, R. The NusA N-terminal domain is necessary and sufficient for enhancement of transcriptional pausing via interaction with the RNA exit channel of RNA polymerase. J. Mol. Biol. 401 (5), 708-725 (2010).
- Yang, X., Lewis, P. J. The interaction between RNA polymerase and the elongation factor NusA. RNA Biol. 7 (3), 272-275 (2010).
- Artsimovitch, I., Henkin, T. M. In vitro approaches to analysis of transcription termination. Methods. 47 (1), 37-43 (2009).
- Decker, K. B., Hinton, D. M. Transcription regulation at the core: Similarities among bacterial, archaeal, and eukaryotic RNA polymerases. Annu. Rev. Microbiol. 67, 113-139 (2013).
- Artsimovitch, I., Vassylyev, D. G. Is it easy to stop RNA polymerase? Cell Cycle. 5 (4), 399-404 (2006).
- Murakami, K. S. Structural biology of bacterial RNA polymerase. Biomolecules. 5 (2), 848-864 (2015).
- Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription as a target for antibacterial drug development. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80 (1), 139-160 (2016).
- Yang, X., Ma, C., Lewis, P. A vector system that allows simple generation of mutant Escherichia coli RNA polymerase. Plasmid. 75, 37-41 (2014).
- Burgess, R. R. A new method for the large scale purification of Escherichia coli deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase. J. Biol. Chem. 244, 6160-6167 (1969).
- Artsimovitch, I., Svetlov, V., Murakami, K. S., Landick, R. Co-overexpression of Escherichia coli RNA polymerase subunits allows isolation and analysis of mutant enzymes lacking lineage-specific sequence insertions. J. Biol. Chem. 278 (14), 12344-12355 (2003).
- Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription inhibitor of RNA polymerase holoenzyme formation by structure-based drug design: From in silico screening to validation. ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016).
- Ma, C., Mobli, M., Yang, X., Keller, A. N., King, G. F., Lewis, P. J. RNA polymerase-induced remodelling of NusA produces a pause enhancement complex. Nucleic Acids Res. 43 (5), 2829-2840 (2015).
- Lewis, P. J., Marston, A. L. GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis. Gene. 227 (1), 101-110 (1999).
- Artsimovitch, I., Landick, R. Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (13), 7090-7095 (2000).
- Vassylyev, D. G., et al. Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 Å resolution. Nature. 417, 712-719 (2002).
- Artsimovitch, I., et al. Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp. Cell. 117 (3), 299-310 (2004).
- Bordier, C. Inhibition of rifampicin-resistant RNA synthesis by rifampicin-RNA polymerase complexes. FEBS lett. 45 (1-2), 259-262 (1974).
- Tang, G. Q., Anand, V. S., Patel, S. S. Fluorescence-based assay to measure the real-time kinetics of nucleotide incorporation during transcription elongation. J. Mol. Biol. 405 (3), 666-678 (2011).
