Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

इन विट्रो प्रतिलेखन Assays और दवाओं की खोज में अपने आवेदन

Published: September 20, 2016 doi: 10.3791/54256
Automatic Translation
1, 1,2
1School of Environmental and Life Sciences, University of Newcastle, 2Department of Applied Biology and Chemical Technology, The State Key Laboratory of Chirosciences, The Hong Kong Polytechnic University

Abstract

इन विट्रो प्रतिलेखन assays विकसित किया गया है और व्यापक रूप से आणविक प्रतिलेखन में शामिल तंत्र का अध्ययन करने के लिए कई वर्षों के लिए इस्तेमाल किया। इस प्रक्रिया को बहु सबयूनिट डीएनए निर्भर शाही सेना पोलीमरेज़ (RNAP) और प्रतिलेखन कारक है कि जीन की अभिव्यक्ति के दौरान RNAP की गतिविधि को व्यवस्थित करने के लिए कार्य की एक श्रृंखला की आवश्यकता है। radiolabeled टेप की अनुक्रमण जेल वैद्युतकणसंचलन पैरामीटर क्या यह प्रभावित कर सकते हैं कि कैसे प्रतिलेखन आय और के बारे में विस्तृत जानकारी यंत्रवत प्रदान करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इस पत्र में हम अध्ययन करने के लिए कैसे आवश्यक बढ़ाव कारक नुसा ट्रांसक्रिप्शनल रोक, साथ ही एक जीवाणुरोधी एजेंट RNAP holoenzyme गठन के निषेध के माध्यम से प्रतिलेखन दीक्षा को निशाना बनाने की पहचान करने के लिए एक विधि को नियंत्रित प्रोटोकॉल का वर्णन। इन विधियों प्रतिलेखन कारक की कार्रवाई की व्यवस्था है जो अभी भी अस्पष्ट रहते हैं, साथ ही नए जीवाणुरोधी एजेंसियों का पता लगाने के लिए अतिरिक्त दृष्टिकोण के विकास के लिए मंच के रूप में एक प्रयोग किया जा सकताटीएस को निशाना प्रतिलेखन जो एंटीबायोटिक अनुसंधान और विकास में एक underutilized दवा लक्ष्य है।

Introduction

ट्रांसक्रिप्शन प्रक्रिया है जिसमें शाही सेना एक विशिष्ट डीएनए टेम्पलेट से संश्लेषित है। कोशिकाओं में तीन अलग RNAPs देखते हैं: RNAP मैं rRNA व्यापारियों transcribes, RNAP द्वितीय mRNA और कुछ छोटे परमाणु आरएनए के संश्लेषण के लिए जिम्मेदार है, और 5 एस rRNA और tRNA के संश्लेषण RNAP III द्वारा किया जाता है। बैक्टीरिया में, वहाँ केवल एक RNAP शाही सेना के सभी वर्गों के प्रतिलेखन के लिए जिम्मेदार है। दीक्षा, बढ़ाव और समाप्ति: वहाँ प्रतिलेखन के तीन चरण हैं। ट्रांसक्रिप्शन सेल में सबसे उच्च विनियमित प्रक्रियाओं में से एक है। प्रतिलेखन चक्र में प्रत्येक चरण में जीन अभिव्यक्ति 1 के नियमन के लिए एक जांच की चौकी का प्रतिनिधित्व करता है। दीक्षा के लिए, RNAP एक सिग्मा कारक के साथ संबद्ध करने के लिए holoenzyme फार्म के लिए है, जो विशिष्ट साइटों के लिए एंजाइम को निर्देशित करने के लिए आवश्यक है एक खुला प्रमोटर जटिल प्रपत्र प्रमोटरों 2 आह्वान किया है। बाद में, प्रतिलेखन कारक के एक बड़े सूट विनियमन ओ के लिए जिम्मेदार हैंबढ़ाव और समाप्ति चरणों के दौरान एफ RNAP गतिविधियों। प्रतिलेखन कारक यहां जांच की अत्यधिक संरक्षित और आवश्यक प्रोटीन, नुसा है। यह rRNA संश्लेषण 3-5 दौरान प्रतिलेखन रोक और समाप्ति, साथ ही विरोधी समाप्ति को विनियमित करने में शामिल है।

इन विट्रो प्रतिलेखन assays प्रतिलेखन 6 दौरान जटिल विनियामक कदमों का अध्ययन करने के लिए शक्तिशाली उपकरण के रूप में विकसित किया गया है। सामान्य में, एक प्रमोटर क्षेत्र सहित डीएनए के एक रेखीय टुकड़ा प्रतिलेखन के लिए टेम्पलेट के रूप में आवश्यक है। डीएनए टेम्पलेट आमतौर पर पीसीआर द्वारा या एक प्लाज्मिड linearizing से उत्पन्न होता है। शुद्ध प्रोटीन और NTPS (पता लगाने के प्रयोजनों के लिए एक radiolabeled एनटीपी सहित) तो जोड़ रहे हैं और उत्पाद ऊष्मायन के लिए जरूरी अवधि के बाद का विश्लेषण किया। उचित टेम्पलेट्स और प्रतिक्रिया की स्थिति का उपयोग करना, प्रतिलेखन के सभी चरणों के इस दृष्टिकोण है जो transcr की विस्तृत आणविक लक्षण वर्णन के लिए सक्षम है का उपयोग कर जांच की गई हैपिछली आधी सदी से अधिक 7 iption। RNAP के 3-आयामी संरचना के बारे में जानकारी के साथ संयोजन में यह भी संभव हो गया है एंटीबायोटिक दवाओं और एंटीबायोटिक सुराग द्वारा प्रतिलेखन निषेध की आणविक तंत्र की जांच, और नए, बेहतर दवाओं 8-10 के विकास में इस जानकारी का उपयोग करने के लिए।

इस काम में हम कैसे प्रतिलेखन assays प्रतिलेखन बढ़ाव / समाप्ति कारक नुसा, और कैसे एक उपन्यास प्रतिलेखन दीक्षा अवरोध नेतृत्व की कार्रवाई की व्यवस्था निर्धारित किया जा सकता द्वारा विनियमन की व्यवस्था का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का उदाहरण देते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सावधानी: प्रयोगों रेडियोधर्मी आइसोटोप 32 पी के इस्तेमाल को शामिल करने और जब तक सभी उचित सुरक्षा स्थितियों से मुलाकात की है कोई काम नहीं किया जाना चाहिए। आम तौर पर कर्मियों को एक सुरक्षा के पाठ्यक्रम में भाग लेने और रेडियोधर्मी अभिकर्मकों का उपयोग प्रयोगों के लिए पहले से निगरानी अभ्यास से गुजरना करने के लिए आवश्यक हैं। कृपया व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनने (thermoluminescent माामापी, सुरक्षा चश्मा, दस्ताने, विकिरण कक्ष प्रयोगशाला कोट, पैंट पूरी लंबाई, बंद पैर के जूते) जब प्रतिक्रिया प्रदर्शन।

1. परख सामग्री की तैयारी

  1. ट्रांसक्रिप्शन परख के लिए प्रोटीन आवश्यक प्राप्त।
    1. प्रयोग यहाँ वर्णित के लिए, overproduce और ई शुद्ध कोलाई RNAP प्रयोगशाला में वर्णित के रूप में 11, या प्राप्त एक वाणिज्यिक स्रोत (माल की सूची) से।
      नोट: दोनों इसी तरह के परिणाम प्रदान करते हैं। देशी या आत्मीयता के लेबल RNAP की शुद्धि के लिए अन्य तरीकों में भी 12,13 इस्तेमाल किया जा सकता है। सिग्मा / नुसा कारकों के रूप में डी प्राप्त किया जा सकतापिछले काम 14,15 में escribed।
  2. Diethyl Pyrocarbonate की तैयारी (DEPC) पानी का इलाज
    नोट: वैकल्पिक रूप से, RNase मुक्त पानी वाणिज्यिक स्रोतों (सामग्री सूची) से प्राप्त किया जा सकता है।
    1. शुद्ध पानी का 1 एल 1 मिलीलीटर diethyl pyrocarbonate (DEPC) जोड़ें (0.1% वी / वी) और रात भर मिश्रण।
    2. आटोक्लेव DEPC पानी और सुझावों को दो बार।
  3. डीएनए खाका तैयार
    1. प्लाज्मिड pSG1154 16 और / या pIA226 17 शुद्ध एक प्लाज्मिड शुद्धि किट (सामग्री सूची) निर्माता के निर्देशों के अनुसार इस्तेमाल करते हैं।
    2. रन ऑफ प्रतिलेखन assays के लिए टेम्पलेट बढ़ाना करने के लिए (360 बीपी टुकड़ा पी xyl प्रमोटर क्षेत्र को शामिल), बर्फ पर एक पीसीआर प्रतिक्रिया इकट्ठा 25 μl 2x पीसीआर मिश्रण (सामग्री सूची) सहित 2 μl प्राइमरों के प्रत्येक (5 माइक्रोन) के : 5'-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3 '(आगे) और 5'-CCCATTAACATCACCATC-3' (रिवर्स), 1 μl pSG1154 प्लाज्मिड जनसंपर्कeparation (250 माइक्रोन) के और 20 μl शुद्ध पानी)।
      1. या वैकल्पिक रूप से, एकल प्रतिलेखन दौर assays के लिए, एक 447 बीपी टुकड़ा pIA226 17 से λ पी आर प्रमोटर क्षेत्र को शामिल बढ़ाना। बर्फ पर एक पीसीआर प्रतिक्रिया 25 μl 2x पीसीआर मिश्रण, 2 μl प्राइमरों के प्रत्येक (5 सुक्ष्ममापी) का उपयोग कर सेट करें: 5'-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 '(आगे) और 5'-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3' (रिवर्स), 1 μl pIA226 17 प्लाज्मिड तैयारी (250 माइक्रोन) के और 20 μl शुद्ध पानी)।
        नोट: इस टेम्पलेट +26 NT स्थिति है, जो प्रतिलेखन शुरू साइट से 26 वें न्यूक्लियोटाइड है जब तक साइटोसिन का अभाव है। इसलिए, प्रतिलेखन इस टेम्पलेट का उपयोग कर दीक्षा, प्रमोटर क्लीयरेंस की अनुमति देगा और +26 NT पर रोकने के लिए एक स्थिर प्रतिलेखन बढ़ाव जटिल (ईसी) के रूप में जब केवल एटीपी, UTP और जीटीपी प्रतिक्रिया में मौजूद हैं।
    3. सेट अप निम्न शर्तों के साथ एक पीसीआर प्रतिक्रिया: 95 °; 30 सेकंड, 50 डिग्री 30 सेकंड के लिए 30 सेकंड के लिए सी, 72 डिग्री सेल्सियस, 30 चक्र के लिए दोहराने के लिए सी।
    4. उत्पाद एक पीसीआर साफ-अप किट (सामग्री सूची) निर्माता के निर्देशों के अनुसार का उपयोग कर शुद्ध और प्रतिलेखन परख के लिए 100 μl प्रतिलेखन बफर में elute।
    5. एक fluorospectrometer (सामग्री सूची) का उपयोग कर टेम्पलेट डीएनए एकाग्रता का निर्धारण।
  4. एनटीपी तैयारी
    नोट: NTPS विभिन्न वाणिज्यिक स्रोतों (सामग्री सूची) से प्राप्त किया जा सकता है।
    1. -20 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 मिलीलीटर ट्यूब (प्रत्येक ट्यूब में 50 μl) और दुकान में 1 एम स्टॉक, विभाज्य समाधान के 1 मिलीलीटर बनाने के लिए DEPC इलाज पानी में NTPS (≥99% शुद्ध) भंग।
    2. आदेश α- 32 पी UTP (3000 सीआइ / mmol) प्रयोग करने से पहले। 32 पी 14.29 दिनों की एक छोटी आधा जीवन है।
      नोट: अल्फा लेबल UTP का उपयोग कर विभिन्न लंबाई के साथ बैंड की तीव्रता की तुलना से बचा जाता है।
  5. शाही सेना सीढ़ी तैयारी
    1. का पालन इकट्ठाकमरे के तापमान पर आईएनजी प्रतिक्रिया: 0.5 माइक्रोग्राम आरएनए खाका मिक्स (माल की सूची), 80 मिमी HEPES बफर PH7.5, 12 मिमी 2 MgCl, 10 मिमी NaCl, 10 मिमी डीटीटी, 2 मिमी एटीपी / सीटीपी / जीटीपी, 0.5 मिमी UTP, 2 20 μl को इलाज DEPC पानी μl α- 32 पी UTP, 0.5 μl T7 RNAP (सामग्री सूची)।
    2. प्रतिक्रिया 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर आगे बढ़ने के लिए अनुमति दें। तुरंत प्रयोग करें या -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

2. शाही सेना अनुक्रमण जेल की तैयारी

  1. जेल तैयारी
    1. एक अनुक्रमण जेल तंत्र (सामग्री सूची) में दो बार 70% इथेनॉल और शुद्ध पानी के साथ से प्लेटें साफ है, और एक कंघी और दो spacers के साथ सेल इकट्ठा।
      ध्यान दें: एक प्लेट 4.2 कदम में जेल हटाने की सुविधा के siliconizing अभिकर्मक (माल की सूची) के साथ लेपित किया जा सकता है।
    2. 22 मिलीलीटर पानी में 33.6 छ यूरिया भंग और 5x Tris / Borate / EDTA (TBE) बफर (54 ग्राम Tris (hydroxymethyl) aminomethane की 16.4 मिलीलीटर; 27.5 छ बोरिक एसिड, 1 एम ethylenediaminetetraacetic एसिड के 10 मिलीलीटर (EDTA), 1 एल पानी में पीएच 7.4) एक चुंबकीय उत्तेजक का उपयोग कर।
    3. (19: 1) 40% एक्रिलामाइड / बीआईएस acrylamide समाधान के 16 मिलीलीटर जोड़ें यूरिया समाधान करने के लिए और एक 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फिल्टर।
    4. 514 μl 10% (डब्ल्यू / वी) छान समाधान करने से 51.4 μl एन, एन, एन ',' एन -Tetramethylethylenediamine (TEMED) का पालन किया पानी में हौसले से तैयार अमोनियम persulfate।
    5. धीरे जेल समाधान पलटना अत्यधिक वातन से बचने और नीचे इंजेक्शन छेद से क्षैतिज स्थिति में पूर्व पैक अनुक्रमण सेल में तुरंत और सुचारू रूप से इंजेक्षन करने के लिए। इंजेक्शन के दौरान बुलबुले बनाने से बचने के लिए ध्यान रखना।
    6. 1-1.5 मानव संसाधन की अनुमति दें जब तक जेल पूरी तरह से एक प्रतिलेखन परख में उपयोग करने से पहले सेट है। जेल में दो या तीन दिनों के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है जब अनुक्रमण सेल के शीर्ष पर पानी गीला ऊतक के साथ लिपटे।

3. प्रतिलेखन प्रतिक्रिया

  1. ट्रांसक्रिप्शन बढ़ाव रोकना परख
    1. एक प्रतिलेखन बढ़ाव परिसर का गठन
      1. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब RNAP कोर एंजाइम (1 माइक्रोन प्रतिलेखन बफर में शेयर) के 1 μl जोड़ें।
      2. RNAP करने के लिए और 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते RNAP holoenzyme फार्म; शुद्ध सिग्मा-70 कारक के 1 μl जोड़ें (प्रतिलेखन बफर में 3 सुक्ष्ममापी शेयर σ 70)।
      3. प्रतिलेखन बफर में 3 μl 500 एनएम शुद्ध टेम्पलेट डीएनए (λ pIA226 पीसीआर उत्पाद से पी आर प्रमोटर) RNAP holoenzyme में जोड़ें और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते खुला जटिल बनाने के लिए।
      4. इलाज किया DEPC में पीएच 7.9 400 मिमी Tris एचसीएल, 1.6 एम KCl, 100 मिमी MgCl 2, 10 मिमी डीटीटी, 50% ग्लिसरॉल,: एक और 1.5 मिलीलीटर 10x प्रतिलेखन बफर के 5 μl (सामग्री सूची का उपयोग कर ट्यूब में प्रतिक्रिया घटकों का एक मिश्रण तैयार करें पानी), 250 माइक्रोन के प्रत्येक जीटीपी और UTP, 1 मिमी एटीपी के 1 μl के 2 μl, और α- 32 पी UTP (3000 सीआइ / mmol) के 1 μl। 41 μl के लिए DEPC इलाज पानी जोड़ें।
        नहींते: RNase अवरोध (सामग्री सूची) RNase प्रदूषण को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
      5. खुले जटिल युक्त ट्यूब मिश्रण समाधान स्थानांतरण और 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते के लिए फार्म का प्रतिलेखन बढ़ाव जटिल NT +26 में बंद कर दिया।
      6. कमरे के तापमान (~ 21 डिग्री सेल्सियस) की प्रतिक्रिया ले जाएँ और 50 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए 2.5 मिलीग्राम / एमएल रिफैम्पिसिन की 1 μl जोड़ें।
      7. 0.1 मिमी प्रतिक्रिया मिश्रण को नुसा शुद्ध के 1 μl जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
      8. 50 μl के अंतिम मात्रा बनाने के लिए और एक टाइमर का उपयोग प्रतिक्रिया समय को मापने के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण में 250 माइक्रोन के सीटीपी के 2 μl जोड़ें।
      9. स्थानांतरण 30 में आरएनए जेल लोड हो रहा बफर (95% formamide, 0.05% bromophenol नीले और 0.05% xylene cyanol) के 2 μl में प्रतिक्रिया समाधान के 5 μl, 60, 120, 240, 480, और 1,200 सेकंड प्रतिक्रिया बुझाने के लिए।
      10. 32 पी UTP सुझाव और एक रेडियोधर्मी कचरे के शेष भाग में ट्यूबों फेकेंainer।
  2. ट्रांसक्रिप्शन दीक्षा परख
    1. ओपन परिसर का गठन
      1. 0.5 माइक्रोन के लिए 70 σ शुद्ध पतला।
      2. दोहराएँ कदम 3.1.1.1 3.1.1.3 0.5 सुक्ष्ममापी (3 सुक्ष्ममापी के बजाय) 70 σ शुद्ध, और डीएनए टेम्पलेट (pSG1154 पीसीआर उत्पाद से P xyl प्रमोटर क्षेत्र) का उपयोग करने के लिए।
    2. प्रतिलेखन दीक्षा परख का निषेध
      1. अवरोध (कदम 3.1.1.1 के बाद) σ 70 के अलावा पहले RNAP कोर एंजाइम को RNAP holoenzyme गठन को रोकने के लिए बनाया गया है, कदम 3.1.1.2 और 3.1.1.3 के द्वारा पीछा जांच करने के लिए है कि क्या अवरोध holoenzyme गठन को बाधित करने में सक्षम है जोड़ें।
      2. वैकल्पिक रूप से, चरण 3.1.1.2 के बाद, जांच करने के लिए है कि क्या यह प्रतिस्पर्धात्मक रूप से 70 RNAP के लिए बाध्य σ को बाधित करने में सक्षम है अवरोध जोड़ें।
      3. अवरोध एस के बजाय DMSO, अवरोध के विलायक का एक ही राशि का उपयोग करें,नियंत्रण प्रतिक्रियाओं में Tock।
    3. प्रतिक्रिया के पूरा होने
      1. -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीग्राम / एमएल और शेयर के एक शेयर एकाग्रता के लिए पानी में हेपरिन भंग।
        नोट: हेपरिन डीएनए के एक प्रतियोगी है कि RNAP कि एक खुली जटिल गठन नहीं किया गया पृथक कर सकते हैं। एक बार खुला जटिल बनाई है, हेपरिन RNAP के डीएनए बाध्यकारी साइट में प्रवेश और पूर्व गठित खुले परिसर से प्रतिलेखन को बाधित नहीं कर सकता। इसलिए, हेपरिन केवल एकल दौर assays के लिए आवश्यक है; यह बहु दौर assays के लिए की जरूरत नहीं है।
      2. 5 μl के 10x प्रतिलेखन बफर (माल की सूची), 1 मिलीग्राम / एमएल हेपरिन समाधान के 1 μl, 10 मिमी प्रत्येक एटीपी, जीटीपी, और CTP, 2.5 मिमी UTP के 1 μl, और α- 32 का 1 μl का उपयोग कर प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें पी UTP (3000 सीआइ / mmol)। 45 μl के लिए DEPC इलाज पानी जोड़ें।
      3. प्रतिलेखन खुले परिसर, नाड़ी स्पिन के साथ प्रतिक्रिया मिश्रण मिलाएं और 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
      4. प्रतिक्रिया के 10 μl स्थानांतरण इसलिएआरएनए जेल लोड हो रहा बफर (95% formamide, 0.05% bromophenol नीले और 0.05% xylene cyanol) के 5 μl में lution प्रतिक्रिया बुझाने के लिए।

4. आरएनए जेल चल रहा है और विकास

  1. Denaturing polyacrylamide जेल रनिंग
    1. जेल का तापमान तक लगभग 1.5 घंटे के लिए 1x TBE बफर में 50 डिग्री सेल्सियस पर जेल और 50 डब्ल्यू चलाने के लिए और बफर 50 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है।
    2. 30 सेकंड के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी के नमूने और उन्हें बर्फ से पहले लोड हो रहा है पर चलते जेल पर।
    3. (: 100 कमजोर पड़ने 1) 2 μl आरएनए सीढ़ी युक्त एक लेन के साथ जेल के शीर्ष पर कुओं में लोड नमूने हैं।
    4. 50 डब्ल्यू और 1x TBE बफर में 50 डिग्री सेल्सियस पर जेल चला जब तक bromophenol नीले रंग की डाई जेल नीचे ~ 2/3 तक पहुँचता है।
  2. जेल उपचार
    1. ओपन धीरे धीरे और सावधानी अनुक्रमण सेल से ऊपरी प्लेट अलग। जेल तोड़ने से बचने के महान ख्याल रखना।
    2. कट chromatograpहरियाणा कागज (माल की सूची) bromophenol नीले रंग की डाई करने के लिए ऊपर से जेल आकार मैच के लिए। radioactively लेबल शाही सेना टेप की अनुमानित स्थिति की पुष्टि के लिए एक काउंटर गीजर का प्रयोग करें।
    3. जब तक जेल फिल्टर पेपर का पालन करता है ध्यान से मजबूती से फिल्टर पेपर के साथ जेल, और प्रेस को कवर किया। कट और रेडियोधर्मी कचरे को जेल के नीचे त्यागने के रूप में अनिगमित NTPS जेल के नीचे है, जो बहुत गर्म किया जा सकता करने के लिए चला रहे हैं।
    4. एक वैक्यूम सुखाने की मशीन के सूखने के बिस्तर पर फिल्टर पेपर के एक समान आकार के टुकड़े प्लेस, और ध्यान से जेल पक्ष के साथ यह पर जेल लेपित कागज रखना।
    5. 1.5 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एक प्लास्टिक की चादर और सूखे के साथ जेल कवर।
    6. प्लास्टिक की चादर के साथ जेल लेपित फिल्टर पेपर के दूसरी ओर लपेटें, और इमेजिंग मामले में एक फोटोस्टिमुलेबल भास्वर प्लेट पर रखें, उचित जोखिम समय है, जो 1 घंटा से भिन्न हो सकते हैं के साथ रात भर प्रतिक्रिया क्षमता पर निर्भर करता है।
    7. छवि का उपयोग कर भास्वर प्लेटएक इमेजर स्कैनर निर्माता के निर्देशों के अनुसार। सॉफ्टवेयर मैनुअल के अनुसार ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग रिश्तेदार बैंड तीव्रता का निर्धारण करें।
    8. , कार्य क्षेत्र में रेडियोधर्मी संदूषण जाँच संदिग्ध वस्तुओं और ऊतक और एक सफाई एजेंट के साथ क्षेत्र पोंछे और निपटान कंटेनर में ऊतक निपटाने के लिए एक काउंटर गीजर का प्रयोग करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ट्रांसक्रिप्शन दक्षता अलग समय बिंदुओं पर बैंड में विकिरण के स्तर को मापने के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। रोक परख सक्षम रोकते हैं, समाप्ति के दृश्य नुसा कारक के समारोह का परीक्षण, और रन दूर उत्पादों (चित्रा 1 ए) के लिए। (नुसा NTD, अमीनो एसिड के अवशेष 1-137) नुसा के एन टर्मिनल डोमेन की उपस्थिति में, आरएनए उत्पादों की उपस्थिति काफी नियंत्रण प्रयोग नुसा कमी की तुलना में देरी हुई। नुसा टुकड़ा, या एमिनो एसिड की एक श्रृंखला के alanine करने के लिए परिवर्तन की अमीनो एसिड के अवशेष 104-137 (हेलिक्स 3) का विलोपन (अवशेषों K36, K37, R104, Q108, K111, Q112, Q116, और R119) पूरा में हुई नुसा ठहराव गतिविधि का नुकसान। हेलिक्स 3 अवशेषों R104 और K111 नुसा NTD ठहराव गतिविधि के लिए और R104A और नियंत्रण जहां नुसा NTD अनुपस्थित था (चित्रा 1 बी) के समान ठहराव आधा जीवन मूल्यों देने K111A निर्माणों के साथ आवश्यक होना दिखाया गया था। आईटी इसHould कुण्डल 3 की कि विलोपन या इन दो एमिनो एसिड के अवशेष के परिवर्तन का उल्लेख किया जा RNAP 15 के लिए बाध्य नुसा पर कोई प्रभाव नहीं है। परिणाम सुझाव दिया है कि R104 और K111 कुंजी अमीनो नुसा ठहराव गतिविधि के नियमन के लिए आवश्यक एसिड थे।

इसी तरह, के रूप में चित्रा 2A में दिखाया गया है, खुराक प्रतिक्रिया वक्र इन विट्रो प्रतिलेखन (बहु दौर) के निषेध एक नव पहचान बैक्टीरियल प्रतिलेखन अवरोध सी 5 14 के विभिन्न सांद्रता का उपयोग कर प्रदर्शन किया। सी 5 परियोजना तर्क से RNAP पर अपने प्रमुख बाध्यकारी साइट के साथ σ 70 की बातचीत को निशाना बनाने से सिलिको स्क्रीन में एक के बाद पहचान की थी दबाना-कुण्डल क्षेत्र 18 का आह्वान किया। प्रतिलेखन प्रतिक्रिया में सी 5 के अलावा के साथ, इस परिसर हिचकते प्रतिलेखन RNAP करने के लिए बाध्य करने के लिए σ 70 के खिलाफ प्रतिस्पर्धा कर सकते हैं, और इस तरह। Mechanistically, सी 5 के अलावा σ के द्वारा पीछा करने के लिए RNAP <sup> प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए 70 कारक प्रयोग RNAP holoenzyme के गठन (चित्रा 2 बी) के बाद सी 5 का उपयोग करने से प्रतिलेखन निषेध के लिए काफी अधिक कुशल था। ये परिणाम दिखा दिया है कि σ 70 विस्थापित सी 5 RNAP के लिए बाध्य नहीं कर सकता है, या कि सी 5 कुशलता σ 70 एक एकल दौर परख में RNAP के लिए बाध्य विस्थापित नहीं कर सका।

आकृति 1
चित्रा 1:। प्रतिलेखन में उत्परिवर्ती नुसा NTD के प्रभाव (ए) नुसा बिना ट्रांसक्रिप्शन ठहराव assays, अवशेषों पर K36, K37 नुसा NTD (+ नुसा), नुसा NTD का उपयोग कर हेलिक्स 3 नष्ट कर दिया (Δ हेलिक्स), और नुसा NTD के साथ alanine प्रतिस्थापन के साथ , R104, Q108, K111, Q112, Q116, और R119 (सभी आला)। पी, ठहराव स्थल; टी, समाप्ति साइट; आरओ, रन दूर। जेल से ऊपर Wedges समय अंक नमूना (0.5, 1, 1.5, 2, 5 और 10 मिनट का प्रदर्शन) 15; (बी) जंगली प्रकार के प्रोटीन को उत्परिवर्ती नुसा NTD रिश्तेदार के आधा जीवन की रोकें गतिविधि। साथ एसडी 3 प्रयोगों की औसत। यह आंकड़ा न्यूक्लिक एसिड रिस से संशोधित किया गया है। 43 (5), 2829-2840 (2015)। यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। यौगिक सी 5 से ट्रांसक्रिप्शन निषेध (ए) ई का निषेध वक्र एक बहु दौर परख 14 में यौगिक सी 5 से कोलाई RNAP प्रतिलेखन। ट्रांसक्रिप्शन का प्रतिशत निषेध सी 5 की एकाग्रता प्रतिक्रिया में इस्तेमाल के खिलाफ एक नियंत्रण (कोई सी 5 वर्तमान) के लिए आरएनए उत्पाद रिश्तेदार द्वारा निर्धारित किया गया था। (बी) के एकल दौर टीआर में यौगिक सी 5 का प्रतिशत निरोधात्मक गतिविधिऔर बाद में (holoenzyme + सी 5, काले) holoenzyme गठन, (ग्रे जटिल + σ 70) से पहले सी 5 के अलावा के साथ anscription assays। यह आंकड़ा एसीएस संक्रमित से संशोधित किया गया है। जिले। 2, 39-46 (2016)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

सभी जीवों में, प्रतिलेखन एक कसकर विनियमित प्रक्रिया है। इन विट्रो प्रतिलेखन assays प्रतिलेखन कारक, छोटे अणुओं और प्रतिलेखन अवरोधकों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए एक मंच प्रदान करने के लिए विकसित किया गया है। इस विधि पत्र में, सामान्य जीवाणु प्रतिलेखन के लिए एक परख वर्णित किया गया था। ट्रांसक्रिप्शन टेप की अनुक्रमण जेल वैद्युतकणसंचलन के साथ संयुक्त assays यंत्रवत अध्ययन के लिए बहुत महत्वपूर्ण हैं क्योंकि वे एक समय के साथ सब प्रतिलेखन उत्पादों के दृश्य की अनुमति। नतीजतन, इस विधि प्रतिक्रिया की स्थिति में मामूली परिवर्तन के प्रभाव की पहचान करने और कार्रवाई का एक प्रशंसनीय तंत्र का खुलासा करने में सक्षम है। इसके अलावा, यह कार्रवाई की अज्ञात तंत्र के साथ प्रतिलेखन कारक के समारोह के संबंध में विशिष्ट प्रतिलेखन assays डिजाइन करने के लिए संभव हो जाता है।

इस पत्र में हम भी विधि का वर्णन किया RNAP holoen के एक अवरोध की कार्रवाई की व्यवस्था की पुष्टि के लिएzyme गठन। विधि यहाँ वर्णित समय के साथ प्रत्येक शाही सेना प्रतिलेख के परिवर्तन प्रदर्शित कर सकते हैं, और उचित संशोधन के साथ के रूप में उपयुक्त प्रतिलेखन के हर कदम के खिलाफ जीवाणुरोधी एजेंटों के परीक्षण सक्षम कर सकते हैं। बहु दौर परख, नए प्रतिलेखन को निशाना अवरोधकों की पहचान के लिए एक रिश्तेदार सरल जांच पद्धति के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि एक दौर परख ऐसे प्रतियोगी / गैर-प्रतिस्पर्धी गुणों के रूप निरोधक, की व्यवस्था का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ध्यान दें कि छोटे आणविक एकत्रीकरण दवाओं की खोज की प्रक्रिया में गैर-प्रतिस्पर्धी अवरोधकों और एक दौर यंत्रवत अध्ययन हिट-टू-लीड मूल्यांकन के लिए एक व्यापक दृष्टिकोण प्रदान कर सकता है के रूप में झूठी सकारात्मक हिट हो सकता है। नतीजतन, यह नियंत्रित प्रतिलेखन प्रक्रिया ठीक खुलासा कैसे एक अवरोध ट्रांसक्रिप्शन, जो युक्तिसंगत नए सिरे से नशीली दवाओं के डिजाइन के साथ मदद कर सकता है प्रभावित करने में सक्षम है। साथ में एक्स-रे क्रिस्टेलोग्राफिक छात्र द्वारा अवरोध बाध्यकारी साइटों पर उच्च संकल्प जानकारी के साथमर जाता है, संरचना के आधार पर तर्कसंगत दवा डिजाइन दवाओं की खोज को निशाना प्रतिलेखन में आवेदन के लिए अत्यधिक उत्तरदायी होगा।

हालांकि उच्च throughput परिणामों में इन विट्रो प्रतिलेखन assays के साथ प्राप्त नहीं किया जा सकता है, वे सटीक प्रतिलेखन के नियंत्रण के साथ जुड़े तंत्र विदारक में अत्यंत उपयोगी होते हैं। घटकों और परख की स्थिति आसानी से व्यक्तिगत जरूरतों के लिए संशोधित किया जा सकता है। विभिन्न कारकों (जैसे, नुसा) 4, 15, छोटे अणुओं (जैसे, ppGpp) 19 और / या प्रतिलेखन अवरोधकों (जैसे, रिफैम्पिसिन) ब्याज की 20 प्रतिलेखन विनियमन में उनके कार्यों का परीक्षण करने के लिए जोड़ा जा सकता है। डीएनए टेम्पलेट को व्यक्तिगत रूप से मजबूत प्रमोटरों, ठहराव अनुक्रम और Terminators से सावधान विकल्प के साथ डिजाइन किया जाना चाहिए। आदेश परख के उच्च reproducibility प्राप्त करने के लिए, प्रोटीन अत्यधिक शुद्ध होना चाहिए और अवशिष्ट RNase गतिविधि से मुक्त, और प्रतिलेखन बफर, डीएनए टेम्पलेट, औरएनटीपी substrates DEPC में किया जाना चाहिए के शेयर समाधान पानी का इलाज किया। रेडियोधर्मी NTPS का उपयोग इस पत्र में वर्णित किया गया था, हालांकि फ्लोरोसेंट न्यूक्लियोटाइड भी 21 नियोजित किया जा सकता है। डीएनए टेम्पलेट की गुणवत्ता प्रतिलेखन परख की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। प्रमोटर / ठहराव / टर्मिनेटर के बीच पर्याप्त अंतर रखने की इजाजत दी विभिन्न प्रतिलेखन उत्पादों ठीक से अलग कर दिया और जांच की जानी करने के लिए शामिल किया जाना चाहिए। अनुक्रमण जेल ठीक से डाला जाना चाहिए और अपेक्षाकृत ताजा TBE बफर वैद्युतकणसंचलन के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए शाही सेना टेप के उच्चतम संभव संकल्प को प्राप्त करने के लिए। प्रतिलेखन उत्पाद की गिरावट देखा जाता है, उच्च गुणवत्ता RNase अवरोध प्रतिलेखन प्रतिक्रिया मिश्रण में शामिल किया जाना चाहिए। ट्यूब और विंदुक युक्तियाँ डबल autoclaved किया जाना चाहिए और जब परख प्रदर्शन दस्ताने हर समय पहना जाना चाहिए, क्रम में RNase की शुरूआत कम करने के लिए।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Obtain the proteins required for transcription assay
E. coli RNAP Epicentre S90250
Preparation of DEPC-treated water
diethyl pyrocarbonate (DEPC)  Sigma-Aldrich  D5758
RNase-free water 
Ambion Nuclease-Free Water ThermoFisher AM9937
DNA template preparation
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System Promega A1330
ACCUZYME Mix Bioline BIO-25028
PCR primers
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System  Promega A9281
NanoDrop 3300 fluorospectrometer Thermo Scientific ND-3300
NTP Preparation
ATP Sigma-Aldrich  A6559
UTP Sigma-Aldrich  U1006
GTP Sigma-Aldrich  G3776
CTP Sigma-Aldrich  C9274
High Purity rNTPs GE Healthcare 27-2025-01
α-32P UTP  PerkinElmer   BLU007C001MC Radioactive compound
RNA ladder preparation 
Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1–1 kb Millipore 69003
HEPES Sigma-Aldrich  H7006
Sodium chloride Sigma-Aldrich  S7653
Magnesium chloride Sigma-Aldrich  M8266
DTT Sigma-Aldrich DTT-RO
T7 RNAP Promega P2075
Gel preparation
Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell  Bio-Rad   165-3804
Sigmacote   Sigma-Aldrich  SL2
urea   Sigma-Aldrich  U6504
tris(hydroxymethyl)aminomethane   Sigma-Aldrich  154563
boric acid  Sigma-Aldrich  B7901
ethylenediaminetetraacetic acid  Sigma-Aldrich  ED
40% Acrylamide/bis-acrylamide  Sigma-Aldrich  A9926
ammonium persulfate  Sigma-Aldrich  A3678
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Transcription Assay
Potassium chloride Sigma-Aldrich  P9541
glycerol   Sigma-Aldrich  G5516
rifampicin   Sigma-Aldrich  R3501
formamide   Sigma-Aldrich  F9037
bromophenol blue  Sigma-Aldrich  B0126
xylene cyanol  Sigma-Aldrich  X4126
heparin  Sigma-Aldrich  84020
RNasin Ribonuclease Inhibitor Promega N2511
Transcription buffer 
Tris base Sigma-Aldrich  T1503
Potassium chloride Sigma-Aldrich  P9541
Magnesium chloride Sigma-Aldrich  M2393
DTT   Sigma-Aldrich  DTT-RO
glycerol   Sigma-Aldrich  G5516
Filter paper
Whatman 3MM Chr Chromatography Paper Fisher Scientific 05-714-5
Radioactive decontaminant
Decon 90 decon decon90
Gel Treatment
Typhoon Trio+ imager GE Healthcare Life Sciences 63-0055-89

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation. J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).
  2. Burgess, R. R., Anthony, L. How sigma docks to RNA polymerase and what sigma does. Curr. Opin. Microbiol. 4 (2), 126-131 (2001).
  3. Gusarov, I., Nudler, E. Control of intrinsic transcription termination by N and NusA: the basic mechanisms. Cell. 107 (4), 437-449 (2001).
  4. Ha, K. S., Toulokhonov, I., Vassylyev, D. G., Landick, R. The NusA N-terminal domain is necessary and sufficient for enhancement of transcriptional pausing via interaction with the RNA exit channel of RNA polymerase. J. Mol. Biol. 401 (5), 708-725 (2010).
  5. Yang, X., Lewis, P. J. The interaction between RNA polymerase and the elongation factor NusA. RNA Biol. 7 (3), 272-275 (2010).
  6. Artsimovitch, I., Henkin, T. M. In vitro approaches to analysis of transcription termination. Methods. 47 (1), 37-43 (2009).
  7. Decker, K. B., Hinton, D. M. Transcription regulation at the core: Similarities among bacterial, archaeal, and eukaryotic RNA polymerases. Annu. Rev. Microbiol. 67, 113-139 (2013).
  8. Artsimovitch, I., Vassylyev, D. G. Is it easy to stop RNA polymerase? Cell Cycle. 5 (4), 399-404 (2006).
  9. Murakami, K. S. Structural biology of bacterial RNA polymerase. Biomolecules. 5 (2), 848-864 (2015).
  10. Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription as a target for antibacterial drug development. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80 (1), 139-160 (2016).
  11. Yang, X., Ma, C., Lewis, P. A vector system that allows simple generation of mutant Escherichia coli RNA polymerase. Plasmid. 75, 37-41 (2014).
  12. Burgess, R. R. A new method for the large scale purification of Escherichia coli deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase. J. Biol. Chem. 244, 6160-6167 (1969).
  13. Artsimovitch, I., Svetlov, V., Murakami, K. S., Landick, R. Co-overexpression of Escherichia coli RNA polymerase subunits allows isolation and analysis of mutant enzymes lacking lineage-specific sequence insertions. J. Biol. Chem. 278 (14), 12344-12355 (2003).
  14. Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription inhibitor of RNA polymerase holoenzyme formation by structure-based drug design: From in silico screening to validation. ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016).
  15. Ma, C., Mobli, M., Yang, X., Keller, A. N., King, G. F., Lewis, P. J. RNA polymerase-induced remodelling of NusA produces a pause enhancement complex. Nucleic Acids Res. 43 (5), 2829-2840 (2015).
  16. Lewis, P. J., Marston, A. L. GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis. Gene. 227 (1), 101-110 (1999).
  17. Artsimovitch, I., Landick, R. Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (13), 7090-7095 (2000).
  18. Vassylyev, D. G., et al. Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 Å resolution. Nature. 417, 712-719 (2002).
  19. Artsimovitch, I., et al. Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp. Cell. 117 (3), 299-310 (2004).
  20. Bordier, C. Inhibition of rifampicin-resistant RNA synthesis by rifampicin-RNA polymerase complexes. FEBS lett. 45 (1-2), 259-262 (1974).
  21. Tang, G. Q., Anand, V. S., Patel, S. S. Fluorescence-based assay to measure the real-time kinetics of nucleotide incorporation during transcription elongation. J. Mol. Biol. 405 (3), 666-678 (2011).

Tags

आनुवंशिकी अंक 115 आण्विक जीवविज्ञान अंक प्रतिलेखन शाही सेना पोलीमरेज़ प्रतिलेखन कारक नुसा सिग्मा कारक जीवाणुरोधी एजेंटों
<em>इन विट्रो</em> प्रतिलेखन Assays और दवाओं की खोज में अपने आवेदन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, X., Ma, C. In Vitro… More

Yang, X., Ma, C. In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery. J. Vis. Exp. (115), e54256, doi:10.3791/54256 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter