Abstract
In vitro transkriptionsanalyser har utvecklats och används i stor utsträckning under många år för att studera de molekylära mekanismer som är involverade i transkription. Denna process kräver flera subenhet DNA-beroende RNA-polymeras (RNAP) och en serie av transkriptionsfaktorer som verkar för att modulera aktiviteten hos RNAP under genuttryck. Sekvense gelelektrofores av radioaktivt märkta transkript används för att ge detaljerad mekanistisk information om hur transkription fortgår och vilka parametrar kan påverka det. I detta dokument beskriver vi protokoll för att studera hur viktig förlängningsfaktor Nusa reglerar transkriptions paus, liksom en metod för att identifiera ett antibakteriellt medel inriktning transkriptionsinitiering genom hämning av RNAP holoenzym bildning. Dessa metoder kan användas en som plattform för utveckling av ytterligare metoder för att undersöka verkningsmekanismen av transkriptionsfaktorer som fortfarande oklar, liksom nya antibakteriella agents inriktning transkription som är en underutnyttjad läkemedelsmål i antibiotikaforskning och utveckling.
Introduction
Transkription är den process i vilken RNA syntetiseras från ett specifikt DNA-mall. I eukaryota celler finns tre olika RNAPs: RNAP I transkriberar rRNA prekursorer är RNAP II ansvarig för syntesen av mRNA och vissa små nukleära RNA och syntes av 5S rRNA och tRNA utförs av RNAP III. I bakterier, finns det bara en RNAP ansvariga för transkriptionen av alla klasser av RNA. Det finns tre stadier av transkription: initiering, förlängning och uppsägning. Transkription är en av de mest reglerade processer i cellen. Varje steg i transkriptionscykeln utgör en kontrollpunkt för reglering av genuttryck 1. För initiering har RNAP att associera med en sigma faktor för att bilda holoenzym, som krävs för att styra enzymet till specifika platser kallas promotorer 2 för att bilda en öppen promotor komplex. Därefter en stor svit av transkriptionsfaktorer är ansvariga för reglering of RNAP aktiviteter under förlängnings och avslutningsfasen. Transkriptionsfaktorn granskas här är mycket konserverat och viktigt protein, Nusa. Det är involverad i regleringen av transkription paus och terminering, liksom anti-terminering under rRNA syntes 3-5.
In vitro transkription analyser har utvecklats som kraftfulla verktyg för att studera de komplexa reglerande åtgärder under transkription 6. I allmänhet är ett linjärt fragment av DNA som innefattar en promotorregion som krävs som mall för transkription. DNA-mallen är vanligtvis genereras genom PCR eller genom linjärisering av en plasmid. Renade proteiner och NTP (inklusive ett radioaktivt märkt NTP för detekteringsändamål) tillsätts sedan och produkten analyserades efter den tid som krävs av inkubation. Med hjälp av lämpliga mallar och reaktionsbetingelser, har alla skeden av transkriptions undersökts med hjälp av denna metod som har möjliggjort detaljerad molekylär karakterisering av transcription under det senaste halvseklet 7. I kombination med information om 3-dimensionella strukturen av RNAP har det också varit möjligt att undersöka den molekylära mekanismen av transkription hämning av antibiotika och antibiotika leder, och använda denna information för att utveckla nya, förbättrade läkemedel 8-10.
I detta arbete har vi ger exempel på hur transkriptionsanalyser kan användas för att bestämma mekanismen för reglering av transkriptions förlängning / avslutningsfaktor Nusa, och hur verkningsmekanismen av en ledning ny transkriptionsinitiering hämmare kan bestämmas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Varning: Experiment innebära användning av den radioaktiva isotopen 32 P och inget arbete bör utföras förrän alla lämpliga säkerhetsvillkor är uppfyllda. Generellt personal skall delta i en säkerhetskurs och genomgår handledd praktik innan experiment med hjälp av radioaktiva reagens. Vänligen bära personlig skyddsutrustning (termoluminiscenta dosimeter, skyddsglasögon, handskar, strålning rum rockar, fullängds byxor, sluten tå skor) när du utför reaktionen.
1. Framställning av analys Material
- Erhålla proteiner som krävs för transkription analys.
- För experimentet som beskrivs här, överproducera och rena E. coli RNAP i laboratoriet som beskrivs 11, eller få från en kommersiell källa (Materials List).
Obs: Båda ger liknande resultat. Andra metoder för rening av nativt eller affinitetsmärkta RNAP kan också användas 12,13. Sigma / nusa faktorer kan erhållas som dbeskrivningen i tidigare arbete 14,15.
- För experimentet som beskrivs här, överproducera och rena E. coli RNAP i laboratoriet som beskrivs 11, eller få från en kommersiell källa (Materials List).
- Framställning av dietylpyrokarbonat (DEPC) behandlat vatten
Obs: Alternativt kan RNas-fritt vatten erhållas från kommersiella källor (Materials List).- Tillsätt 1 ml dietylpyrokarbonat (DEPC) till ett L av renat vatten (0,1% volym / volym) och blandas över natten.
- Autoklav DEPC vatten och tips två gånger.
- DNA-mall Framställning
- Rena plasmiden pSG1154 16 och / eller pIA226 17 användning av en plasmid-reningskit (Materials List) i enlighet med tillverkarens instruktioner.
- Att amplifiera templat för run-off-transkription analyser (en 360 bp-fragment som omfattar P xyl-promotorregionen), montera en PCR-reaktion på is inklusive 25 pl 2x PCR-blandning (Materials List), 2 | il vardera av primrarna (5 | iM) : 5'-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3 '(framåt) och 5'-CCCATTAACATCACCATC-3' (bakåt), 1 pl pSG1154 plasmid preparation (250 uM) och 20 pl renat vatten).
- Eller alternativt, för enskilda, runda transkriptionsanalyser, förstärka en 447 bp fragment som omfattar λ P R-promotorregionen från pIA226 17. Ställa in en PCR-reaktion på is med användning av 25 | j, l 2x PCR-blandning, 2 | il vardera av primrarna (5 | iM): 5'-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 '(framåt) och 5'-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3' (bakåt), 1 | il pIA226 17 plasmid beredning (250 M) och 20 pl renat vatten).
Obs: Denna mall saknar cytosin tills 26 nt-position, som är den 26: e nukleotiden från transkriptionsstartstället. Därför transkription med hjälp av den här mallen kommer att tillåta initiering, promotor clearance och motors vid 26 nt för att bilda en stabil transkription töjning komplex (EG) när endast ATP, UTP och GTP är närvarande i reaktionen.
- Eller alternativt, för enskilda, runda transkriptionsanalyser, förstärka en 447 bp fragment som omfattar λ P R-promotorregionen från pIA226 17. Ställa in en PCR-reaktion på is med användning av 25 | j, l 2x PCR-blandning, 2 | il vardera av primrarna (5 | iM): 5'-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 '(framåt) och 5'-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3' (bakåt), 1 | il pIA226 17 plasmid beredning (250 M) och 20 pl renat vatten).
- Ställa in en PCR-reaktion med följande villkor: 95 °; C under 30 sekunder, 50 ° C under 30 sek, 72 ° C under 30 sek, upprepa under 30 cykler.
- Rena produkten med hjälp av en PCR sanering kit (Materials List) i enlighet med tillverkarens instruktioner och eluera i 100 ^ transkriptionsbuffert för transkriptionsanalysen.
- Bestäm mall DNA-koncentration med hjälp av en fluorospectrometer (Materials List).
- NTP Framställning
Obs: NTP kan erhållas från olika kommersiella källor (Materials List).- Lös upp NTP (≥99% ren) i DEPC-behandlat vatten för att göra en M lager, alikvot 1 ml av lösningen i 1,5 ml rör (50 | il i varje rör) och förvara vid -20 ° C.
- För α- 32 P UTP (3000 Ci / mmol) före experimentet. 32 P har en kort halveringstid på 14.29 dagar.
Obs: Användning av alfa-märkt UTP undviker att jämföra intensiteten av banden med olika längd.
- RNA Ladder Framställning
- Montera following reaktion vid rumstemperatur: 0,5 | j, g RNA mall Mix (Materials List), 80 mM HEPES-buffert pH 7,5, 12 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 10 mM DTT, 2 mM ATP / CTP / GTP, 0,5 mM UTP, 2 l a- 32 P UTP, 0,5 pl T7 RNAP (Materials List), DEPC-behandlat vatten till 20 pl.
- Tillåta reaktionen att fortskrida vid 37 ° C under 1 timme. Använd omedelbart eller förvara vid -80 ° C.
2. Framställning av RNA Sequencing Gel
- gel Framställning
- Rengör plattorna från en sekvense gel apparat (Materials List) två gånger med 70% etanol och renat vatten, och montera cellen med en kam och två distanser.
Obs: En platta kan beläggas med silikonisering reagens (Materials List) för att underlätta gel borttagning i steg 4,2. - Lös upp 33,6 g urea i 22 ml vatten och 16,4 ml av 5x Tris / borat / EDTA (TBE) buffert (54 g tris (hydroximetyl) aminometan; 27,5 g borsyra; 10 ml 1 M etylendiamintetraättiksyra (EDTA), pH 7,4 i 1 L vatten) med användning av en magnetisk omrörare.
- Lägga 16 ml 40% akrylamid / bis-akrylamid-lösning (19: 1) till urealösningen och filtrera genom ett 0,45 pm filter.
- Lägg 514 | il 10% (vikt / vol) nyframställd ammoniumpersulfat i vatten följt av 51,4 ^ il N, N, N ', N-tetrametyletylendiamin (TEMED) till den filtrerade lösningen.
- Vänd försiktigt gellösningen att undvika överdriven luftning och injicera omedelbart och smidigt in i horisontellt färdigförpackade sekvense cellen från botten insprutningshålet. Var noga med att undvika att göra bubblor under injektion.
- Låt 1-1,5 timmar tills gelen är helt inställd före användning i en transkriptionsanalys. Gelén kan förvaras vid rumstemperatur i två eller tre dagar vid lindning med vatten-våt vävnad på toppen av den sekvensecellen.
- Rengör plattorna från en sekvense gel apparat (Materials List) två gånger med 70% etanol och renat vatten, och montera cellen med en kam och två distanser.
3. Transkription Reaktion
- Transkription Töjning pausar Assay
- Bildandet av en transkriptionsförlängning komplex
- Tillsätt 1 pl av RNAP kärnenzym (1 pM stock i transkriptionsbuffert) till ett 1,5 ml rör.
- Tillsätt 1 pl av renad sigma-70 faktor (σ 70; 3 | iM lager i transkriptionsbuffert) till RNAP och inkubera på is under 10 min för att bilda RNAP holoenzym.
- Lägg 3 | il 500 nM renat templat-DNA (λ P R promotorn från pIA226 PCR-produkten) i transkriptionsbuffert till RNAP holoenzym och inkubera vid 37 ° C under 5 min för att bilda den öppna komplexet.
- Framställa en blandning av reaktionskomponenter i en annan 1,5 ml rör med användning av 5 pl av 10 x transkriptionsbuffert (Materials List: 400 mM Tris-HCl, 1,6 M KCl, 100 mM MgCl2, 10 mM DTT, 50% glycerol, pH 7,9 i DEPC-behandlat vatten), 2 | j, l av 250 ^ M av varje GTP och UTP, 1 mikroliter av 1 mM ATP och 1 | il av α- 32 P UTP (3000 Ci / mmol). Lägg DEPC behandlat vatten till 41 pl.
Nejte: RNas-inhibitor (Materials List) kan användas för att minimera RNas kontamination. - Överför blandningen lösningen till röret innehållande den öppna komplexa och inkubera vid 37 ° C i 15 min för att bilda den transkriptionsförlängning komplexet stannade vid 26 nt.
- Flytta reaktionen till rumstemperatur (~ 21 ° C) och tillsätt 1 pl av 2,5 mg / ml rifampicin till en slutlig koncentration av 50 pg / ml.
- Tillsätt 1 pl av 0,1 mM renade nusa till reaktionsblandningen och inkubera i 5 min vid rumstemperatur.
- Tillsätt 2 pl av 250 pM CTP in i reaktionsblandningen för att göra en slutlig volym av 50 | il och mäta reaktionstiden med hjälp av en timer.
- Överföring 5 | il av reaktionslösningen i 2 | il av RNA-gelladdningsbuffert (95% formamid, 0,05% bromfenolblått och 0,05% xylencyanol) vid 30, 60, 120, 240, 480 och 1200 sek för att släcka reaktionen.
- Avyttra de 32p UTP tips och rör i en radioaktivt avfall fortsainer.
- Bildandet av en transkriptionsförlängning komplex
- Transkriptionsinitiering Assay
- Bildandet av den öppna komplexa
- Utspädd renad σ 70-0,5 ^ M.
- Upprepa steg 3.1.1.1 till 3.1.1.3 med användning av 0,5 ^ M (i stället för 3 pM) renat σ 70, och DNA-mallen (P xyl-promotorregionen från pSG1154 PCR-produkt).
- Inhibering av transkriptionsinitiering assay
- Tillsätt hämmare som är framtagen för att förhindra RNAP holoenzym bildning till RNAP kärnenzym före tillsats av σ 70 (efter steg 3.1.1.1), följt av stegen 3.1.1.2 och 3.1.1.3 att undersöka om inhibitorn kan störa holoenzym bildning.
- Alternativt, efter steg 3.1.1.2, tillsätt inhibitor för att undersöka om det är möjligt att kompetitivt hämma σ 70 bindning till RNAP.
- Använda samma mängd DMSO, lösningsmedlet av inhibitorn, i stället för inhibitorn artock i kontrollreaktioner.
- Avslutad reaktion
- Upplösa heparin i vatten till en stamkoncentration av 1 mg / ml och lager vid -20 ° C.
Obs: Heparin är en konkurrent till DNA som kan binda RNAP som inte har bildat en öppen komplex. När den öppna komplexet bildas, kan heparin inte komma in i DNA-bindande platsen för RNAP och hämma transkription från förformade öppen komplex. Därför är heparin endast för en enda runda analyser; det behövs inte för multi-runda analyser. - Bered reaktionsblandningen med användning av 5 pl av 10 x transkriptionsbuffert (Materials List), 1 pl av 1 mg / ml heparinlösning, 1 pl av 10 mM av vardera ATP, GTP och CTP, 2,5 mM UTP och 1 ^ il av α- 32 P UTP (3000 Ci / mmol). Lägg DEPC-behandlat vatten till 45 | il.
- Blanda reaktionsblandningen med transkriptionen öppen komplexet, puls spinn och inkubera vid 37 ° C under 20 min.
- Överföra 10 | il av reaktionen sålution i 5 | il av RNA-gelladdningsbuffert (95% formamid, 0,05% bromfenolblått och 0,05% xylencyanol) för att släcka reaktionen.
- Upplösa heparin i vatten till en stamkoncentration av 1 mg / ml och lager vid -20 ° C.
- Bildandet av den öppna komplexa
4. RNA Gel drift och utveckling
- Kör denaturerande polyakrylamidgel
- Kör gelen vid 50 ° C och 50 W i 1x TBE-buffert under ca 1,5 h tills temperaturen hos gelén och bufferten är stabil vid 50 ° C.
- Värme proverna vid 90 ° C under 30 sekunder och flytta dem på is före laddning på gelén.
- Belastningsprover i brunnarna på toppen av gelén vid sidan en lane innehållande 2 | il RNA-stege (1: 100 spädning).
- Kör gelen vid 50 W och 50 ° C i 1 x TBE-buffert tills bromofenolblått färgämnet når ~ 2/3 ned gelén.
- gel Behandling
- Öppna långsamt och försiktigt separera den övre plattan från sekvensecellen. Noga med att undvika att bryta gelén.
- cut chromatography papper (Materials List) för att matcha gel storlek från toppen till bromofenolblått färgämne. Använda en geigermätare för att bekräfta den ungefärliga positionen av radioaktivt märkta RNA-transkript.
- Noggrant täcka gelen med filterpapper och tryck fast tills gelén fastnar på filterpapper. Skär bort och kasta botten av gelen radioaktivt avfall som icke-registrerade NTP köra till botten av gelén, som kan vara mycket varmt.
- Placera en liknande storlek bit filterpapper på tork bädd av ett vakuum-torkmaskin, och försiktigt lägga gel belagt papper på den med gelén sidan uppåt.
- Täcka gelen med en plastfolie och torka vid 60 ° C under 1,5 h.
- Wrap den andra sidan av gelen belagda filterpapper med plastfolie och lägg på en fotostimulerbara fosforplatta i bild fallet med den lämpliga exponeringstiden, som kan variera från en timme till över natten beroende på reaktionseffektiviteten.
- Bild fosforplattan meden avbildnings Scanner enligt tillverkarens instruktioner. Bestämma den relativa bandintensiteten med hjälp av ImageJ programvara enligt programvaruhandboken.
- Använd en geigermätare för att kontrollera radioaktivitet i arbetsområdet, torka av misstänkta föremål och området med vävnad och rengöringsmedel och avyttra vävnaden i avfallsbehållaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Transkriptionseffektivitet kan bestämmas genom att mäta strålningsnivån vid banden vid olika tidpunkter. Den pausa analys för att testa funktionen av Nusa faktor aktiverat visualisering av paus, uppsägning och avrinning produkter (Figur 1A). I närvaro av den N-terminala domänen av Nusa (nusa NTD; aminosyrarester 1-137), var utseendet av de RNA-produkterna avsevärt fördröjd jämfört med kontrollförsöket saknar nusa. Deletion av aminosyrarester 104-137 (Helix 3) av nusa fragmentet, eller ändring till alanin av en serie av aminosyror (resterna K36, K37, R104, Q108, K111, Q112, Q116, och R119) resulterade i den fullständiga förlust av Nusa paus aktivitet. Helix 3 resterna R104 och K111 visade sig vara avgörande för Nusa NTD paus aktivitet och med R104A och K111A konstruktioner ger liknande paus halveringstid värden till kontrollen där Nusa NTD var frånvarande (Figur 1B). det should noteras att deletion av Helix 3 eller förändring av dessa två aminosyrarester har ingen effekt på nusa bindning till RNAP 15. Resultatet tyder på att R104 och K111 var de viktigaste aminosyror som krävs för reglering av Nusa paus aktivitet.
På liknande sätt, såsom visas i figur 2A, den dos-responskurva demonstrerade hämningen av transkription in vitro (med flera runda) med användning av olika koncentrationer av en nyligen identifierad bakteriell transkriptionshämmare C5 14. C5 identifierades efter en in silico-skärm från projekt till ett rationellt sätt rikta växelverkan mellan σ 70 med sin stora bindningsställe på RNAP kallas Clamp-Helix-regionen 18. Med tillsats av C5 i transkriptionsreaktionen, kan denna förening tävla mot σ 70 för bindning till RNAP, och därmed inhiberade transkription. Mekanistiskt tillsats av C5 till RNAP följt av σ <sup> 70 faktor till reaktionsblandningen var signifikant mer effektiv för transkription inhibering än med experiment med användning C5 efter bildandet av RNAP holoenzym (Figur 2B). Dessa resultat visar att σ 70 inte kunde förskjuta C5 bundet till RNAP, eller kan det C5 inte effektivt förskjuta σ 70 bunden till RNAP i en enda runda analys.
Figur 1:. Effekter av Mutant NUSA NTD i transkription (A) Transkription paus analyser utan Nusa, med hjälp av Nusa NTD (+ NUSA), Nusa NTD med helix 3 utgår (Δ Helix), och Nusa NTD med alaninsubstitutioner vid resterna K36, K37 , R104, Q108, K111, Q112, Q116, och R119 (Alla Ala). P, pausställe; T, termineringsställe; RO, avrinning. Kilar ovanför gelén demonstrerar de tidsprovtagna punkter (0,5, 1, 1,5, 2, 5 och 10 min) 15; (B) Paus aktiviteten av halveringstiderna för mutant nusa NTD förhållande till vildtyp-proteinet. Genomsnitt av 3 experiment med SD. Denna siffra har modifierats Acids Res. 43 (5), 2829-2840 (2015). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Transkription hämning av förening C5 (A) Hämning kurva av E. coli RNAP transkription av förening C5 i en multi-runda analys 14. Procentuell inhibering av transkription bestämdes genom RNA-produkten i förhållande till en kontroll (ingen C5 närvarande) mot koncentrationen av C5 som används i reaktionen. (B) Procent inhibitoriska aktiviteten hos förening C5 i enkla runda transcription analyser med tillsats av C5 före (komplex + σ 70, grå) och efter (holoenzym + C5, svart) holoenzym bildning. Denna siffra har ändrats från ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I alla organismer, är transkription en hårt reglerad process. In vitro transkription analyser har utvecklats för att ge en plattform för att testa effekterna av transkriptionsfaktorer, små molekyler och transkriptionshämmare. I denna metod papper, var en analys för allmän bakteriell transkription beskrivs. Transkriptionsanalyser i kombination med sekvense gelelektrofores av transkript är mycket viktiga för mekanistiska studier eftersom de möjliggör visualisering av alla transkriptionsprodukter längs en tidslinje. Som ett resultat, är denna metod i stånd att identifiera inverkan av mindre ändringar i reaktionsförhållanden och avslöjande en plausibel verkningsmekanism. Dessutom blir det möjligt att utforma specifika transkriptionsanalyser med avseende på funktionen av transkriptionsfaktorer med okända verkningsmekanismer.
I detta papper beskrivs vi också metoden för att bekräfta verkningsmekanismen av en inhibitor av RNAP holoenzyme formation. Den här beskrivna metoden kan visa förändringen av varje RNA-transkript med tiden, och med lämplig modifiering kan göra det möjligt för testning av antibakteriella medel mot varje steg av transkription som är lämpligt. Multi runda analys kan användas som ett relativt enkelt screeningsförfarande för att identifiera nya transkriptions targeting inhibitorer, medan den enda runda analys kan användas för att studera mekanismen för inhibitorer, såsom konkurrerande / icke-kompetitiva egenskaper. Observera att små molekyl aggregation kan orsaka falska positiva träffar som icke-kompetitiva inhibitorer i läkemedelsutvecklingsprocessen och enda runda mekanistiska studier kan ge en övergripande strategi för hit-till-lead utvärdering. Som ett resultat är denna kontrollerade transkriptionsprocess med förmåga att exakt avslöja hur en hämmare påverkar transkription, som kan hjälpa till med rationaliseras de novo läkemedelsdesign. Tillsammans med hög upplösning information om inhibitor bindningsställen av röntgenkristallo studör, struktur-baserad rationell läkemedelsdesign kommer att vara mycket mottaglig för tillämpning inom läkemedelsforskning inriktning transkription.
Även om hög genomströmning resultat inte kan erhållas med in vitro transkriptionsanalyser, de är mycket användbara i att dissekera de exakta mekanismerna i samband med kontroll av transkription. Komponenterna och analysbetingelserna kan lätt modifieras för individuella behov. Olika faktorer (t.ex. Nusa) 4, 15, små molekyler (t.ex. ppGpp) 19 och / eller transkriptionshämmare (t ex rifampicin) 20 av intresse kan tillsättas för att testa sina funktioner i transkriptionsreglering. DNA-mallen ska vara individuellt utformade, med noggrant val av starka promotorer, paussekvens och termineringar. För att uppnå hög reproducerbarhet av analysen, måste proteinerna vara högt renat och fria från rest RNas-aktivitet, och transkriptionsbuffert, DNA-templat, ochstamlösning av NTP substrat måste göras i DEPC-behandlat vatten. Användningen av radioaktiva NTP beskrevs i detta dokument, men fluorescerande nukleotider kan också användas 21. Kvaliteten på DNA-mallen är kritisk för framgången för transkriptionsanalys. Tillräckligt avstånd mellan promotor / paus / terminator måste ingå, vilket gör att de olika transkriptionsprodukter vara ordentligt separeras och undersökas. Sekvense gel måste vara korrekt hälls och relativt färsk TBE-buffert måste användas för elektrofores för att uppnå högsta möjliga upplösning av RNA-transkript. Om nedbrytning av transkriptionsprodukten är märkt, måste högkvalitativa RNas-inhibitor införlivas i transkriptionsreaktionsblandningen. Rör och pipettspetsar måste dubbel autoklaveras och handskar måste användas vid alla tillfällen när du utför analysen, för att minimera införandet av RNas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Obtain the proteins required for transcription assay | |||
| E. coli RNAP | Epicentre | S90250 | |
| Preparation of DEPC-treated water | |||
| diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free water | |||
| Ambion Nuclease-Free Water | ThermoFisher | AM9937 | |
| DNA template preparation | |||
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1330 | |
| ACCUZYME Mix | Bioline | BIO-25028 | |
| PCR primers | |||
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| NanoDrop 3300 fluorospectrometer | Thermo Scientific | ND-3300 | |
| NTP Preparation | |||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| UTP | Sigma-Aldrich | U1006 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G3776 | |
| CTP | Sigma-Aldrich | C9274 | |
| High Purity rNTPs | GE Healthcare | 27-2025-01 | |
| α-32P UTP | PerkinElmer | BLU007C001MC | Radioactive compound |
| RNA ladder preparation | |||
| Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1–1 kb | Millipore | 69003 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| T7 RNAP | Promega | P2075 | |
| Gel preparation | |||
| Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell | Bio-Rad | 165-3804 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U6504 | |
| tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 154563 | |
| boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED | |
| 40% Acrylamide/bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | A9926 | |
| ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Transcription Assay | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | 84020 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Transcription buffer | |||
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Filter paper | |||
| Whatman 3MM Chr Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Radioactive decontaminant | |||
| Decon 90 | decon | decon90 | |
| Gel Treatment | |||
| Typhoon Trio+ imager | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-89 |
References
- Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation. J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).
- Burgess, R. R., Anthony, L. How sigma docks to RNA polymerase and what sigma does. Curr. Opin. Microbiol. 4 (2), 126-131 (2001).
- Gusarov, I., Nudler, E. Control of intrinsic transcription termination by N and NusA: the basic mechanisms. Cell. 107 (4), 437-449 (2001).
- Ha, K. S., Toulokhonov, I., Vassylyev, D. G., Landick, R. The NusA N-terminal domain is necessary and sufficient for enhancement of transcriptional pausing via interaction with the RNA exit channel of RNA polymerase. J. Mol. Biol. 401 (5), 708-725 (2010).
- Yang, X., Lewis, P. J. The interaction between RNA polymerase and the elongation factor NusA. RNA Biol. 7 (3), 272-275 (2010).
- Artsimovitch, I., Henkin, T. M. In vitro approaches to analysis of transcription termination. Methods. 47 (1), 37-43 (2009).
- Decker, K. B., Hinton, D. M. Transcription regulation at the core: Similarities among bacterial, archaeal, and eukaryotic RNA polymerases. Annu. Rev. Microbiol. 67, 113-139 (2013).
- Artsimovitch, I., Vassylyev, D. G. Is it easy to stop RNA polymerase? Cell Cycle. 5 (4), 399-404 (2006).
- Murakami, K. S. Structural biology of bacterial RNA polymerase. Biomolecules. 5 (2), 848-864 (2015).
- Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription as a target for antibacterial drug development. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80 (1), 139-160 (2016).
- Yang, X., Ma, C., Lewis, P. A vector system that allows simple generation of mutant Escherichia coli RNA polymerase. Plasmid. 75, 37-41 (2014).
- Burgess, R. R. A new method for the large scale purification of Escherichia coli deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase. J. Biol. Chem. 244, 6160-6167 (1969).
- Artsimovitch, I., Svetlov, V., Murakami, K. S., Landick, R. Co-overexpression of Escherichia coli RNA polymerase subunits allows isolation and analysis of mutant enzymes lacking lineage-specific sequence insertions. J. Biol. Chem. 278 (14), 12344-12355 (2003).
- Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription inhibitor of RNA polymerase holoenzyme formation by structure-based drug design: From in silico screening to validation. ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016).
- Ma, C., Mobli, M., Yang, X., Keller, A. N., King, G. F., Lewis, P. J. RNA polymerase-induced remodelling of NusA produces a pause enhancement complex. Nucleic Acids Res. 43 (5), 2829-2840 (2015).
- Lewis, P. J., Marston, A. L. GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis. Gene. 227 (1), 101-110 (1999).
- Artsimovitch, I., Landick, R. Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (13), 7090-7095 (2000).
- Vassylyev, D. G., et al. Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 Å resolution. Nature. 417, 712-719 (2002).
- Artsimovitch, I., et al. Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp. Cell. 117 (3), 299-310 (2004).
- Bordier, C. Inhibition of rifampicin-resistant RNA synthesis by rifampicin-RNA polymerase complexes. FEBS lett. 45 (1-2), 259-262 (1974).
- Tang, G. Q., Anand, V. S., Patel, S. S. Fluorescence-based assay to measure the real-time kinetics of nucleotide incorporation during transcription elongation. J. Mol. Biol. 405 (3), 666-678 (2011).
