Abstract
In vitro transkripsiyon analizleri geliştirilmiştir ve yaygın transkripsiyon rol oynayan moleküler mekanizmaları incelemek için yıllardır kullanılmaktadır. Bu işlem, çok-alt-birim DNA-bağımlı RNA polimeraz (rnap) ve gen ekspresyonu ne rnap aktivitesini modüle için harekete transkripsiyon faktörlerinin bir dizi gereklidir. radyoaktif işaretli transkript dizileme jel elektroforezi hangi parametreler bunu nasıl etkilediğini transkripsiyon ilerler ve ayrıntılı mekanistik bilgi vermek için kullanılır. Bu yazıda, esas uzama faktörü nusa transkripsiyonel duraklatma olarak rnap holoenzyme oluşumunun inhibisyonu yoluyla transkripsiyon inisiyasyon hedefleme bir antibakteriyel ajanı tanımlamak için bir yöntem düzenler nasıl çalışma protokol açıklar. Bu yöntemler de tam olarak bilinmemektedir transkripsiyon faktörlerinin etki mekanizması, aynı zamanda, yeni antibakteriyel agen keşfetmek için ilave yaklaşımlar geliştirilmesi için platform olarak kullanılabilirts antibiyotik araştırma ve geliştirme bir atıl ilaç hedefi olan transkripsiyonu hedefleyen.
Introduction
Transkripsiyon, RNA, belirli bir DNA şablonu sentez edildiği bir süreçtir. Ökaryotik hücrelerde üç farklı RNAPs vardır: rnap I rRNA öncüllerini transkripsiyonun rnap II mRNA ve bazı küçük nükleer RNA sentezi için sorumludur ve 5S rRNA ve tRNA sentezi rnap III ile gerçekleştirilir. bakteri, RNA, tüm sınıfları transkripsiyon sorumlu tek bir rnap vardır. başlatma, uzama ve sonlanma: transkripsiyon üç aşaması vardır. Transkripsiyon hücrede en çok düzenlenen süreçlerden biridir. Transkripsiyon döngüsünde Her aşamada gen ifadesinin 1 düzenlenmesi için bir kontrol noktasını temsil eder. Başlatılması için, rnap açık hızlandırıcı kompleks oluşturmak için yükselticiler 2 olarak adlandırılan belirli sitelere enzimi doğrudan gerekli olan, holoenzyme oluşturmak üzere bir sigma faktörü ile bağlanması gerekir. Daha sonra, transkripsiyon faktörleri büyük bir paketi düzenleme o sorumluduruzama ve sonlanma aşamalarında f rnap faaliyetleri. Burada incelenen transkripsiyon faktörü, nusa iyi muhafaza edilen ve temel bir proteindir. Bu rRNA sentezi 3-5 esnasında transkripsiyon duraklatma ve sonlandırma, ve anti-sonlandırma düzenlenmesinde rol oynar.
In vitro transkripsiyon deneyleri transkripsiyon 6 sırasında karmaşık düzenleyici adımlar incelemek için güçlü araçlar olarak geliştirilmiştir. Genel olarak, bir uyarıcı bölge içeren DNA doğrusal fragmanı transkripsiyonu için, şablon olarak gereklidir. DNA şablonu, genellikle PCR ile ya da bir plasmid doğrusallaştırılmış tarafından oluşturulur. Arıtılmış proteinler ve (algılama amaçlı bir radyoetiketlenmiş NTP dahil) NTP'ler eklenmiş ve ürün inkübasyon gerekli dönemini takip eden analiz edilmektedir. uygun şablonları ve reaksiyon koşullan kullanılarak, transkripsiyon tüm aşamaları TRANSCR ayrıntılı moleküler karakterizasyonu sağladı, bu yaklaşım kullanılarak incelenmiştirSon yarım yüzyıl 7 üzerinde iption. Rnap 3-boyutlu yapısı ile ilgili bilgi ile birlikte de antibiyotik ve antibiyotik potansiyel transkripsiyon inhibisyonu moleküler mekanizması prob, ve yeni, iyileştirilmiş ilaç 8-10 geliştirilmesinde bu bilgileri kullanmak mümkün olmuştur.
Bu çalışmada, transkripsiyon deneyleri transkripsiyon uzama / sonlandırma faktörü Nusa ve nasıl yeni bir transkripsiyon başlatma inhibitörü kurşun etki mekanizması tespit edilebilir tarafından düzenlenmesi mekanizmasını belirlemek için nasıl kullanılabileceği örnekler sunmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dikkat: Deneyler radyoaktif izotop 32 P kullanımını içerir ve tüm uygun güvenlik koşulları sağlanana kadar hiçbir çalışma yapılmalıdır. Genellikle personel güvenlik kursuna katılmak ve önceki radyoaktif reaktifler kullanılarak deneylere denetimli uygulama geçmesi gerekmektedir. reaksiyonu yaparken kişisel koruyucu donanımları giyiniz (termolüminesans dozimetre, koruyucu gözlük, eldiven, radyasyon odası laboratuvar mont, tam uzunlukta pantolon, ayakkabı-ayak kapalı).
Deney 1. Malzemenin Hazırlanması
- Transkripsiyon deneyi için proteinler Gerekli elde edin.
- Burada anlatılan deney için, aşırı üretim ve E. arındırmak E. coli rnap laboratuvarda ticari bir kaynaktan (Malzeme Listesi) den 11 anlatıldığı ya da elde olarak.
Not: Her ikisi de benzer sonuçlar vermektedir. Doğal veya afinite etiketli rnap saflaştırılması için diğer metotlar da 12,13 kullanılabilir. Sigma / nusa faktörleri D olarak elde edilebilirBir önceki çalışmalarında 14,15 olarak escribed.
- Burada anlatılan deney için, aşırı üretim ve E. arındırmak E. coli rnap laboratuvarda ticari bir kaynaktan (Malzeme Listesi) den 11 anlatıldığı ya da elde olarak.
- Dietilpirokarbonat hazırlanması (DEPC) ile muamele su
Not: Alternatif olarak, RNaz içermeyen su ticari kaynaklardan (Malzeme listesi) elde edilebilir.- saf su, 1 L 1 ml dietil pirokarbonat (DEPC) ekleyin (0.1% h / h) ve gece boyunca karıştırın.
- İki kez otoklav DEPC su ve ipuçları.
- DNA şablonu hazırlama
- Bir plazmid arındırma kiti, üretici talimatlarına uygun olarak (Malzeme listesi) kullanılarak plazmid pSG1154 16 ve / veya pIA226 17 saflaştınlır.
- Çoğaltma transkripsiyonu deneyleri için şablon yükseltmek için (p ksil promotör bölgesini kapsayan bir 360 bp'lik bir fragmanı), 25 ul 2x PCR karışımı (Malzeme listesi), dahil olmak üzere, buz üzerinde bir PCR reaksiyonu monte 2 ul primerlerin her biri (5 uM) : 5'-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3 '(ileri doğru) ve 5'-CCCATTAACATCACCATC-3' (ters), 1 ul pSG1154 plazmid PRAyırma (250 uM) ve 20 ul arıtılmış, su).
- Veya alternatif olarak, tek bir yuvarlak transkripsiyon analizleri için, pIA226 17'den λ P R promotör bölgesini kapsayan bir 447 bp fragman amplifiye. 25 ul 2x PCR karışımı, 2 ul primerlerin her biri (5 uM) ile buz üzerinde bir PCR reaksiyonu başlatacak: 5'-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 '(ileri doğru) ve 5'-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3' (ters), 1 ul pIA226 17 plazmid preparat (250 uM) ve 20 ul arıtılmış, su).
Not: Bu şablon kopyalama başlangıç sitesinden 26 inci nükleotid 26 nt pozisyonuna kadar sitozin yoksundur. Bu nedenle, transkripsiyon inisiyasyon, promotör açıklığını sağlayacak bu şablonu kullanarak ve sadece ATP, UTP ve GTP reaksiyonunda mevcut olduğunda istikrarlı transkripsiyon uzama kompleksi (EC) oluşturmak için nt +26 at durdurduklarını.
- Veya alternatif olarak, tek bir yuvarlak transkripsiyon analizleri için, pIA226 17'den λ P R promotör bölgesini kapsayan bir 447 bp fragman amplifiye. 25 ul 2x PCR karışımı, 2 ul primerlerin her biri (5 uM) ile buz üzerinde bir PCR reaksiyonu başlatacak: 5'-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 '(ileri doğru) ve 5'-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3' (ters), 1 ul pIA226 17 plazmid preparat (250 uM) ve 20 ul arıtılmış, su).
- aşağıdaki koşullar ile bir PCR reaksiyonu kurmak: 95 °; 30 dakika boyunca tekrar 30 sn, 30 saniye için 30 saniye için 50 ° C, 72 ° C, ısıtılmıştır.
- imalatçının talimatlarına bir PCR temizleme kiti (Malzeme listesi) olarak kullanarak ürünü saflaştırmak ve transkripsiyon tahlilinde 100 ul transkripsiyon tamponu içinde elüte.
- Bir fluorospectrometer (Malzeme Listesi) kullanarak şablon DNA konsantrasyonu belirleyin.
- NTP Hazırlık
Not: NTP'ler farklı ticari kaynaklardan (Malzeme Listesi) elde edilebilir.- -20 ° C'de 1.5 ml tüpler (her bir tüp içinde 50 ul) ve deposuna 1 M stok, kısım solüsyonun 1 mi olmak için DEPC ile muamele edilmiş su içinde (≥99% saf) NTP'leri çözülür.
- Sipariş 32P UTP (3,000 Ci / mmol) deney öncesinde. Α- 32P 14.29 gün gibi kısa bir yarı ömre sahiptir.
Not: a ile etiketlenmiş UTP kullanarak, farklı uzunlukta bantlarının yoğunluğunu karşılaştırarak önler.
- RNA merdiveni hazırlanması
- takip birleştirinOda sıcaklığında ing Reaksiyon: 0.5 ug RNA şablonu karışımı (Malzeme listesi), 80 mM HEPES tamponu pH 7.5, 12 mM MgCl2, 10 mM NaCI, 10 mM DTT, 2 mM ATP / TO / GTP, 0.5 mM UTP, 2 ul 32 P UTP, 0.5 ul T7 rnap (Malzeme listesi), a- 20 ul su DEPC ile tedavi.
- Reaksiyon, 1 saat boyunca 37 ° C 'de devam etmesine izin. hemen kullanın ya da -80 ° C'de saklayın.
RNA sıralaması Gel 2. Hazırlık
- Jel hazırlanması
- Bir sıralama jel aparat iki kez% 70 etanol ve saf su ile (Malzeme Listesi) tabak temizleyin ve bir tarak ve iki ayırıcılar ile hücre birleştirin.
Not: bir plaka Aşama 4.2 jel çıkarılmasını kolaylaştırmak için bir silikonlaştırma reaktifi (Malzeme listesi) ile kaplanabilir. - 22 ml su içinde 33.6 g ürenin çözülmesini ve 5x Tris / borat / EDTA (TBE) tamponu (54 g tris (hidroksimetil) aminometan 16.4 mi, 27.5 g borik asit, 1 M etilendiamintetraasetik asit (10 miManyetik bir karıştırıcı ile EDTA), 1 L su içinde pH 7.4).
- (19: 1)% 40 akrilamid / bis-akrilamid çözeltisi 16 ml ekleyin üre solüsyonuna ve 0.45 um'lik bir filtreden filtre.
- 514 ul% 10 ekleme (a / h), süzüldü çözeltiye 51,4 ul N, N, N ', N' tetrametiletilendiamin (TEMED) takip su içinde taze hazırlanmış amonyum persülfat.
- Yavaşça aşırı havalandırma önlemek ve alt enjeksiyon deliğinden yatay konumlandırılmış önceden paketlenmiş sıralama hücreye hemen ve sorunsuz enjekte jel çözümü ters çevirin. Enjeksiyon sırasında kabarcıkları yapmaktan kaçınmaya özen gösterin.
- Jel tamamen transkripsiyon tayininde kullanılmadan önce ayarlanmış kadar 1-1.5 saat izin verin. dizi hücre üzerine suda ıslak doku ile sarılan jeli, iki ya da üç gün boyunca oda sıcaklığında saklanabilir.
- Bir sıralama jel aparat iki kez% 70 etanol ve saf su ile (Malzeme Listesi) tabak temizleyin ve bir tarak ve iki ayırıcılar ile hücre birleştirin.
3. transkripsiyon reaksiyonu
- Transkripsiyon Uzama duraklatma Deneyi
- bir transkripsiyon uzatma kompleksinin oluşması
- 1.5 ml tüp rnap çekirdek enzim (transkripsiyon tamponu içinde 1 uM stok) 1 ul ekle.
- Rnap ve rnap holoenzyme oluşturmak için 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe (transkripsiyon tamponu içinde 3 uM stok σ 70) saflaştırılmış sigma 70 faktör 1 ul ekle.
- Rnap holoenzyme transkripsiyon tamponu içinde 3 ul 500 mM saflaştınldı hedef DNA (pIA226 PCR ürününden λ P R promoteri) ekleyin ve açık kompleks oluşturmak için 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Işlenmiş DEPC 400 mM Tris-HCI, 1.6 M KCI, 100 mM MgCl2, 10 mM DTT,% 50 gliserol, pH 7.9: 10x transkripsiyon tamponu 5 ul (Malzeme listesi ile başka bir 1.5 ml tüp içinde, reaksiyon bileşenlerinin bir karışımını hazırlamak su), 250 uM her bir GTP ve UTP, 1 mM ATP, 1 ul 2 ul ve α- 32P UTP (3,000 Ci / mmol), 1 ul. 41 ul DEPC arıtılmış su ekleyin.
Yok hayırte: RNaz inhibitörü (Malzeme Listesi) RNaz kontaminasyonu en aza indirmek için kullanılabilir. - Açık kompleksi içeren tüp kanşım çözeltisini transkripsiyon uzatma kompleksi nt +26 durdu oluşturmak için 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- oda sıcaklığında (~ 21 ° C) reaksiyon getirin ve 50 ug / ml'lik nihai bir konsantrasyona kadar 2.5 mg / ml rifampicin 1 ul ekle.
- Reaksiyon karışımına nusa saflaştırılarak 0.1 mM 1 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir.
- 50 ul nihai hacim yapmak ve bir zamanlayıcı, tepkime zamanı ölçmek için, reaksiyon karışımına 250 uM CTP 2 ul ekle.
- Aktarım 5 30 RNA, jel yükleme tampon maddesi (% 95 formamid,% 0.05 bromofenol mavisi ve% 0.05 ksilen siyanol) eklenir ve 2 ul halinde, reaksiyon çözeltisi ul, 60, 120, 240, 480 ve 1200 sn, reaksiyonun sönmesi için.
- Bir radyoaktif atık cont 32 P UTP ipuçları ve tüpler bertaraf edinAiner.
- bir transkripsiyon uzatma kompleksinin oluşması
- Transkripsiyon Başlatma Deneyi
- Açık Kompleksi Oluşumu
- 0.5 uM 70 σ saflaştırılmış sulandırmak.
- Adımları tekrarlayın 3.1.1.1 0.5 mcM (yerine 3 mcM) 70 σ saflaştırılmış ve DNA şablonu (pSG1154 PCR ürününden P ksil promotör bölge) kullanılarak 3.1.1.3 için.
- transkripsiyon başlatma tahlili
- Önleyicisi holoenzyme oluşumunu bozar mümkün olup olmadığını incelemek için Adımlar 3.1.1.2 ve 3.1.1.3 ardından (basamak 3.1.1.1 sonra) a 70 ilavesinden önce rnap çekirdekli enzime rnap holoenzyme oluşumunu önlemek için tasarlanmış inhibitörü ekleyin.
- Seçenek olarak ise, Aşama 3.1.1.2 sonra, rekabetçi rnap bağlanma 70 σ engelleyebildiği olup olmadığını incelemek için önleyici.
- Bunun yerine önleyicisi s, DMSO, inhibitörün aynı miktarda solvent kullanarakKontrol tepkimelerinde tak.
- Reaksiyonun tamamlanması
- -20 ° C'de 1 mg / ml stok, bir stok konsantrasyona su içinde heparin eritin.
Not: Heparin açık kompleksi oluşmuş değil rnap tecrit DNA'nın bir rakip. Açık kompleks oluşturulduktan sonra, heparin rnap DNA bağlama sitesi girerek önceden oluşturulmuş, açık kompleksinden transkripsiyonunu inhibe edilemez. Bu nedenle heparin yalnızca tek tur deneyler için gerekli olan; Çoklu boyunca deneyleri için gerekli değildir. - 5 ul 10x transkripsiyon tamponu (Malzeme listesi), 1 mg / ml heparin solüsyonu 1 uL, 10 mM, her ATP, GTP, CTP, 2.5 mM UTP 1 ul, ve a-32 1 ul tepkime karışım hazırlayın P UTP (3,000 Ci / mmol) eklenir. 45 ul DEPC arıtılmış su ekleyin.
- Transkripsiyon açık kompleksi, darbe dönüş reaksiyon karışımı karıştırın ve 20 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- bu nedenle reaksiyon 10 ul transferRNA, jel yükleme tampon maddesi (% 95 formamid,% 0.05 bromofenol mavisi ve% 0.05 ksilen siyanol) eklenir ve 5 ul içine dökülmesinden, reaksiyonun sönmesi için.
- -20 ° C'de 1 mg / ml stok, bir stok konsantrasyona su içinde heparin eritin.
- Açık Kompleksi Oluşumu
4. RNA Jel Koşu ve Kalkınma
- Denatüre edici poliakrilamid jeli yürütülerek
- jel sıcaklığı kadar yaklaşık 1.5 saat 1x TBE tamponu içinde 50 ºC 'de jel ve 50 W çalıştırın ve tampon 50 ºC de stabildir.
- 30 saniye için 90 ° C'de Isı örnekleri ve jel üzerine buz yüklemeden önce üzerine taşıyın.
- (: 100 dilüsyon 1) 2 ul RNA merdiveni ihtiva eden tek bir şerit ile birlikte jel üstünde kuyu içine yükleyin örnekleri.
- Bromophenol Mavi boya jel aşağı ~ 2/3 ulaşana kadar 1x TBE tamponu 50 W ve 50 ° C'de jel çalıştırın.
- jel Tedavisi
- Açık yavaş ve dikkatli sıralama hücresinden üst plaka ayırın. jel bozulmaması için büyük özen gösteriyoruz.
- kesme kromatografisi yoluhy kağıdı (Malzeme Listesi) bromofenol mavi boya üstten jel boyutuna uyacak şekilde. radyoaktif işaretli RNA transkript yaklaşık konumunu teyit etmek için bir Geiger sayacı kullanın.
- Jel filtre kağıdına yapışır kadar dikkatle sıkıca filtre kağıdı ile jel ve basın kapsar. kesiniz ve adi NTP'ler çok sıcak olabilir jel altına koşmak gibi radyoaktif atıklarla jel alt atın.
- Bir vakumlu kurutma makinesinin kurutma yatakta filtre kağıdı aynı büyüklükte bir parça yerleştirin ve dikkatle jel tarafı yukarı gelecek şekilde bunun üzerine jel kaplı kağıt yatıyordu.
- 1.5 saat boyunca 60 ° C'de bir plastik sargı ve kuru ile jel örtün.
- 1 saat arasında değişebilir uygun pozlama süresi ile, plastik örtü ile kaplı jel filtre kağıdı diğer tarafını sarın ve görüntüleme durumda bir ışığa duyarlı fosfor plaka üzerinde yer gecede reaksiyon verimliliğine bağlı olarak.
- kullanarak fosfor plaka görüntüüreticinin talimatlarına göre bir görüntüleme tarayıcısı. yazılım kılavuzuna göre ImageJ yazılımı kullanarak göreceli bant yoğunluğunu belirlemek.
- , Çalışma alanında radyoaktif kirlenme kontrol doku ve temizlik maddesi ile şüpheli öğeleri ve bölgeyi silin ve bertaraf konteynerine dokuyu imha etmek bir Geiger sayacı kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Transkripsiyon verimi, farklı zaman noktalarında bantlarında radyasyon seviyesini ölçmek suretiyle belirlenebilir. Duraklatma tahlil duraklama, fesih görselleştirme etkin Nusa faktörü işlevi sınamak ve run-off ürünler (Şekil 1A) için. (Nusa NTD, amino asit kalıntıları 1-137) nusa N-terminal alanının varlığında, RNA ürünlerinin görünümünü önemli ölçüde nusa yoksun olan kontrol deneyi ile karşılaştırıldığında gecikmiştir. amino asitler bir dizi alanine nusa fragmanı ya da değiştirilmesi amino asit artıkları 104-137 (helezon 3) delesyonu (artıklar K36, K37, R104, S108, K111, S112, Q116, ve R119) Tam sonuçlandı Nusa duraklama aktivitesinin kaybı. Helix 3 tortuları R104 ve K111 NUSA NTD duraklama aktivitesi için ve R104A ve nusa NTD yoktu kontrol (Şekil 1B) 'e benzer bir duraklama yan-ömür değerlerine veren K111A konstruktları ile önemli olduğu gösterildi. Bu should bu iki amino asit kalıntısının bu Helix 3 silinmesini ya da değişiklik not rnap 15 bağlanma nusa üzerinde hiçbir etkiye sahip olması. Sonuç R104 ve K111 NUSA duraklama etkinliğinin düzenlenmesi için gerekli kilit amino asit olduğunu ileri sürmektedir.
Şekil 2A'da gösterildiği gibi, benzer şekilde, doz-yanıt eğrisi yeni tespit bakteriyel transkripsiyon inhibitörü C5 14 farklı konsantrasyonu kullanılarak in vitro transkripsiyon (çoklu tur) önlenmesini göstermiştir. C5 akılcı rnap günü diğer majör bağlanma yeri ile σ 70 etkileşimini hedef projeden siliko ekranında bir takip tanımlandı Kelepçe-Helix bölgesini 18 çağırdı. Transkripsiyon reaksiyonu içine C5 eklenmesiyle, bu bileşik, bu şekilde inhibe transkripsiyon rnap bağlanma için σ 70 rekabet ve benzeri. Mekanik olarak, C5 eklenmesi σ ardından rnap için <sup> Reaksiyon karışımına 70 faktörü rnap holoenzyme oluşumu (Şekil 2B) sonra, C5 kullanılarak deney daha transkripsiyon engellenmesi için önemli ölçüde daha etkili olmuştur. Bu sonuçlar 70 C5 rnap bağlı veya yerinden olamazdı σ o C5 verimli tek yönlü analizde rnap bağlı σ 70 yerinden olamayacağını gösterdi.
Şekil 1:. K36, K37 artıklarında alanin ikamesine sahip sarmal 3 silindi (Δ Helix), ve Nusa NTD ile Nusa NTD (+ Nusa), Nusa NTD kullanmadan Nusa olmadan transkripsiyon Mutant Nusa NTD Etkileri (A) Transkripsiyon duraklama deneyleri, , R104, S108, K111, S112, Q116, ve R119 (Tüm Ala). P, duraklama sitesi; T, fesih sitesi; RO, koşmak-off. jel üzerinde takozlar örneklendirilen zaman noktalannın (0.5, 1, 1.5, 2, 5 ve 10 dakika göstermektedir) 15; Doğal tipte proteine göre mutant nusa NTD nisbetle yarı ömürleri (B) Durdurma aktivitesi. SD 3 deneyin ortalaması. Bu rakam Nükleik Asitler Res modifiye edilmiştir. 43 (5), 2829-2840 (2015). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. E. bileşiği C5 Transkripsiyon inhibisyon (A) inhibisyon eğrisi Çok yuvarlak deneyinde 14 bileşik C5 coli rnap transkripsiyon. transkripsiyon yüzde inhibisyonu reaksiyonda kullanılan C5 konsantrasyonuna karşı bir kontrol (Resim C5 Mevcut) RNA ürünü nisbetle ile belirlenmiştir. (B) Tek yönlü tr bileşik C5 Yüzde inhibitör etkinliğive sonra (holoenzyme + C5; siyah) holoenzyme oluşumu (gri kompleksi + σ 70) önce C5 ilavesi ile anscription deneyleri. Bu rakam ACS Infect modifiye edilmiştir. Dis. 2, 39-46 (2016). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bütün organizmalarda, transkripsiyon bir sıkı regüle süreçtir. Transkripsiyon analizleri transkripsiyon faktörleri, küçük moleküller ve transkripsiyon inhibitörlerinin etkilerini test etmek için bir platform sağlamak için geliştirilmiştir in vitro. Bu yöntem, bir kağıt, genel bakteriyel transkripsiyon için bir tahlil tanımlanmıştır. Onlar bir zaman çizgisi boyunca tüm transkripsiyon ürünlerinin görselleştirme izin olarak transkript dizi jel elektroforezi ile kombine transkripsiyon analizleri mekanik çalışmalar için çok önemlidir. Bunun bir sonucu olarak, bu yöntem, reaksiyon koşulları, küçük değişiklikler etkisini belirlemek ve bir etki makul bir mekanizmanın ortaya yeteneğine sahiptir. Bundan başka, bu etki bilinmeyen mekanizmalarla transkripsiyon faktörlerinin işlevine ilişkin özel transkripsiyon tahlilleri tasarımı mümkün hale gelir.
Bu yazıda da rnap holoen inhibitörünün etki mekanizması teyit etmek için bir yöntem tarifzyme oluşumu. Burada tarif edilen yöntem, zaman içinde her RNA transkriptinin bir değişim gösterebilir ve uygun modifikasyon ile uygun bir şekilde transkripsiyonu, her adımda karşı antibakteriyel maddelerin test etkinleştirebilir. Tek yuvarlak tahlil gibi rekabetçi / rekabetçi olmayan özellikleri gibi inhibitörlerinin mekanizmasını incelemek için kullanılabilir iken çoklu yuvarlak deneyi, yeni transkripsiyon hedefleyen inhibitörleri tanımlamak için göreceli basit tarama yöntemi olarak kullanılabilir. küçük moleküler toplama rekabetçi olmayan ilaç keşfi sürecinde inhibitörleri ve isabet-potansiyel müşteri değerlendirme için kapsamlı bir yaklaşım sağlayabilir tek yuvarlak mekanik çalışma olarak yanlış pozitif hit neden olabileceğini unutmayın. Bunun bir sonucu olarak, bu kontrol edilen transkripsiyonun işlemi tam olarak bir inhibitör rasyonel de novo ilaç tasarımı yardımcı olabilir transkripsiyonunu nasıl etkilediğini ortaya yeteneğine sahiptir. Birlikte X-ışını kristalografik Stu göre önleyici bağlama sitelerinde yüksek çözünürlüklü bilgileriyapı-tabanlı akılcı ilaç tasarımı ilaç keşfi hedefleyen transkripsiyon uygulama için son derece müsait olacak, ölür.
Yüksek verimli sonuçlar, in vitro kopyalama tahlillerinde elde edilemez olsa da, bunlar transkripsiyon kontrolü ile ilişkili hassas mekanizmaların kesme son derece yararlıdır. komponentler ve tahlil koşulları hali hazırda bireysel ihtiyaçları için modifiye edilebilir. Çeşitli faktörler (örneğin, nusa) 4, 15, küçük moleküller (örneğin, ppGpp) çıkar 20 transkripsiyon düzenlenmesi işlevlerini test etmek için ilave edilebilir 19 ve / veya transkripsiyon inhibitörleri (örneğin, rifampisin). DNA örneğinin tek tek güçlü promotörler, duraklatma sırası ve sonlandırıcılar dikkatli seçimi ile dizayn edilmesi gerekmektedir. tahlilinde, yüksek tekrarlanabilirliği elde etmek için, protein yüksek saflaştırılması gerekir ve artık RNaz etkinliğinin ari ve transkripsiyon tamponu DNA şablonu veDEPC yapılmalıdır NTP substratların stok çözeltisi su ile muamele edilmiş. Radyoaktif NTP'lere kullanımı bu yazıda anlatılan ancak floresan nükleotidler de 21 istihdam edilebilir. DNA şablonu Kalitesi transkripsiyon deneyi başarısı için kritik öneme sahiptir. yükseltici / duraklatma / terminatör arasında yeterli boşluk çeşitli transkripsiyon ürünleri düzgün ayrılmış ve incelenmesi gereken izin dahil edilmelidir. dizileme jeli düzgün dökülmüş olması ve nispeten taze TBE tamponu RNA transkriptlerinin mümkün olan en yüksek çözünürlük elde etmek için elektroforez için kullanılmalıdır. transkripsiyon ürünün bozulması fark edilmesi halinde, yüksek kaliteli RNaz inhibitör transkripsiyon reaksiyon karışımı içinde dahil olmalıdır. Tüpler ve pipet uçları çift otoklava olmalıdır ve tahlil yaparken eldiven RNaz giriş en aza indirmek için, her zaman giyilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Obtain the proteins required for transcription assay | |||
| E. coli RNAP | Epicentre | S90250 | |
| Preparation of DEPC-treated water | |||
| diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free water | |||
| Ambion Nuclease-Free Water | ThermoFisher | AM9937 | |
| DNA template preparation | |||
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1330 | |
| ACCUZYME Mix | Bioline | BIO-25028 | |
| PCR primers | |||
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| NanoDrop 3300 fluorospectrometer | Thermo Scientific | ND-3300 | |
| NTP Preparation | |||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| UTP | Sigma-Aldrich | U1006 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G3776 | |
| CTP | Sigma-Aldrich | C9274 | |
| High Purity rNTPs | GE Healthcare | 27-2025-01 | |
| α-32P UTP | PerkinElmer | BLU007C001MC | Radioactive compound |
| RNA ladder preparation | |||
| Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1–1 kb | Millipore | 69003 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| T7 RNAP | Promega | P2075 | |
| Gel preparation | |||
| Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell | Bio-Rad | 165-3804 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U6504 | |
| tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 154563 | |
| boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED | |
| 40% Acrylamide/bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | A9926 | |
| ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Transcription Assay | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | 84020 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Transcription buffer | |||
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Filter paper | |||
| Whatman 3MM Chr Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Radioactive decontaminant | |||
| Decon 90 | decon | decon90 | |
| Gel Treatment | |||
| Typhoon Trio+ imager | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-89 |
References
- Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation. J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).
- Burgess, R. R., Anthony, L. How sigma docks to RNA polymerase and what sigma does. Curr. Opin. Microbiol. 4 (2), 126-131 (2001).
- Gusarov, I., Nudler, E. Control of intrinsic transcription termination by N and NusA: the basic mechanisms. Cell. 107 (4), 437-449 (2001).
- Ha, K. S., Toulokhonov, I., Vassylyev, D. G., Landick, R. The NusA N-terminal domain is necessary and sufficient for enhancement of transcriptional pausing via interaction with the RNA exit channel of RNA polymerase. J. Mol. Biol. 401 (5), 708-725 (2010).
- Yang, X., Lewis, P. J. The interaction between RNA polymerase and the elongation factor NusA. RNA Biol. 7 (3), 272-275 (2010).
- Artsimovitch, I., Henkin, T. M. In vitro approaches to analysis of transcription termination. Methods. 47 (1), 37-43 (2009).
- Decker, K. B., Hinton, D. M. Transcription regulation at the core: Similarities among bacterial, archaeal, and eukaryotic RNA polymerases. Annu. Rev. Microbiol. 67, 113-139 (2013).
- Artsimovitch, I., Vassylyev, D. G. Is it easy to stop RNA polymerase? Cell Cycle. 5 (4), 399-404 (2006).
- Murakami, K. S. Structural biology of bacterial RNA polymerase. Biomolecules. 5 (2), 848-864 (2015).
- Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription as a target for antibacterial drug development. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80 (1), 139-160 (2016).
- Yang, X., Ma, C., Lewis, P. A vector system that allows simple generation of mutant Escherichia coli RNA polymerase. Plasmid. 75, 37-41 (2014).
- Burgess, R. R. A new method for the large scale purification of Escherichia coli deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase. J. Biol. Chem. 244, 6160-6167 (1969).
- Artsimovitch, I., Svetlov, V., Murakami, K. S., Landick, R. Co-overexpression of Escherichia coli RNA polymerase subunits allows isolation and analysis of mutant enzymes lacking lineage-specific sequence insertions. J. Biol. Chem. 278 (14), 12344-12355 (2003).
- Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription inhibitor of RNA polymerase holoenzyme formation by structure-based drug design: From in silico screening to validation. ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016).
- Ma, C., Mobli, M., Yang, X., Keller, A. N., King, G. F., Lewis, P. J. RNA polymerase-induced remodelling of NusA produces a pause enhancement complex. Nucleic Acids Res. 43 (5), 2829-2840 (2015).
- Lewis, P. J., Marston, A. L. GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis. Gene. 227 (1), 101-110 (1999).
- Artsimovitch, I., Landick, R. Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (13), 7090-7095 (2000).
- Vassylyev, D. G., et al. Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 Å resolution. Nature. 417, 712-719 (2002).
- Artsimovitch, I., et al. Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp. Cell. 117 (3), 299-310 (2004).
- Bordier, C. Inhibition of rifampicin-resistant RNA synthesis by rifampicin-RNA polymerase complexes. FEBS lett. 45 (1-2), 259-262 (1974).
- Tang, G. Q., Anand, V. S., Patel, S. S. Fluorescence-based assay to measure the real-time kinetics of nucleotide incorporation during transcription elongation. J. Mol. Biol. 405 (3), 666-678 (2011).
