Abstract
In - vitro - Transkriptionstests wurden seit vielen Jahren zur Untersuchung der molekularen Mechanismen , die in Transkriptions entwickelt und weit verbreitet. Dieses Verfahren erfordert Multi-Untereinheiten-DNA-abhängige RNA-Polymerase (RNAP), und eine Reihe von Transkriptionsfaktoren, die die Aktivität von RNAP während Genexpression zu modulieren wirken. Sequencing-Gelelektrophorese von radiomarkiertem Transkripte wird verwendet, auf detaillierte mechanistische Informationen zu geben, wie die Transkription und welche Parameter können sie beeinflussen. In diesem Dokument beschreiben wir das Protokoll zu untersuchen, wie die wesentliche Elongationsfaktor NusA Transkriptions Pausieren regelt, sowie ein Verfahren, ein antibakterielles Mittel Targeting Transkriptionsinitiations durch Hemmung der RNAP Holoenzym Bildung zu identifizieren. Diese Verfahren können als eine Plattform für die Entwicklung von zusätzlichen Ansätze verwendet werden, um den Wirkungsmechanismus der Transkriptionsfaktoren zu untersuchen, die noch unklar bleiben, sowie neue antibakterielle agents Targeting Transkription, die ein nicht ausgelastete Medikament Ziel in der Antibiotika-Forschung und Entwicklung ist.
Introduction
Transcription ist der Prozess, in dem RNA von einer spezifischen DNA-Matrize synthetisiert wird. In eukaryotischen Zellen gibt drei verschiedene RNAPs sind: RNAP I transkribiert rRNA Vorläufern ist RNAP II verantwortlich für die Synthese von mRNA und bestimmte kleine nukleare RNAs, und die Synthese von 5S-rRNA und tRNA wird durch RNAP III durchgeführt. In Bakterien, gibt es nur eine RNAP, die für die Transkription aller Klassen von RNA. Es gibt drei Stufen der Transkription: Initiation, Elongation und Termination. Transcription ist eine der am stärksten regulierten Vorgänge in der Zelle. Jede Stufe in der Transkriptionszyklus stellt einen Prüfpunkt für die Regulation der Genexpression 1. Zur Initiierung hat RNAP mit einem Sigma - Faktor zu assoziieren Holoenzym zu bilden, die das Enzym an spezifische Stellen Promotoren genannt 2 zu leiten erforderlich einen offenen Promotorkomplex zu bilden. Anschließend werden eine große Suite von Transkriptionsfaktoren, die für die Regulierung of RNAP Aktivitäten während der Verlängerung und Beendigung Phasen. Der Transkriptionsfaktor hier untersucht ist die hoch konserviert und essentielles Protein, NusA. Es wird bei der Regulierung der Transkription Pausieren und Beendigung, sowie Anti-Abbruch bei rRNA Synthese 3-5 beteiligt.
In - vitro - Transkriptionsassays wurden als leistungsstarke Werkzeuge zur Untersuchung der komplexen regulatorischen Schritte während der Transkription 6 entwickelt. Im allgemeinen wird ein lineares Fragment von DNA, die eine Promotorregion wird als Matrize für die Transkription erforderlich. Die DNA-Matrize wird gewöhnlich erzeugt durch PCR oder durch ein Plasmid linearisieren. Gereinigte Proteine und NTPs (einschließlich eines radioaktiv markierten NTP für Detektionszwecke) werden dann zugegeben und Produkt nach der erforderlichen Inkubationszeit analysiert. Unter Verwendung geeigneter Vorlagen und Reaktionsbedingungen, alle Stufen der Transkription wurden mit diesem Ansatz untersucht, die detaillierte molekulare Charakterisierung von transcr ermöglicht hat,iption im letzten halben Jahrhundert 7. In Kombination mit Informationen über die 3-dimensionale Struktur von RNAP ist es auch möglich, den molekularen Mechanismus der Transkriptionshemmung durch Antibiotika und Antibiotika führt zu untersuchen, und diese Informationen in der Entwicklung neuer, verbesserter Arzneimittel 8-10.
In dieser Arbeit stellen wir Beispiele für Transkriptionsassays verwendet werden können, um den Mechanismus der Regulierung von Transkription Expansions- / Terminationsfaktor NusA, und wie die Wirkungsweise eines neuartigen Transkriptionsinitiationsinhibitor führen zu bestimmen, bestimmt werden.
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Protocol
Achtung: Die Experimente umfassen die Verwendung des radioaktiven Isotops 32 P und keine Arbeit sollte , bis alle entsprechenden Sicherheitsbedingungen erfüllt sind durchgeführt werden. Im Allgemeinen Personal sind verpflichtet, einen Sicherheitskurs zu besuchen und überwachten Praxis vor den Experimenten mit radioaktiven Reagenzien unterzogen werden. Bitte tragen Sie persönliche Schutzausrüstung (Thermolumineszenzdosimeter, Schutzbrille, Handschuhe, Bestrahlungsraum Kitteln, in voller Länge Hosen, geschlossene Schuhe), wenn die Reaktion durchgeführt wird.
1. Herstellung von Assay Materials
- Besorgen Sie sich die Proteine Erforderlich für die Transcription-Test.
- Für die hier beschriebenen Experiment, überproduzieren und E. reinigen coli RNAP im Labor als 11 beschrieben, oder erhalten aus einer kommerziellen Quelle (Materialliste).
Hinweis: Beide ähnliche Ergebnisse liefern. Andere Verfahren zur Reinigung von nativen oder Affinität markierten RNAP kann auch 12,13 verwendet werden. Sigma / NusA Faktoren können als d erhalten werdenescribed 14,15 in früheren Arbeiten.
- Für die hier beschriebenen Experiment, überproduzieren und E. reinigen coli RNAP im Labor als 11 beschrieben, oder erhalten aus einer kommerziellen Quelle (Materialliste).
- Herstellung von Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltem Wasser
Hinweis: Alternativ RNase-freies Wasser kann aus kommerziellen Quellen (Materialliste) erhalten werden.- 1 ml Diethylpyrocarbonat (DEPC) auf 1 l gereinigtem Wasser (0,1% v / v) und über Nacht mischen.
- Autoklav DEPC Wasser und Tipps zweimal.
- DNA-Vorlage Vorbereitung
- Reinige Plasmid pSG1154 16 und / oder pIA226 17 ein Plasmid - Reinigungskits (Materialliste) unter Verwendung von nach den Anweisungen des Herstellers.
- Um die Vorlage für Run-off - Transkriptionsassays (ein 360 - bp - Fragment umfasst den P xyl - Promotor - Region) zu verstärken, bauen sie zusammen eine PCR - Reaktion auf Eis mit 25 ul 2x PCR - Mix (Materialliste), 2 ul jeweils der Primer (5 uM) : 5'-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3 '(vorwärts) und 5'-CCCATTAACATCACCATC-3' (rückwärts), 1 ul pSG1154 Plasmid preparation (250 & mgr; M) und 20 & mgr; l gereinigtes Wasser).
- Oder alternativ, für einzelne Runde Transkriptionsassays, verstärken , um eine 447 - bp - Fragment umfasst die λ P R - Promotorregion von pIA226 17. Richten Sie eine PCR-Reaktion auf Eis unter Verwendung von 25 & mgr; l 2x PCR-Mix, 2 & mgr; l von jedem der Primer (5 uM): 5'-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 '(vorwärts) und 5'-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3' (rückwärts), 1 ul pIA226 17 Plasmidpräparation (250 & mgr; M) und 20 & mgr; l gereinigtes Wasser).
Hinweis: Diese Vorlage Cytosin , bis die 26 nt - Position fehlt, die das 26. Nukleotid von der Transkriptionsstartstelle ist. Daher Transkription unter Verwendung dieser Vorlage Initiierung ermöglichen, Promoter-Clearance und Abwürgen am +26 nt eine stabile Transkriptionselongation-Komplex (EG) zu bilden, wenn nur ATP, UTP und GTP in der Reaktion vorhanden sind.
- Oder alternativ, für einzelne Runde Transkriptionsassays, verstärken , um eine 447 - bp - Fragment umfasst die λ P R - Promotorregion von pIA226 17. Richten Sie eine PCR-Reaktion auf Eis unter Verwendung von 25 & mgr; l 2x PCR-Mix, 2 & mgr; l von jedem der Primer (5 uM): 5'-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 '(vorwärts) und 5'-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3' (rückwärts), 1 ul pIA226 17 Plasmidpräparation (250 & mgr; M) und 20 & mgr; l gereinigtes Wasser).
- Stellen Sie eine PCR-Reaktion mit den folgenden Bedingungen auf: 95 °; C für 30 sec, 50 ° C für 30 sec, 72 ° C für 30 sec, 30 Zyklen wiederholen.
- Reinige das Produkt einer PCR Clean-up Kit (Materialliste) gemäß den Anweisungen des Herstellers und eluieren in 100 & mgr; l Transkriptionspuffer für den Transkriptionsassay.
- Bestimmen Sie die Template-DNA-Konzentration unter Verwendung eines Fluorospektrometer (Materialliste).
- NTP Vorbereitung
Hinweis: NTPs können aus verschiedenen kommerziellen Quellen (Materialliste) erhalten werden.- Man löst NTPs (≥99% rein) in DEPC-behandeltem Wasser zum 1 M Lager, aliquoten 1 ml der Lösung in 1,5-ml-Röhrchen (50 & mgr; l in jedes Röhrchen) und bei -20 ° C.
- Um α- 32 P - UTP (3000 Ci / mmol) vor dem Experiment. 32 P hat eine kurze Halbwertszeit von 14,29 Tage.
Hinweis: Die Verwendung alpha-markiertem UTP vermeidet die Intensität der Bänder mit unterschiedlicher Länge zu vergleichen.
- RNA Ladder Vorbereitung
- Bauen Sie die Folgeing Reaktion bei Raumtemperatur: 0,5 & mgr; g RNA - Matrize Mix (Materialliste), 80 mM HEPES - Puffer pH 7,5, 12 mM MgCl 2, 10 mM NaCl, 10 mM DTT, 2 mM ATP / CTP / GTP, 0,5 mM UTP, 2 ul a- 32 P UTP, 0,5 ul T7 RNAP (Materialliste), Wasser auf 20 & mgr; l DEPC-behandelt.
- Erlauben Reaktion bei 37 ° C für 1 Stunde fortschreiten. Verwenden Sie sofort oder lagern bei -80 ° C.
2. Herstellung von RNA-Sequencing Gel
- Gelzubereitung
- Reinigen Sie die Platten aus einer Sequenzierungs Gelapparatur (Materialliste) zweimal mit 70% Ethanol und gereinigtem Wasser, und montieren Sie die Zelle mit einem Kamm und zwei Abstandshalter.
Hinweis: Eine Platte kann mit Silizierverfahren Reagenz (Materialliste) beschichtet werden, um Gelentfernung in Schritt 4.2 erleichtern. - Man löst 33,6 g Harnstoff in 22 ml Wasser und 16,4 ml 5x Tris / Borat / EDTA (TBE) -Puffer (54 g Tris (hydroxymethyl) aminomethan, 27,5 g Borsäure, 10 ml 1 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), pH 7,4 in 1 l Wasser) mit einem Magnetrührer.
- 16 ml von 40% Acrylamid / Bisacrylamid-Lösung (19: 1) zu der Harnstofflösung und filtriert durch ein 0,45 um-Filter.
- Hinzufügen , 514 & mgr; l 10% (w / v) frisch hergestelltem Ammoniumpersulfat in Wasser , gefolgt von 51,4 ul N, N, N ', N' N' - Tetramethylethylendiamin (TEMED) zu der filtrierten Lösung.
- invertieren vorsichtig die Gel-Lösung zu einer übermäßigen Belüftung vermeiden und injizieren sofort und nahtlos in die horizontal positioniert abgepackten Sequenzierung Zelle aus dem unteren Einspritzloch. Achten Sie darauf, machen Blasen während der Injektion zu vermeiden.
- Lassen Sie 1-1,5 h, bis das Gel vollständig vor der Verwendung in einer Transkription Assay eingestellt ist. Das Gel kann für zwei oder drei Tage bei Raumtemperatur gelagert werden, wenn sie mit wasserfeuchten Gewebe auf der Oberseite der Sequenzierungs Zelle gewickelt.
- Reinigen Sie die Platten aus einer Sequenzierungs Gelapparatur (Materialliste) zweimal mit 70% Ethanol und gereinigtem Wasser, und montieren Sie die Zelle mit einem Kamm und zwei Abstandshalter.
3. Transkriptionsreaktion
- Transkriptionselongation Pausieren Assay
- Die Bildung eines Transkriptions Elongationskomplexes
- 1 ul RNAP Core-Enzym (1 uM Lager in Transkriptionspuffer) in ein 1,5-ml-Röhrchen.
- 1 & mgr; l gereinigtem Sigma-70 - Faktor (σ 70; 3 & mgr; M Lager in Transkriptionspuffer) an die RNAP und Inkubation auf Eis für 10 min RNAP Holoenzym zu bilden.
- Werden 3 ul 500 nM gereinigtem Templat - DNA (λ P R Promotor aus dem pIA226 PCR - Produkt) in Transkriptionspuffer zum RNAP Holoenzym und Inkubieren bei 37 ºC für 5 min die offene Komplex zu bilden.
- Bereiten einer Mischung von Reaktionskomponenten in einem anderen 1,5 ml - Röhrchen unter Verwendung von 5 ul 10fach Transkriptionspuffer (Materialliste: 400 mM Tris-HCl, 1,6 M KCl, 100 mM MgCl 2, 10 mM DTT, 50% Glycerin, pH 7,9 in DEPC behandeltem Wasser), 2 ul 250 uM jedes GTP und UTP, 1 ul 1 mM ATP und 1 ul α- 32 P - UTP (3000 Ci / mmol). In DEPC behandeltem Wasser auf 41 & mgr; l.
Neinte: RNase-Inhibitor (Materialliste) kann verwendet werden, um die RNase Kontamination zu minimieren. - Übertragen Sie die Mischlösung in das Röhrchen des offenen Komplex enthält, und Inkubation bei 37 ° C für 15 min die Transkriptionselongation Komplex zu bilden nt bei +26 gestoppt.
- Bewegen, um die Reaktion auf Raumtemperatur (~ 21 ° C) und füge 1 ul von 2,5 mg / ml Rifampicin zu einer Endkonzentration von 50 ug / ml.
- 1 ul 0,1 mM NusA dem Reaktionsgemisch gereinigt und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur.
- Hinzufügen 2 ul 250 uM CTP in das Reaktionsgemisch ein Endvolumen von 50 ul und zu messen, die Reaktionszeit mit Hilfe eines Timers zu machen.
- Transfer 5 ul der Reaktionslösung in 2 ul Gelladepuffer RNA (95% Formamid, 0,05% Bromphenolblau und 0,05% Xylencyanol) bei 30, 60, 120, 240, 480 und 1.200 sec die Reaktion zu quenchen.
- Entsorgen Sie die 32 P - UTP - Tipps und Rohre in einem radioaktiven Abfällen Fortsetzungainer.
- Die Bildung eines Transkriptions Elongationskomplexes
- Der Transkriptionsinitiations Assay
- Die Bildung des Open-Komplex
- Verdünnter gereinigter σ 70-0,5 uM.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.1.1.1 bis 3.1.1.3 unter Verwendung von 0,5 uM (anstelle von 3 uM) gereinigt σ 70 und die DNA - Matrize (die P xyl - Promotor - Region von pSG1154 PCR - Produkt).
- Hemmung der Transkriptionsinitiations Assay
- Fügen den Inhibitor entwickelt , um RNAP Holoenzym Bildung RNAP Kern Enzym vor der Zugabe von σ 70 (nach Schritt 3.1.1.1), gefolgt von den Schritten 3.1.1.2 und 3.1.1.3 verhindern , zu untersuchen , ob der Inhibitor der Lage ist , Holoenzym Bildung zu stören.
- Alternativ kann nach Schritt 3.1.1.2, fügen Sie den Inhibitor zu prüfen , ob es in der Lage ist zu wettbewerbsfähigen σ 70 hemmen zu RNAP Bindung.
- Verwenden, um die gleiche Menge an DMSO, das Lösungsmittel des Inhibitors, anstelle des Inhibitors stock in Kontrollreaktionen.
- Beendigung der Reaktion
- Man löst Heparin in Wasser zu einer Stammkonzentration von 1 mg / ml und Lager bei -20 ° C.
Hinweis: Heparin ist ein Konkurrent von DNA, die RNAP absondern können, die keinen offenen Komplex gebildet hat. Sobald der offenen Komplex gebildet wird, Heparin kann die DNA-Bindungsstelle von RNAP nicht eingeben und hemmen die Transkription von vorgeformten offenen Komplex. Daher wird Heparin nur für Single-Runde Tests erforderlich; es ist nicht für Multi-Runde Assays benötigt. - Bereiten Sie die Reaktionsmischung unter Verwendung von 5 ul 10fach Transkriptionspuffer (Materialliste), 1 ul 1 mg / ml Heparinlösung, 1 ul 10 mM jeweils ATP, GTP und CTP, 2,5 mM UTP, und 1 ul 32 α- P UTP (3000 Ci / mmol). In DEPC behandeltem Wasser auf 45 & mgr; l.
- Mischen Sie das Reaktionsgemisch mit der Transkription offenen Komplex, Puls Spin und Inkubation bei 37 ° C für 20 min.
- Übertragung von 10 ul der Reaktions sosung in 5 ul Gelladepuffer RNA (95% Formamid, 0,05% Bromphenolblau und 0,05% Xylencyanol), um die Reaktion zu quenchen.
- Man löst Heparin in Wasser zu einer Stammkonzentration von 1 mg / ml und Lager bei -20 ° C.
- Die Bildung des Open-Komplex
4. RNA-Gel-Lauf und Entwicklung
- Das Ausführen des denaturierendes Polyacrylamidgel
- Laufen um das Gel bei 50 ºC und 50 W in 1x TBE-Puffer für etwa 1,5 Stunden, bis die Temperatur des Gels und der Puffer bei 50 ºC stabil.
- Wärme Proben bei 90 ° C für 30 Sekunden und sie auf Eis auf das Gel vor Belastung zu bewegen.
- Laden Sie die Proben in die Vertiefungen auf der Oberseite des Gels neben einer Spur, die 2 & mgr; l RNA-Leiter (1: 100 Verdünnung).
- Führen Sie das Gel bei 50 W und 50 ºC in 1x TBE-Puffer, bis der Bromphenolblau-Farbstoff erreicht ~ 03.02 durch das Gel.
- Gel-Behandlung
- Öffnen Sie langsam und vorsichtig trennen die obere Platte aus der Sequenzierung Zelle. Achten Sie besonders darauf, das Gel zu brechen zu vermeiden.
- Cut chromatography Papier (Materialliste) von oben nach Bromphenolblau Farbstoff die Gelgröße übereinstimmen. Verwenden Sie einen Geigerzähler die ungefähre Position von radioaktiv markierten RNA-Transkripte zu bestätigen.
- Deckel vorsichtig das Gel mit dem Filterpapier, und drücken Sie sie fest, bis das Gel auf das Filterpapier haftet. Abgeschnitten und die Unterseite des Gels zu radioaktivem Abfall entsorgen, da die nicht eingebauten NTPs an der Unterseite des Gels laufen, die sehr heiß werden kann.
- Legen Sie ein ähnlich großes Stück Filterpapier auf dem Trockenbett eines Vakuum-Trocknungsmaschine und sorgfältig legen Sie das Gel beschichteten Papier auf sie mit dem Gel Seite nach oben.
- Decken Sie das Gel mit einer Plastikfolie und trocken bei 60 ° C für 1,5 Std.
- Wickeln Sie die andere Seite des Gels beschichteten Filterpapier mit Plastikverpackung, und legen Sie auf einer photostimulierbaren Phosphorplatte im Abbildungs Fall mit dem entsprechenden Belichtungszeit, die von 1 Stunde variieren kann über Nacht in Abhängigkeit von der Reaktionseffizienz.
- Bild der Leuchtstoffplatte mitImager Abtaster nach den Anweisungen des Herstellers. Zur Ermittlung der relativen Bandenintensität mit ImageJ Software entsprechend dem Software-Handbuch.
- Verwenden Sie einen Geigerzähler die radioaktive Kontamination im Arbeitsbereich zu überprüfen, reinigen Sie die vermuteten Elemente und Bereich mit Gewebe und Reinigungsmittel und entsorgen das Gewebe in dem Entsorgungsbehälter.
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Representative Results
Transkriptionseffizienz kann durch Messen der Strahlungspegel in den Frequenzbändern zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmt werden. Die Pause - Test die Funktion NusA Faktor aktiviert Visualisierung der Pause, Abbruch zu testen und Run-off - Produkte (1A). In der Gegenwart des N-terminalen Domäne von NusA (NusA NTD; Aminosäurereste 1-137), Aussehen der RNA-Produkte war signifikant im Vergleich zu dem Kontrollversuch verzögert fehlt NusA. Deletion der Aminosäurereste 104-137 (Helix 3) des NusA Fragment oder Veränderung zu Alanin aus einer Reihe von Aminosäuren (Reste K36, K37, R104, Q108, K111, Q112, Q116 und R119) führte zur vollständigen Verlust von NusA Pause Aktivität. Helix 3 Reste R104 und K111 wurden gezeigt für NusA NTD Pause Aktivität wesentlich zu sein und mit dem R104A und K111A - Konstrukte , die ähnliche Pause Halbwertswerte an die Steuerung , wo NusA NTD abwesend war (1B). Es should angemerkt werden , dass die Deletion von Helix 3 oder Veränderung dieser beiden Aminosäurereste hat keine Auswirkung auf NusA Bindung an RNAP 15. Das Ergebnis legt nahe, dass R104 und K111 die wichtigsten Aminosäuren für die Regulierung der NusA Pause Aktivität erforderlich waren.
In ähnlicher Weise , wie in 2A gezeigt, ist die Dosis-Wirkungs-Kurve zeigte die Hemmung der in vitro - Transkription (multi-round) unterschiedliche Konzentrationen eines neu identifizierten bakteriellen Transkriptionsinhibitor C5 14 verwendet wird . C5 wurde im Anschluss an eine in silico - Bildschirm von Projekt identifiziert, rational die Interaktion von σ 70 mit seiner Bindungsstelle auf RNAP Ziel genannt Clamp-Helix - Bereich 18. Unter Zusatz von C5 in die Transkriptionsreaktion kann diese Verbindung gegen σ konkurrieren 70 zu RNAP - Bindung und somit gehemmt Transkription. Mechanistisch Zugabe von C5 bis RNAP von σ gefolgt <sup> 70 Faktors zu dem Reaktionsgemisch war signifikant effizienter für Transkriptionshemmung als das Experiment unter Verwendung von C5 nach der Bildung von RNAP Holoenzym (2B). Diese Ergebnisse zeigten , dass σ 70 konnte nicht C5 bis RNAP gebunden verdrängen bzw. daß C5 könnte nicht effizient σ 70 bis RNAP in einer einzigen Runde Assay gebunden verdrängen.
Abb . 1: Auswirkungen von Mutant NusA NTD in der Transkription (A) Transcription Pause Assays ohne NusA, mit NusA NTD (+ NusA), NusA NTD mit Helix 3 gelöscht (Δ Helix) und NusA NTD mit Alanin - Substitutionen an den Resten K36, K37 , R104, Q108, K111, Q112, Q116 und R119 (Alle Ala). P, Pausenstelle; T, Anschließungsstelle; RO, Run-off. Keile über dem Gel zeigen die Zeitpunkte abgetastet (0,5, 1, 1,5, 2, 5 und 10 min) 15; (B) Pause Aktivität der Halbwertzeiten von mutierten NusA NTD im Vergleich zu Wildtyp - Protein. Durchschnitt von 3 Versuchen mit SD. Diese Zahl wurde von Nucleic Acids Res modifiziert. 43 (5), 2829-2840 (2015). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2:. Transcription Hemmung durch Verbindung C5 (A) Hemmung Kurve von E. coli RNAP Transkription durch Verbindung C5 in einer Mehrrunden - Assay 14. Die prozentuale Hemmung der Transkription durch die RNA-Produkt relativ zu einer Kontrolle (kein C5 vorhanden) gegen die Konzentration von C5 in der Reaktion verwendet wurde. (B) Prozent inhibitorische Aktivität der Verbindung C5 in single-round transcription Assays mit Zusatz von C5 vor (Komplex + σ 70; grau) und nach (Holoenzym + C5; schwarz) Holoenzym Bildung. Diese Zahl wurde von ACS Infect modifiziert. Dis. 2, 39-46 (2016). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
In allen Organismen ist die Transkription eines stark regulierten Prozess. In vitro Transkriptionsassays eine Plattform zum Testen der Wirkung von Transkriptionsfaktoren, kleine Moleküle und Transkriptionsinhibitoren bereitzustellen , wurden entwickelt. Bei diesem Verfahren wird Papier, wurde ein Test für die allgemeine bakterielle Transkriptions beschrieben. Transkriptionsassays mit Sequenzierung Gelelektrophorese von Transkripten kombiniert sind sehr wichtig für mechanistische Studien, wie sie Visualisierung aller Produkte entlang einer Zeitleiste Transkription ermöglichen. Als Ergebnis ist dieses Verfahren in der Lage, den Einfluss von geringfügigen Änderungen in den Reaktionsbedingungen zu identifizieren und einen plausiblen Wirkungsmechanismus offenbart. Darüber hinaus wird es möglich, spezifische Transkriptionsassays hinsichtlich der Funktion von Transkriptionsfaktoren mit unbekanntem Wirkmechanismen zu entwerfen.
In diesem Papier beschrieben wir auch das Verfahren den Wirkungsmechanismus eines Inhibitors von RNAP holoen zu bestätigenZyme Bildung. Das hier beschriebene Verfahren kann mit der Zeit und mit einer geeigneten Modifikation die Änderung jedes RNA-Transkript zeigen die Prüfung der antibakteriellen Mitteln gegen jeden Schritt der Transkription entsprechend aktivieren. Der Mehrrunden-Assay kann als ein relativ einfaches Screening-Verfahren verwendet werden, um neue Transkriptions Targeting-Inhibitoren zu identifizieren, während die einzelnen runden Assay verwendet werden kann, um den Mechanismus der Inhibitoren, wie Wettbewerbs / nicht-kompetitive Eigenschaften zu studieren. Beachten Sie, dass kleine molekulare Aggregation falsch-positive Treffer als nicht-kompetitive Inhibitoren in der Drug Discovery-Prozess und der einzigen Runde mechanistische Studie einen umfassenden Ansatz kann dazu führen, zur Auswertung Hit-to-Lead bereitstellen. Als Ergebnis ist diese kontrollierte Transkriptionsprozess genau enthüllt Lage , wie ein Inhibitor wirkt Transkription, die mit rationalisiert de novo drug design helfen kann. Zusammen mit einem hochauflösenden Informationen über Inhibitor Bindungsstellen durch röntgenkristallographische stustirbt, strukturbasiertes rationales Wirkstoffdesign für die Anwendung in der Wirkstoffforschung Targeting Transkription sehr zugänglich sein wird.
Obwohl Hochdurchsatz - Ergebnisse können nicht mit in vitro Transkriptions - Assays erhalten werden, sind sie extrem nützlich bei der genauen Mechanismen , mit der Steuerung der Transkription zugeordnet sezieren. Die Komponenten und Testbedingungen könnten leicht für individuelle Bedürfnisse angepasst werden. Verschiedene Faktoren (zB NusA) 4, 15, kleine Moleküle (zB ppGpp) 19 und / oder Transkriptions - Inhibitoren (zB Rifampicin) 20 von Interesse hinzugefügt werden können , ihre Funktionen in die Transkriptionsregulation zu testen. Die DNA-Vorlage sollte individuell gestaltet werden, mit einer sorgfältigen Auswahl von starken Promotoren, Pause-Sequenz und Terminatoren. Um eine hohe Reproduzierbarkeit des Tests zu erreichen, müssen Proteine hoch gereinigt und frei von Rest RNase-Aktivität, die Transkriptionspuffer, DNA-Template, undStammlösung von NTP Substrate müssen in DEPC behandelt werden Wasser. Die Verwendung von radioaktiven NTPs wurde in diesem Papier beschrieben, jedoch fluoreszierende Nucleotide können auch 21 verwendet werden. Qualität der DNA-Matrize ist entscheidend für den Erfolg der Transkriptionsassay. Ausreichenden Abstand zwischen dem Promotor / Pause / Terminator muss enthalten sein, die verschiedenen Transkriptionsprodukte ermöglicht richtig getrennt und untersucht werden. Die Sequenzierung Gel müssen ordnungsgemäß gegossen und relativ frisch TBE-Puffer muss für die Elektrophorese verwendet werden höchstmögliche Auflösung von RNA-Transkripte zu erreichen. Wenn Abbau von Transkriptionsprodukt bemerkt wird, muss eine hohe Qualität RNase-Inhibitor in der Transkriptionsreaktionsmischung eingebracht werden. Rohre und Pipettenspitzen müssen doppelt autoklaviert und Handschuhe müssen jederzeit getragen werden, wenn der Test durchgeführt wird, um Einführung von RNase zu minimieren.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Obtain the proteins required for transcription assay | |||
| E. coli RNAP | Epicentre | S90250 | |
| Preparation of DEPC-treated water | |||
| diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free water | |||
| Ambion Nuclease-Free Water | ThermoFisher | AM9937 | |
| DNA template preparation | |||
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1330 | |
| ACCUZYME Mix | Bioline | BIO-25028 | |
| PCR primers | |||
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| NanoDrop 3300 fluorospectrometer | Thermo Scientific | ND-3300 | |
| NTP Preparation | |||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| UTP | Sigma-Aldrich | U1006 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G3776 | |
| CTP | Sigma-Aldrich | C9274 | |
| High Purity rNTPs | GE Healthcare | 27-2025-01 | |
| α-32P UTP | PerkinElmer | BLU007C001MC | Radioactive compound |
| RNA ladder preparation | |||
| Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1–1 kb | Millipore | 69003 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| T7 RNAP | Promega | P2075 | |
| Gel preparation | |||
| Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell | Bio-Rad | 165-3804 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U6504 | |
| tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 154563 | |
| boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED | |
| 40% Acrylamide/bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | A9926 | |
| ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Transcription Assay | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | 84020 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Transcription buffer | |||
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Filter paper | |||
| Whatman 3MM Chr Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Radioactive decontaminant | |||
| Decon 90 | decon | decon90 | |
| Gel Treatment | |||
| Typhoon Trio+ imager | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-89 |
References
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