Introduction
Верхнее веко человек выполняет около 10000 мигает каждый день 1, с помощью всего 1 - 2 мм узкая область конъюнктивы глазного противостояния миру. Из - за его движения протирки во время миганий, а эта часть края крышки было названо "крышка стеклоочистителя" область 2. Предполагается, что трение увеличивается в этом регионе во время привычного миганием, благодаря крышке очищающего по всему земному шару. Это может играть существенную роль в глазном комфорте. Кто носит контактные линзы , в частности , опыт глазного дискомфорта , и это является одной из главных причин прекращения ношения линз 3. Когда контактная линза находится на глазу, коэффициент трения между материалом линзы и поверхностью глазного яблока было показано , что изменение 4. Существует доказательство того, чтобы предположить , что симптомы сухости может быть связано с этим измененном трения 2,5,6.
Эта ассоциация также может быть отражено в клинически наблюдаемых явлений, в частности, крышка Wiза эпителиопатии (LWE), также называемая верхняя крышка Маржа окрашивания (ULMS) 6. LWE является ранним признаком раздражения глаз и потенциальным прогностическим для сухой глазной болезни. Наблюдается и измеряется витального окрашивания верхнего и нижнего края областей крышки. Хотя эта система классификации 2 и его клиническая обоснованность (т.е., корреляция с субъективными симптомами) , все еще в стадии обсуждения, глазного дискомфорта остается загадкой для врачей и ученых , так и, что самое главное, неудобство для пациентов.
На сегодняшний день, мало известно о клинически релевантных вариантов в (суб-) клеточной анатомии и физиологии стеклоочистителя области крышки 7 и только один отчет использует цитологических методов 8. Впечатление цитологии (IC) был принят на работу в течение более 40 лет , чтобы собрать клетки из эпителиальной поверхности бульбарных или предплюсны конъюнктивы путем применения мембраны 9,10. После удаления прилипшие клетки претерпевают Cytological окрашивание и микроскопические изображения. Из-за анатомических и клеточных различий в обтирочного области крышки, этот метод требует оптимизации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этика заявление: До сбора клеток из человеческих субъектов, информированное согласие и должно быть получено одобрение этикой.
1. Подготовить Stain
Примечание: Подготовить пятно на день эксперимента.
- Добавьте 5 мкл этидий (или 4 мкМ) и 5 мкл кальцеином AM (или 4 мкМ) до 2,5 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) в 15 мл центрифужную пробирку; смешивание. Оберните алюминиевой фольгой, чтобы защитить от света и хранить при комнатной температуре до использования.
2. Отобрать клетки
- Удалите культуры клеток вставки из их упаковки и этикетки для каждого веко должны быть взяты пробы. Отметить ориентацию сбора клеток на стороне мембраны пластикового держателя с помощью перманентным маркером. Провести осмотр щелевой лампы при умеренном увеличении (приблизительно 20Х) для подтверждения надлежащего здоровья региона пройти IC.
- Разлить одну каплю местного анестетика (0,5% пропаракаина гидрохлорид) в нижний конъюнктивальный мешок еач глаз и инструктировать участника, чтобы держать глаза закрытыми в течение одной минуты.
- Эверт верхняя крышка глаза и удерживать на месте по ресницам; избегать любого контакта с областью крышки стеклоочистителя.
Дополнительно: помощь вторичного исследователя может потребоваться для выполнения этого шага. - Применение мембраны перпендикулярно к поверхности центральной части обтирочного области крышки с минимальным давлением.
- Держите мембрану в месте в течение 3 - 5 сек. Обратите внимание на мембраны становятся полупрозрачными в зоне контакта. На данный момент, аккуратно удалить мембрану и разрешить крышку участника, чтобы "перевернуть" обратно на место.
- Оперативно применять одну каплю PBS на образце, чтобы предотвратить его от высыхания. Мембрана повернет полупрозрачным и не превращалась непрозрачным в любое время, так как это указывает на то сушку. Есть вторичный следователь немедленно приступить с обработкой образцов (раздел 3).
- Провести окончательную проверку глаз, чтобы обеспечить целостность конъюнктивы. Разлить окуляр смазки и инструктировать участниковчтобы избежать потирают глаза, пока обезболивающий эффект не спадет (примерно 15 мин.).
3. Обработка проб
- С помощью микро-ножницы, разрезать мембрану пополам (одна половина для каждой из последующих анализов), перпендикулярно через середину сбора клеток. Сокращение вдоль наружного края одной мембраны половины, чтобы отделить его от пластикового держателя; избежать взаимодействия с собранными клетками на мембране, в том числе обеспечение того, чтобы мембрана не сгиб на себя.
- Закрепите мембрану пинцетом до полного отсоединения от держателя. Поместите мембрану в меченой 2 мл центрифужную пробирку, содержащую 500 мкл 95% (об / об) этанола и оставляют для фиксации в течение минимум 20 минут до максимум 2 ч до обработки (раздел 4.2).
- Сразу же отдельная вторая половина мембраны (как описано в разделе 3.2) и незамедлительно приступить к разделу 4.1.
4. Образец Окрашивание
- Immunocytochemiкал Окрашивание
- Осторожно поместите мембрану в 35 мм со стеклянным дном культуры блюдо с коллекцией стороной вниз; обеспечить мембрана является плоской.
- Внесите 20 мкл Иммуноцитохимическую пятна состава собранной в секции 1 на мембране. Если образец сворачивается, использовать одноразовые наконечники пипеток тщательно выравнивать мембрану, нажав ее края вниз. Избегать контакта с участками сбора клеток.
- Аккуратно покрыть мембрану с покровным стеклом. Избегайте ненужного движения образца. Накройте блюдо с крышкой и запечатывают с лабораторным пленкой по краям. Не загромождать прозрачность посуды (сверху и снизу) и видимость образца. Этикетка с лабораторным маркером.
- Немедленно приступить к визуализации (раздел 5.1), а затем вернуться к разделу 4.2, чтобы продолжить цитологического окрашивания другой половины мембраны.
- Цитологические Окрашивание
- Постепенно гидратной оболочки путем медленного добавления 500 мкл дистиллированной воды в трубке UСЭД для фиксации в разделе 3.4. Аспирируйте содержимое несколько раз в пипетки перемешать, а затем удалить содержимое.
- Добавить 500 мкл дистиллированной воды. Дайте постоять в течение нескольких секунд, а затем удалить. Добавьте 500 мкл Альциановый синевы и оставить на 3 мин. Удалить пятно и выполнить 3 последовательных 500 мкл дистиллированной воды не полощет или пока жидкость промывает ясно.
- Добавьте 500 мкл гематоксилин # 1 пятно и оставьте на 3 мин. Удалить пятно и выполнить три последовательных 500 мкл дистиллированной воды полосканий или пока жидкость не полощет ясно. Дегидрировать (обратная раздела 4.2.1) с помощью аспирационных прозрачной жидкости.
- Добавьте 500 мкл Папаниколау ОГ-6 пятно и оставьте на 3 мин. Удалить пятна и выполнить одну 500 мкл 95% (об / об) полоскание этанола.
- Добавьте 500 мкл Папаниколау EA-65 пятно и оставьте на 3 мин. Удалить пятно и выполнить 3 последовательных 500 мкл 95% (об / об) этанол ополаскивателей.
- Полностью обезвоживают с использованием трех последовательных 500 мкл 100% этанола полосканий. Использование TWEEZERS, удалить образец из раствора; избегать прикосновения к области сбора клеток.
- Поместите мембрану на предметное стекло; обеспечить сбор клеточной линии параллельно или перпендикулярно к слайду маржу для облегчения выравнивания при визуализации.
- Нанесите каплю 100% этанола и накрыть стеклянным скольжением. Немедленно приступить к визуализации (раздел 5.2).
5. Пример обработки изображений
- Флуоресцентные визуализации Иммуноцитохимические Пятна
- С помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) 11 или флуоресцентный микроскоп 12, оснащенный цифровой цветной камерой, подключенной к компьютеру , на котором работает программное обеспечение захвата изображений. Из-за выборок, содержащаяся в культуральные чашки, инвертированный микроскоп может быть необходимым.
- Настройка микроскопа 11,12 в зависимости поглощения и испускания спектров этидия гомодимерного-1 (528/617 нм Ex / Em максимумы в присутствии ДНК) и кальцеина AM (494/517 нм Eх / Em максимумы).
- Выберите наименьшее увеличение микроскопа (например, 2.5X объективную) и активировать систему цифровой обработки изображений; наблюдать за пробой, отображаемое на мониторе компьютера.
- Проверьте образец для клеточных функций, представляющих интерес.
- Выберите нужный увеличение микроскопа и получения изображений с помощью программного обеспечения визуализации.
- Сохранить файлы в любом исходном формате микроскоп файл или несжатый формат файла (например, * .raw, * .tiff).
- Визуализации цитологическое Пятна
- Используйте стандартный лабораторный ярко-полевой микроскоп без фильтров, оснащенный цифровой цветной камерой, подключенной к компьютеру, на котором работает программное обеспечение захвата изображений.
- Место и замок предметное стекло (со стадии 4.2.8) на столике микроскопа. Увлажняет образец с 100% -ным этанолом в случае необходимости, на протяжении всей процедуры визуализации.
- Выберите наименьшее увеличение микроскопа (например, 2.5X объективное) и активировать е местоСистема цифровой обработки изображений е; наблюдать за пробой, отображаемое на мониторе компьютера.
- Обеспечить сбор клеток выравнивается либо оси X или Y контроля стадии микроскопа. Отрегулировать при необходимости, удалением покровное и вращением образца с помощью пипетки или пинцета.
- С помощью программного обеспечения обработки изображений, захвата изображения (ы) по всей выборке с наименьшим увеличением микроскопа.
- Переход к умеренным увеличением микроскопа (например, 10 - 20X объективной) и настроить микроскоп источник света и параметры визуализации программного обеспечения (экспозиция, контраст, баланс белого и т.д.), и отключить их автоматизированное программное обеспечение учета. Сохраните эти настройки для использования в будущем.
- Определить начальную и конечную точки сканирования (например, верхний левый и нижний правый углы сбора клеток).
- С помощью программного обеспечения обработки изображений, захвата изображения (ы) всей площади сбора клеток в начальной и конечной точек. Убедитесь, что 20% из стороны в сторону и сверху донизу перекрытия betwееп все соседние изображения.
- Сохраните файлы , используя собственный формат файла микроскопа или несжатый формат файла (например, * .raw, * .tiff).
- Произведите окончательную панорамное изображение с помощью программного обеспечения автоматизированного сшивание выбора (например, Adobe Photoshop Elements). Используйте эталонные изображения, сделанные на этапе 5.2.5), чтобы подтвердить достоверность автоматизированной строчки в итоговом изображении.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Культуру клеток мембрана, натянутая над пластмассовым держателем является удобным инструментом для портативной коллекции эпителиальных клеток из крышки стеклоочистителя конъюнктивы. Этот способ исключает необходимость в дополнительных стерилизованных инструментов , обычно используемых для подготовки и обрабатывать IC мембраны. На рисунке 1 показана интегральная схема зоны стеклоочистителей крышки с использованием клеточной культуры вставку. Мы оптимизировали два различных протоколов окрашивания, которые дополняют друг друга, чтобы охарактеризовать эпителиальные клетки из зоны стеклоочистителей крышки новым способом. Флуоресцентные иммуноцитохимической красители раскрывают эстеразы активность, показатель жизнеспособности клеток и нуклеиновых кислот, окрашивание которых отражает клеточную мембрану компромисс, как показано на рисунке 2. Цитологическая протокол окрашивания позволяет проводить тонкое различие между кератинизации градусов. На рисунке 3 показан переход между низким ороговения в лапок конъюнктивы и передовой кератинаризации в крышке стеклоочистителя конъюнктивы и эпидермис. Панорамная визуализация цитологического окрашенных коллекций клеток позволяет анализировать всей области сбора, в отличие от выбранной области интереса. Разрешение изображения достаточна для масштабирования до ядерного уровня; клеточной морфологии можно определить с точностью. На рисунке 4 показан окончательный образ цитологически окрашивали коллекции клеток, скреплены вместе с помощью ок. 100 отдельных файлов с высоким разрешением. Эти инструменты могут быть использованы для оценки влияния трения и / или сухого глаза новым способом.
Рисунок 1. Впечатление цитологии крышки Wiper Область. Впечатление цитологии выполняется на области крышки стеклоочистителя выставленного выворачивания верхней крышки. Мембрана используется для культивирования клеток Вставка, 12 мм, гидрофильное ПТФЭ. Обратите внимание на выступы держателя мембраны, которая может быть сохранена (в отличие от предварительнодущих исследований по бульбарной конъюнктивы, в котором они были удалены перед нанесением) , поскольку они не мешают применению мембраны на краю узкой веко и на самом деле может помочь выравнивание. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Флуоресцентные клетки от крышки Wiper области. Конфокальной лазерной сканирующей микроскопии , показывающие изменение морфологии клеток между крупными плоскоклеточного клеток (А) и мелкие столбчатые / кубоидальный клетки (б). Зеленый флуоресцентный кальцеина AM указывает на активность эстеразы в организме клеток (то есть, жизнеспособность клеток). Красный флуоресценции этидий показывает нуклеиновых кислот, указывающие на клеточной мембраны компромисса. Немногие клетки демонстрируют интенсивный зеленый цвет и отсутствие красной флуоресценции, возможно, в dicative целостности клеточных мембран (с). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Цитологическое Окрашивание IC образца. Клетки крышки стеклоочистителя области показывают различной морфологии и различные кератинизации градусов. Синий цвет малых, столбчатых и кубическими клеток с крупными ядрами, найденных в маргинальном / предплюсны конъюнктивы, указывает на отсутствие ороговения (а); красный / оранжевый пятно больших плоских клеток с конденсированными ядрами дерматологической перехода (линия MCJ / Маркса) и безъядерные клетки эпидермиса представляет передовые ороговения (с). Переходный цвет (красный / синий) и морфология клеток в крышке стеклоочистителя конъюнктивы области предлагают ограниченный ороговения (б).g3large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Композитный изображение крышки Wiper Cell Collection. Впечатление цитологии зоны стеклоочистителей крышки после цитологического окрашивания. Изображение скреплены вместе с помощью ок. 100 отдельных фотографий, сделанных с помощью микроскопа и объектива 20X. (А) Малый столбчатый / кубовидные эпителиальные клетки предплюсневому / маргинального конъюнктивы. Клетки здесь демонстрируют синий / зеленый / пурпурный цвет указывает на отсутствие ороговения; (Б) клетки крышки стеклоочистителя конъюнктивы, переходные по морфологии и цветовое пятно между регионами (а) и (с); (С) крупные клетки плоского эпителия линии дерматологической соединения / Маркса. Оранжевый цвет пятно указывает на некоторую степень ороговения, и красный / розовый указывают на поздней стадии плоскоклеточный перехода; (D) Meibum впечатление; (Е) безьядерный, ороговевших клеток эпидермиса; (Е) Goblet клеток впечатление или слезных муцинов пленки. Нисходящая стрелка указывает предплюсны конъюнктивы область, стрелка вверх указывает на внешнюю крышку. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Впечатление цитологическое, как правило, выполняется на бульбарной конъюнктивы, с использованием смешанного сложного эфира целлюлозы мембраны. Образцы разрезают по размеру из массивного материала листов, стерилизованы, применяется и удаляется из конъюнктивальной поверхности с помощью щипцов. Используя тот же материал мембраны, поршень под контролем ИС - устройство было недавно разработан , чтобы соответствовать геометрии поверхности бульбарной конъюнктивы, и поддерживать постоянное давление между приложениями 13. Эти подходы неэффективны для узкой, заметно изогнутой крышкой стеклоочистителя области (см Рисунок 1). Кроме того, смешанный сложный эфир целлюлозы мембраны не обеспечивают необходимую степень прозрачности для установок, где яркое поле микроскопа необходимо выровнять образцы перед флуоресцентных изображений. Вставки для культивирования клеток, предложенные в этом протоколе удобны тем, что они стерилизованы, в идеале по размеру и могут быть обработаны вручную, без дополнительного оборудования, обеспечивая быстрые коллекции. Мембраны изготовлены изгидрофильная PTFE, который обеспечивает достаточную прозрачность для конфокальной микроскопии анализа.
В целом, морфологические особенности собранных клеток совпадают с предыдущими литературными 7,8,14,15. Замена обычно используется (и хроматично очень интенсивный) кислотно-Шиффа (PAS) пятно периодическое с Альциановый синим позволяет последующие красители Папаниколау , чтобы отобразить тонкие хроматические вариации, что позволяет более детальный взгляд на уровне клеточного кератинизации, чем сообщалось ранее 7,8.
Микроскопическое изображений цитологических образцов, как правило, включает в себя визуальный осмотр через окуляры, и большим увеличением фотографирование структур считающихся "интерес". При таком подходе, "большая картина" аспекты всей коллекции могут быть потеряны. Низкая увеличением снимков, как правило , низкого оптического качества (из - за виньетирования, аберраций и т.д.) и разрешение недостаточно , чтобы изобразить клеточную детальs. Панорамные протокол колющие, предложенный здесь, в то время как немного больше отнимает много времени, является предпочтительным, поскольку он обеспечивает обзор полной мембраны, а также возможность увеличения в ядерной детали, все в одном изображении. Количественные показатели , такие как количество клеток, ядерно-цитоплазматических отношение (NC) 16 и расстояния могут быть вычислены здесь.
Есть три важных шагов в рамках протокола, которые требуют особого внимания: правильное применение мембраны на конъюнктиву (раздел 2.4), время между этапами обработки образцов (разделы 2.6 и 3 по 5) и последовательные параметры визуализации для оптимальной панорамной строчкой (раздел 5.2 +0,6 - 5.2.8). В отличие от относительно плоской бульбарной конъюнктивы, крышка стеклоочистителя области имеет ярко выраженную кривизну, охватывающий узкую ширину всего 1 - 2 мм между эпидермисом и лапок борозды. Крайне важно, чтобы мембрана наносить под правильным углом, так как это может в значительной степени влиять на тип клеток, собранных. Во-вторых, MEMдавление на бране должно соответствовать между приложениями. Поэтому исследователь должен разработать необходимую ловкость для обеспечения воспроизводимых коллекций. Как только образцы собраны с использованием метода цитологии впечатление, сроки обработки приобретает решающее значение. Образцы никогда не должны допускать высыхания, т.е. мембрана не должна стать непрозрачным (разделы 2.6, с 3 по 5). В то время как образец пройти цитологическое окрашивание можно оставить в фиксаторе в течение длительного времени (20 мин - 2 ч), должны быть добавлены и отображены без задержки, чтобы оценить жизнеспособность клеток как можно более точно Иммуноцитохимическая пятна. Последовательность синхронизации также имеет важное значение для сопоставимости результатов между образцами; следует стремиться сохранить фиксации и окрашивания раз одинаковым для всех образцов для сравнения. И, наконец, для того , чтобы получить качественные панорамные изображения образца цитологии, все параметры визуализации (микроскопа интенсивность света, экспозиции камеры, контрастность, баланс белого и т.д.)должен быть откалиброван в представительном области образца, с наибольшим разнообразием функций , представляющих интерес (например, типы клеток), и все автоматизированные измерения быть отключены для последующих кадров (раздел 5.2.6). Исследователь должен также стремиться сориентировать сбор клеток в соответствии с либо X или Y оси столика микроскопа. Это облегчит получение изображений и процесс сшивания. Цель , чтобы найти и использовать отличительные особенности на образце (например, клеточные патчи, meibum, мусора и т.д.) в перекрывающихся областях между соседними кадрами. Фокус микроскопа должен быть единственным корректировка должна быть исправлена между выстрелами.
Ограничение этого метода заключается в изменчивости коллекций клеток, как это первоначально наблюдали Жальбер 8, который сообщил показатель успеха 67% при получении вырожденные участки крышки стеклоочистителя клеток. Угол приложения диктует количество и тип клеток, собранных. На данном этапе остается неясным, шhether качество коллекции (то есть, число ячеек на образце) коррелирует с глазного здоровья. Клинические испытания с большими размерами образца необходимы, чтобы доказать справедливость этого метода. Еще один недостаток заключается в присущей инвазивности самой методики IC. Улучшенные клеточные слои насильно удалены из конъюнктивы, и это может вызвать повреждение. В то время как иммуноцитохимической пятна предназначены для отражения жизнеспособности клеток (и эстеразы активность присутствует во всех коллекциях), неясно, что красная флуоресценция клеточных ядер в наших коллекциях показывают. Время от времени, meibum (то есть, липиды , секретируемые на краю крышки) и другие компоненты от поверхности глазного яблока или слезной пленки будет , как правило, охватывают клеточные функции , и сделать анализ затруднительным или невозможным. Протокол может быть изменен с дополнительным ополаскиванием в ксилоле, чтобы удалить meibum липиды. И, наконец, эффект анестезирующих капель на конъюнктивальных клеток неизвестна.
Получение данных сотовой структуры области крышки стеклоочистителя поможет проверить корреляцию между трением, которое происходит между этими клетками и поверхностью глазного яблока, а также субъективный комфорт. Это даст ценные знания и разрешить будущие клинические испытания, чтобы исследовать клеточные особенности тех, кто носит контактные линзы, предметы с крышкой стеклоочистителя эпителиопатии, сухости глаз или сухости симптомов, в отличие от бессимптомных пациентов, мы надеемся пролить свет на эту тему глазного дискомфорта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue, 1% in 3% Acetic Acid | Sigma | B8438-250ML | |
| Hematoxylin, Gill 1 | Sigma | GHS116-500ML | |
| Papanicolaou stain, OG-6 | Sigma | HT40116-500 ml | |
| Papanicolaou stain, Modified EA | Sigma | HT40232-1L | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies | L-3224 | contains ethidium homodimer-1 and Calcein AM dyes |
| Alcaine (0.5% proparacaine hydrochloride) | Alcon | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | EMD Millipore | PICM01250 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |
References
- Barbato, G., et al. Diurnal variation in spontaneous eye-blink rate. Psychiatry Res. 93, 145-151 (2000).
- Korb, D. R., et al. Lid-Wiper Epitheliopathy and Dry-Eye Symptoms in Contact Lens Wearers. Eye & Contact Lens. 28, 211-216 (2002).
- Dumbleton, K., Woods, C. A., Jones, L. W., Fonn, D. The impact of contemporary contact lenses on contact lens discontinuation. Eye & Contact Lens. 39, 93-99 (2013).
- Roba, M., Duncan, E., Hill, G., Spencer, N., Tosatti, S. Friction measurements on contact lenses in their operating environment. Tribol Lett. 44, 387-397 (2011).
- Sickenberger, W., Pult, H., Sickenberger, B. LIPCOF and contact lens wearers: a new tool to forecast subjective dryness and degree of comfort of contact lens wearers. Contactologia. 22, 74-79 (2000).
- Pult, H., Purslow, C., Berry, M., Murphy, P. J. Clinical tests for successful contact lens wear: relationship and predictive potential. Optom Vis Sci. 85, E924-E929 (2008).
- Doughty, M. J. Morphological features of cells along Marx's line of the marginal conjunctiva of the human eyelid. Clin Exp Optom. 96, 76-84 (2013).
- Jalbert, I., et al. Assessing the human lid margin epithelium using impression cytology. Acta Ophthalm. 90, e547-e552 (2012).
- Nelson, J. D. Impression cytology. Cornea. 7, 71-81 (1988).
- Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. A simple conjunctival biopsy. Am J Ophthalmol. 84, 798-801 (1977).
- Wilson, T. Confocal microscopy. , Academic Press. London. 1-64 (1990).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Tomlins, P., Roy, P., Curnow, J., Rauz, S. Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival Impression for Flow Cytometry. Invest Ophthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).
- Knop, E., Korb, D. R., Blackie, C. A., Knop, N. The lid margin is an underestimated structure for preservation of ocular surface health and development of dry eye disease. Res Proj Dry Eye Syn. 45, 108-122 (2010).
- Knop, E., et al. The lid wiper and muco-cutaneous junction anatomy of the human eyelid margins: an in vivo confocal and histological study. J Anat. 218, 449-461 (2011).
- Christensen, J. A., Skaarland, E. Nuclear and cell area measurements in the cytological evaluation of pleural effusions: a study of subjective assessments and morphometric measurements. Diag Cytopathol. 3, 50-54 (1987).
