Introduction
人的上眼睑周围执行每天1万闪烁，只用1 - 2 mm窄结膜区域反对眼球。由于眨眼在其擦拭动作，睑缘的这一部分被称之为“盖雨刮器”区域2。假定摩擦惯常闪烁期间在该区域增加，由于该盖抹遍布全球。这可能在眼睛舒适一个显著的作用。隐形眼镜配戴者特别是经验眼部不适，这是主要的原因停止配戴镜片3之一。当接触透镜被放置在眼睛上，透镜材料和眼表面之间的摩擦系数已经显示出改变4。有证据表明，干症状可能与此改变的摩擦2,5,6。
此关联，也可以在临床上观察到的现象的反射，尤其是盖的Wi每上皮病变（LWE），也称为上盖余量染色（ULMS）6。 LWE是对眼有刺激性的早期征兆和干眼病的潜在指标。据观察，并通过上，下眼睑边缘区域的活体染色测定。虽然这个分级系统2及其临床有效性（即与主观症状相关性）仍在争论，眼部不适仍然为临床医师和科学家都一个难题，以及最重要的是，对于患者的不便。
最新的，鲜为人知的是，临床相关的变化盖子雨刮区7的（子）细胞的解剖和生理，只有一个报告中运用的方法细胞学8。印象细胞学检查（IC）已雇用了超过40年由膜9,10的应用程序来收集细胞延髓或睑结膜上皮表面。取出后，贴壁细胞经历Çytological染色和显微成像。由于在盖刮水器区域的解剖和细胞的差异，这种技术需要优化。
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Protocol
伦理学声明：在此之前，从人类受试者采集细胞，知情同意，并且必须获得伦理委员会批准。
1.准备染色
注意：在实验当天准备污点。
- 在15ml离心管5微升乙锭（或4μM）和5μl钙黄绿素AM（或4μM）添加到2.5毫升磷酸盐缓冲盐水（PBS）;混合。包装在铝箔在室温避光和存储屏蔽直到使用。
2.收集细胞
- 从包装中取出细胞培养插入和标签为每个眼睑进行采样。细胞收集的关于使用永久标记在膜的塑料保持器的侧标记定向。行为裂隙灯检查在中等倍率（约20倍），以确认该区域的适当的健康接受的IC。
- 在EA的低结膜囊分配局部麻醉剂（0.5％丙美卡因盐酸盐）一滴CH眼睛和指示参与者保持闭眼一分钟。
- 埃弗特上眼睑和由睫毛的地方举行;避免与盖刮水器区域中的任何接触。
可选的：一个次级研究者的帮助可能需要执行此步骤。 - 垂直应用膜到盖刮水器区域的最小压力的中心部分。
- 5秒 - 到位3握住膜。观察该膜中的接触面积变得半透明。在这一点上，轻轻地除去膜并允许参与者的盖子为“翻转”回原位。
- 及时的PBS一滴施加到样品，以防止其干燥。膜将变成半透明的，并且在任何时候不应该把不透明的，因为这表明干燥。有研究者二次用样品的处理（第3节）立即开始。
- 最后进行眼部检查，以确保结膜的完整性。免除眼部润滑剂和指导参与者避免揉眼睛直到麻醉效果消退（约15分钟）。
3.样品处理
- 用微型剪刀，切割膜中一半（一半用于每个下游分析的），垂直通过细胞收集的中间。沿着一个膜一半将它从塑料保持器分离的外缘切割;避免与在膜上收集的细胞，包括确保所述膜不折叠到自身相互作用。
- 从持有者完全分离前安全用镊子膜。地方膜到含有500μl的95％（V / V）乙醇和离开处理（第4.2节）之前定为至少20分钟至最多2小时的标记为2毫升离心管中。
- 膜分离立即下半年（如3.2节所述）和第4.1及时进行。
4.样品染色
- ImmunocytochemiCAL染色
- 小心将膜与收集面朝下跌35毫米的玻璃底培养皿;确保膜是平的。
- 吸取20微升第1条组装到膜免疫细胞化学染色组成。如果样品缭绕，使用一次性吸头推其边缘下来仔细扁平化膜。避免细胞收集区接触。
- 轻轻盖上盖玻片膜。避免样品的不必要的移动。盖上盖子的菜，并与周围的边缘实验室薄膜密封。不会阻碍培养皿（顶部和底部）和样品的可视性的透明性。与实验室标志的标签。
- 与成像（5.1节）立即着手，然后返回到第4.2节继续与膜的另一半的细胞学染色。
- 细胞学染色
- 通过缓慢加入500微升的蒸馏水到管ü逐渐水合膜3.4节的sed进行固定。内容抽吸数次进入枪头混合，然后删除内容。
- 加入500微升的蒸馏水。让我们站在了几秒钟，然后取出。加入500μl阿尔新蓝染色，离开3分钟。除去污点并进行连续3 500微升蒸馏水水冲洗或直到液体冲洗清晰。
- 加入500μl苏木＃1色斑，离开3分钟。除去污点并进行连续三个500微升蒸馏水水冲洗或直到液体冲洗清晰。通过吸取透明液体脱水（4.2.1节反向）。
- 加入500μl巴氏OG-6染色的，离开3分钟。去除污点和执行一个500μl的95％（体积/体积）乙醇漂洗。
- 加入500μl巴氏EA-65染色，并留下3分钟。除去污渍，并执行连续3次500μl的95％（体积/体积）乙醇漂洗。
- 充分利用脱水连续三个500微升100％乙醇漂洗。使用TWEezers，去除溶液样品;避免接触细胞采集领域。
- 放在载玻片膜;确保细胞收集行是平行或垂直于成像期间更容易对准滑动余量。
- 应用100％的乙醇的下降，并与玻璃滑移盖。立即着手与成像（第5.2节）。
5.样品成像
- 成像荧光免疫细胞化学染色剂
- 使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）11或荧光显微镜12中 ，配备有数码彩色摄像机，连接到运行的图像获取软件的计算机。由于样品被包含培养皿内，在倒置显微镜可能是必要的。
- 设置显微镜11,12根据乙锭同型二聚体-1（六百十七分之五百二十八毫微米实施例/ EM最大值在DNA的存在下）和钙黄绿素AM的吸收和发射光谱（五百十七分之四百九十四纳米ËX / EM最大值）。
- 选择显微镜的放大倍率最低（ 例如，2.5X目标），并激活数字成像系统;观察电脑显示器上显示的样本。
- 检查感兴趣细胞特征的样本。
- 选择需要的显微镜的放大倍率，并使用图像处理软件采集图像。
- 无论是在本地显微镜文件格式或未压缩的文件格式（ 例如 ，* .RAW，* .TIFF）保存文件。
- 成像细胞学渍
- 使用不带任何过滤器标准实验室亮场显微镜，配备数字彩色摄像头，连接到运行图像采集软件的计算机。
- 地方和锁定载玻片（从步骤4.2.8）在显微镜阶段。根据需要再水合用100％乙醇样品，在整个成像过程。
- 选择显微镜的放大倍率最低（ 例如 ，2.5X目标），并激活次Ë数字成像系统;观察电脑显示器上显示的样本。
- 确保细胞收集与显微镜载物台控制的X或Y轴对齐。如果需要的话，通过除去盖玻片并用移液管尖端或镊子转动样品调整。
- 使用成像软件，用最低的显微镜放大倍数整个样本的捕获图像（多个）。
- 切换到中等显微镜放大倍率（ 例如，10 - 20X的目标），并调整显微镜光源和软件成像参数（曝光，对比度，白平衡等 ），并禁止他们的自动化软件测光。保存以备将来使用这些设置。
- 确定扫描（ 例如 ，左上角和细胞收集的右下角）的开始和结束点。
- 使用成像软件中，起始和结束点的范围内的全部细胞收集区的捕获图像（多个）。确保20％的侧到侧和顶部至底部重叠betwEEN所有相邻图像。
- 使用本机显微镜文件格式或未压缩的文件格式（ 例如 ，* .RAW，* .TIFF）保存文件。
- 使用所选的自动拼接软件（ 例如，Adobe公司的Photoshop Elements）生成最终的全景图像。使用），在步骤5.2.5拍摄参考图像，以确认自动缝合的准确性最终影像中。
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Representative Results
跨越在塑料保持器细胞培养膜为从盖刮水器结膜上皮细胞的手持集合的方便工具。这种方法消除了通常用于制备和处理集成电路膜额外灭菌仪器的需要。 图1描绘了使用一个细胞培养插管在盖刮水器区的集成电路。我们优化的两种不同的染色方案互为补充，从盖雨刷区以新的方式表征上皮细胞。荧光免疫细胞化学染料揭示酯酶活性，细胞生存力的指标，和核酸，染色其中反映细胞膜折衷， 如图2，细胞学染色协议允许角质化度之间的细微差别。 图3示出了过渡在睑结膜和先进的角蛋白低角化之间化在盖刮水器结膜和表皮。细胞学染色细胞集合的全景成像允许整个集合区域的分析，相对于感兴趣的选定区域。图像分辨率是足够的缩放核水平;细胞形态可以精确地确定。 图4示出了细胞学染色细胞收集的最终图像，使用约缝合在一起。 100个独立的高分辨率文件。这些工具可被用来评估以一种新颖的方式摩擦和/或干眼的影响。
图1.盖的印象细胞学抽头区。印象细胞学由所述上盖的外翻露出的盖刮水器区域进行。使用的膜是细胞培养插管，12mm时，亲水性PTFE。注意该膜保持器，其可以被保留的标签（不同于预在球结膜，在他们被前应用程序中删除），因为它们不与应用膜到窄睑缘干扰，反而可能有助于排列vious研究。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.从盖子雨刮区的荧光细胞。激光共聚焦扫描显微镜显示巨大的鳞状上皮细胞之间的细胞形态变化 （a）和较小的柱状/立方细胞（b）中。钙黄绿素AM的绿色荧光表示细胞体（ 即 ，细胞活力）的酯酶活性。乙锭的红色荧光揭示的核酸，表明细胞膜折衷。少数细胞表现出强烈的绿色和无红色荧光，可能在细胞膜的完整性（C）dicative。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3. IC样品的细胞学染色。盖雨刮区域显示出不同形态和不同程度的角化细胞。小，柱状立方细胞与细胞核大，在边缘/睑结膜发现的兰色，表明没有角化（一）;大鳞状上皮细胞与粘膜交界处皮肤（MCJ /马克思线）和表皮细胞无核凝结核的红/橙染色代表先进角化（C）。过渡色（红/蓝）和细胞的形态在盖刮水器结膜区域建议限制角化（b）中。g3large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图4.复合图像盖雨刷细胞采集。细胞学染色后的盖雨刮器面积的印象细胞学检查。图像缝合在一起使用约。采取用显微镜和20X客观的100个人的照片。 （一）小柱状/睑板/边际结膜立方上皮细胞。在此细胞表现出蓝色/绿色/紫色表示没有角质化; （b）该盖刮水器结膜细胞，过渡在区域之间的形态和染色颜色（一）和（c）; （c）该粘膜皮肤结/马克思'线的大鳞状细胞。橙色色斑颜色表示一定程度的角质化，红色/粉红色表明晚期鳞状过渡; （四）Meibum印象; （五）无核，表皮角化的细胞; （六）Goblet细胞印象或泪液膜的粘蛋白。向下的箭头表示睑板结膜区域，向上的箭头表示外盖。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
印象细胞学检查是在球结膜通常进行的，使用混合纤维素酯膜。样品切成尺寸从散装材料片，消毒，使用镊子结膜表面施加和除去。使用相同的膜材料，活塞控制的IC器件最近已设计，以配合球结膜的表面几何形状，和维护应用程序13之间是一致的压力。这些方法是低效的窄，突出地弯曲的盖刮水器区域（ 见图1）。此外，混合的纤维素酯膜不提供对设置必要的透明度，其中亮视野显微镜是必要的前荧光成像对准样品。在这个协议中提出的细胞培养插入是方便的，因为它们进行灭菌，理想的尺寸和可手动处理，无需进一步的设备，以确保迅速集合。所述膜制成亲水性PTFE，这提供了共焦显微镜分析足够的透明度。
总体而言，收集细胞的形态特征与以往文献报道7,8,14,15一致。取代常用（及色非常强烈）碘酸-希夫（PAS）与阿尔新蓝染色，可以将后续的巴氏染料以显示更精细的色度 变化，从而使在细胞角化级的更详细的透视，比7,8之前的报道。
细胞样品的显微成像通常涉及通过目镜目视检查，并认为“利益”结构的高倍率摄影。通过这种方法，将整个集合的“大局观”的方面可能会丢失。低倍率的镜头通常不如光学质量（因暗角，畸变等 ）都和分辨率不足以描绘细胞细节秒。提出的全景拼接协议这里，等稍微费时，是有利的，因为它提供了完整的膜的概述，以及放大到核细节的能力，都在一个图像。定量指标，如细 胞计数，核细胞质（NC）比例16和距离可在此处计算。
有一些需要特别注意的协议中的三个关键步骤：膜的眼结膜上正确的应用程序（第2.4节），定时采样处理步骤（第2.6和3至5）和最佳的全景拼接一致的成像参数之间（5.2节0.6 - 5.2.8节）。不同的是相对平坦的球结膜，盖雨刷地区具有明显的弧度，跨越的只有1宽度窄 - 表皮和跗骨间沟2毫米。至关重要的是，该膜以正确的角度被应用，因为这可以大大影响收集的细胞的类型。其次，MEMbrane压力应该是在应用程序之间保持一致。因此，研究者应制定确保重复性馆藏必要的灵活性。一旦样品使用的印象细胞学技术收集，处理的定时变得至关重要。样品不应该被允许变干， 即，该膜不应该成为不透明（部分2.6，3至5）。而所用的固定剂在延长时间留给经历细胞学染色的样品（20分钟 - 2小时），免疫细胞化学染色应添加并成像毫不拖延，以尽可能准确地评估细胞生存力。时序一致性也是样品之间比较的结果至关重要;应该的目标是保持固定和染色时间相等进行比较所有样本。最后，为了获得细胞学样品的定性全景图像中，所有的成像参数（显微镜的光强度，照相机曝光，对比度，白平衡等 ）应校准到样品的代表性区域，具有所关注的特征（ 即，细胞类型）的最高分集，和所有自动计量可以为后 续的拍摄（5.2.6节）禁用。研究者还应当力求在定向线细胞收集与X或显微镜阶段的Y轴。这将缓解图像采集和拼接过程。瞄准定位和相邻图片之间的重叠区域样本（如细胞补丁，meibum，碎屑等 ），使用鲜明的特点。该显微镜重点应拍摄之间待校正的唯一的调整。
这种技术的局限性在于细胞集合的变异性，如最初由贾尔伯特8，谁报告中获得盖刮水器细胞汇合补丁67％的成功率观察。应用角决定收集的细胞的数量和类型。在这个阶段，它是不定的瓦特论是采集质量（ 即，在样品的细胞数）与眼睛健康相关。与较大的样本量的临床试验是必要的，以证明该技术的有效性。另一个缺点在于在IC技术本身固有的侵袭。优越的细胞层被强制从结膜移除，这可能会引起伤害。而免疫污斑旨在反映细胞存活率（和酯酶活性是存在于所有的集合），目前还不清楚什么细胞核中的集合的红色荧光指示。偶尔，meibum（ 即，在盖缘分泌脂质）和从眼表面或泪液膜其它部件将趋向于覆盖蜂窝功能并进行分析困难或不可能。该协议可以与在二甲苯额外漂洗以除去meibum脂质进行修改。最后，麻醉剂滴在结膜细胞的作用是未知的。
获得该盖刮水器区域的细胞结构的数据将帮助验证这些细胞和眼表面，和主观舒适之间产生的摩擦之间的相关性。这将提供宝贵的知识，并允许今后的临床试验，探索隐形眼镜配戴者的细胞特殊性，盖上雨刮上皮病变，干眼症或干燥的症状，而相比之下，无症状的科目，科目有希望的眼部不适的话题线索。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue, 1% in 3% Acetic Acid | Sigma | B8438-250ML | |
| Hematoxylin, Gill 1 | Sigma | GHS116-500ML | |
| Papanicolaou stain, OG-6 | Sigma | HT40116-500 ml | |
| Papanicolaou stain, Modified EA | Sigma | HT40232-1L | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies | L-3224 | contains ethidium homodimer-1 and Calcein AM dyes |
| Alcaine (0.5% proparacaine hydrochloride) | Alcon | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | EMD Millipore | PICM01250 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |
References
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