Introduction
De menselijke bovenste ooglid voert ongeveer 10.000 knippert elke dag 1, met slechts een 1-2 mm smalle conjunctivale regio tegen de oogbol. Door het wissen beweging tijdens het knipperen, is dit gedeelte van het ooglid is genoemd het "deksel wiper" gebied 2. Aangenomen wordt dat de wrijving tijdens gewone knipperend in dit gebied verhoogd, door het deksel vegen over de hele wereld. Dit kan een belangrijke rol spelen bij oculaire comfortabel. Contactlensdragers met name ervaring oculair ongemak en dit is een van de belangrijkste redenen voor stopzetting van de lens te dragen 3. Wanneer een contactlens geplaatst op het oog, is de wrijvingscoëfficiënt tussen het lensmateriaal en het oogoppervlak aangetoond veranderen 4. Er zijn aanwijzingen dat de droogte de symptomen kunnen worden gerelateerd aan deze veranderde wrijving 2,5,6.
Deze vereniging kan ook tot uiting komen in klinisch waarneembare verschijnselen, met name deksel wiper epitheliopathie (LWE), ook wel bovenste ooglid marge kleuring (ULMS) 6. LWE is een vroeg teken van oogirritatie en een potentiële voorspeller voor droge oogziekte. Opgemerkt wordt gemeten en de vitale kleuring van de bovenste en onderste ondermargegebieden deksel. Hoewel dit beoordelingssysteem 2 en de klinische geldigheid (dat wil zeggen, correlatie met subjectieve symptomen) zijn nog in discussie, oculair ongemak blijft een raadsel voor zowel clinici en wetenschappers en, belangrijker nog, een ongemak voor de patiënten.
Tot op heden is er weinig bekend over klinisch relevante verschillen in de (sub-) cellulaire anatomie en fysiologie van het deksel ruitenwisser gebied 7 en slechts één rapport maakt gebruik van cytologisch methoden 8. Indruk cytologie (IC) is gebruikt meer dan 40 jaar om cellen te verzamelen van het epitheliale oppervlak van de bulbaire conjunctiva of tarsale door toepassing van een membraan 9,10. Na verwijdering van de hechtende cellen ondergaan cytological kleuring en microscopische beeldvorming. Door de anatomische en cellulaire verschillen in het deksel ruitenwisser regio, deze techniek vereist optimalisatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek statement: Voorafgaand aan het verzamelen van cellen van menselijke proefpersonen, informed consent en ethiek toestemming moet worden verkregen.
1. Bereid Stain
OPMERKING: Bereid vlek op de dag van het experiment.
- Voeg 5 ul Ethidium (of 4 uM) en 5 gl calceïne AM (of 4 pM) aan 2,5 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in 15 ml centrifugebuis; mengen. Wikkel in aluminiumfolie af te schermen tegen licht en bewaar bij kamertemperatuur tot gebruik.
2. Collect Cells
- Verwijder celkweek inserts uit hun verpakking en label voor elke ooglid te bemonsteren. Mark oriëntatie van de cel collectie op de zijkant van het membraan plastic houder met behulp van permanent marker. Conduct spleet lamp inzage bij matige vergroting (ongeveer 20X) passende gezondheid van de regio om IC te ondergaan bevestigen.
- Verdeel één druppel plaatselijke verdoving (0,5% proparacaine hydrochloride) in de lagere conjunctivale zak van each oog en instrueren deelnemer aan de ogen gesloten te houden gedurende één minuut.
- Evert bovenste ooglid en plaats te houden door de wimpers; vermijd contact met het deksel ruitenwisser omgeving.
Optioneel: de hulp van een tweede onderzoeker kan nodig zijn om deze stap uit te voeren. - Toepassen membraan loodrecht op het midden van het deksel wisser regio minimale druk.
- Houd membraan in de plaats voor 3-5 sec. Let op het membraan doorzichtig geworden in het contactvlak. Op dit punt, verwijder voorzichtig het membraan en toestaan dat het deksel van de deelnemer op "flip" terug op zijn plaats.
- Onmiddellijk breng een druppel PBS aan het monster om het uitdrogen. Doorzichtig membraan draaien en niet ondoorzichtig te allen tijde, omdat dit droogtoestel aangegeven. Laat de secundaire onderzoeker gaan onmiddellijk met de verwerking van de monsters (deel 3).
- Gedrag laatste eye controle om de integriteit van het bindvlies te waarborgen. Verdeel oculaire smeermiddelen en instrueren deelnemerom te voorkomen dat wrijven hun ogen tot verdovend effect uitgewerkt (ong. 15 min).
3. Sample Processing
- Met behulp van micro-schaar, snijden het membraan in half (één helft voor elk van de stroomafwaartse analyses), loodrecht door het midden van de cel collectie. Snijd langs de buitenrand van een halve membraan te scheiden van de plastic houder; vermijd interactie met de verzamelde cellen op het membraan, waarbij gezorgd dat het membraan niet vouwen op zichzelf.
- Beveilig het membraan met een pincet voordat volledig los uit de houder. Plaats membraan in gelabelde 2 ml centrifugebuis die 500 pl 95% (v / v) ethanol en laat vaststellen voor minstens 20 minuten tot maximaal 2 uur vóór de verwerking (4.2).
- Onmiddellijk apart tweede helft van membraan (zoals beschreven in paragraaf 3.2) en onmiddellijk doorgaan met paragraaf 4.1.
4. De steekproef kleuring
- Immunocytochemical kleuring
- Plaats membraan voorzichtig in 35 mm glazen bodem cultuur schotel met een collectie omlaag; zorgen voor membraan is plat.
- Pipetteer 20 ul van immunocytochemische beitssamenstelling geassembleerd in deel 1 op het membraan. Als monster krullen omhoog, wegwerp pipet tips om zorgvuldig af te vlakken het membraan door op de randen naar beneden. contact met een mobiele collectie gebieden te voorkomen.
- Voorzichtig bedekken het membraan met glazen afdekplaat slip. Vermijd onnodige beweging van het monster. Sluit de schaal met deksel en afdichting met een lab-film rond de randen. Heeft transparantie van de schotel (boven en onder) en de zichtbaarheid van het monster niet in de weg. Label met labo marker.
- Meteen doorgaan met beeldvorming (paragraaf 5.1), dan terug te vinden in hoofdstuk 4.2 door te gaan met cytologisch kleuring van de andere helft van het membraan.
- cytologisch kleuring
- Geleidelijk hydrateren membraan door het langzaam toevoegen van 500 gl gedestilleerd water aan de buis Used voor bevestiging in paragraaf 3.4. Zuig de inhoud meerdere malen in de pipet tip om te mixen en verwijder de inhoud.
- Voeg 500 ul gedestilleerd water. Laten staan voor een paar seconden, dan verwijderen. Voeg 500 ul van Alcian Blue kleuring en laat gedurende 3 min. Verwijder vlekken en het uitvoeren van 3 opeenvolgende 500 pi gedestilleerd water gespoeld, of tot vloeistof spoelt duidelijk.
- Voeg 500 gl hematoxyline # 1 vlek en laat gedurende 3 min. Verwijder vlekken en het uitvoeren van drie opeenvolgende 500 pl gedestilleerd water gespoeld, of tot vloeistof spoelt duidelijk. Dehydrateren (achterzijde van paragraaf 4.2.1) door opzuigen van de heldere vloeistof.
- Voeg 500 ul van Papanicolaou OG-6 vlek en laat gedurende 3 min. Verwijderen vlekken en voer een 500 pl 95% (v / v) ethanol spoeling.
- Voeg 500 ul van Papanicolaou EA-65 vlek en laat gedurende 3 min. Verwijderen vlek en uitvoeren 3 opeenvolgende 500 pl 95% (v / v) ethanol spoelingen.
- Volledig drogen met behulp van drie opeenvolgende 500 pi 100% ethanol spoelingen. Met behulp van TWEezers, verwijder het monster uit de oplossing; vermijd het aanraken cel collectie gebieden.
- Plaats membraan op glasplaatje; ervoor te zorgen dat de cel collectie lijn ofwel parallel of loodrecht op de marge te schuiven voor een betere afstemming tijdens de beeldvorming.
- Breng een druppel van 100% ethanol en afdekken met glas slip. Meteen doorgaan met beeldvorming (paragraaf 5.2).
5. Sample Imaging
- Imaging Fluorescent Immunocytochemisch Stains
- Gebruik een confocale laser scanning microscoop (CLSM) 11 of fluorescentiemicroscoop 12, uitgerust met een digitale kleuren camera, aangesloten op een computer met een afbeelding acquisitie software. Door de monsters zijn opgenomen in kweekschalen, kan een omgekeerde microscoop nodig.
- Opgericht 11,12 Microscoop volgens absorptie- en emissiespectra van ethidium homodimeer-1 (528/617 nm Ex / Em maxima in de aanwezigheid van DNA) en calceïne AM (494/517 nm Ex / Em maxima).
- Selecteer laagste vergroting van de microscoop (bijv 2.5x objectieve) en de digitale imaging-systeem te activeren; observeren van het monster wordt weergegeven op het computerscherm.
- Inspecteer monster voor cellulaire kenmerken van belang.
- Selecteer de gewenste microscoop vergroting en beelden verwerven met behulp van beeldbewerkingssoftware.
- Bestanden opslaan in een van beide inheemse microscoop bestandsformaat of een niet-gecomprimeerd bestandsformaat (bijvoorbeeld * .raw, * .tiff).
- Imaging cytologische Stains
- Gebruik een standaard laboratorium bright-field microscoop met geen filters, uitgerust met een digitale kleuren camera, aangesloten op een computer met een afbeelding acquisitie software.
- Plaats en glasplaatje lock (uit stap 4.2.8) op de microscoop podium. Rehydrateren monster met 100% ethanol zoals nodig tijdens de gehele beeldvormingsprocedure.
- Selecteer laagste vergroting van de microscoop (bijv 2.5x objectieve) en e activerene digital imaging-systeem; observeren van het monster wordt weergegeven op het computerscherm.
- Zorg ervoor dat de cel collectie is uitgelijnd met hetzij X of Y-as van de microscoop podium controle. Pas indien nodig, door het verwijderen van het deksel slip en het draaien van het monster met behulp van een pipet tip of een pincet.
- Het gebruik van de afbeelding (en) vast te leggen van het gehele monster met het laagste microscoop vergroting imaging software.
- Overschakelen naar matig microscoop vergroting (bv 10 - 20X objectief) en stel microscoop lichtbron en software imaging parameters (belichting, contrast, witbalans, enz.), En hun geautomatiseerde software metering uit te schakelen. Deze instellingen opslaan voor later gebruik.
- Bepaal de begin- en eindpunten van de scan (bijvoorbeeld, linksboven en rechtsonder hoeken van cel collectie).
- Het gebruik van de afbeelding (en) vast te leggen van de gehele cel collectie gebied binnen het start- en eindpunt imaging software. Zorg voor een 20% side-to-side en top-to-bottom overlap betwEen alle aangrenzende foto's.
- Bestanden opslaan met behulp van de inheemse microscoop bestandsformaat of een niet-gecomprimeerd bestandsformaat (bijvoorbeeld * .raw, * .tiff).
- Genereer image laatste panoramisch met behulp van geautomatiseerde stitching software naar keuze (bijvoorbeeld Adobe Photoshop Elements). Referentiebeelden gebruiken die bij stap 5.2.5) om de nauwkeurigheid van de geautomatiseerde stiksel bevestigen in het uiteindelijke beeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De celkweek membraan overspannen over de plastic houder is een handig hulpmiddel voor handheld verzameling van epitheelcellen van het deksel ruitenwisser bindvlies. Deze werkwijze elimineert de behoefte aan extra gesteriliseerde instrumenten juist gebruikt voor het bereiden en verwerken IC membranen. Figuur 1 toont de IC van het deksel wisser gebied met een celkweek insert. We geoptimaliseerd twee verschillende kleuringsprotocollen die elkaar aanvullen om epitheelcellen te karakteriseren van het deksel ruitenwisser gebied in een nieuwe manier. Fluorescerende immunocytochemische kleurstoffen onthullen esterase activiteit, een indicator van cellevensvatbaarheid en nucleïnezuren, de kleuring die weerspiegelt celmembraan compromis, zie figuur 2. De cytologische kleuring protocol maakt een fijne onderscheid keratinisatie graden. Figuur 3 toont de overgang tussen lage keratinisatie in de tarsale conjunctiva en geavanceerde keratineordening in het deksel wisser conjunctiva en epidermis. Panoramische beeldvorming van cytologie gekleurde cel verzameling maakt de analyse van de gehele collectie gebied, in tegenstelling tot een geselecteerde regio van belang. Afbeelding resolutie is voldoende om in te zoomen op de nucleaire niveau; celmorfologie kan nauwkeurig te bepalen. Figuur 4 toont het laatste beeld van een cytologisch gekleurde celinzameling, gestikt behulp ca. 100 afzonderlijke hoge resolutie bestanden. Deze instrumenten kunnen worden gebruikt om de effecten van wrijving en / of droge ogen op een nieuwe manier te beoordelen.
Figuur 1. Impressie Cytologie van het deksel Wiper Area. Impression cytologie uitgevoerd op het deksel ruitenwisser regio blootgelegd door omkering van het bovenste ooglid. Gebruikte membraan is de celkweek Insert, 12 mm, hydrofiele PTFE. Let op de tabs van de membraan houder, die kan worden gehandhaafd (in tegenstelling tot prevorige studies over de bulbaire conjunctiva, waarin zij voorafgaand werden verwijderd om de toepassing) omdat ze niet interfereren met de toepassing van het membraan op de smalle ooglidrand en kan zelfs helpen uitlijning. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Fluorescerende cellen van de Dekselwisser regio. Confocale laser scanning microscopie toont verandering van celmorfologie tussen grote plaveiselcellen (A) en de kleinere zuilvormige / kubische cellen (b). Groene fluorescentie van calceïne AM geeft esterase activiteit in het cellichaam (dwz cellevensvatbaarheid). Rode fluorescentie van Ethidium onthult nucleïnezuren, wat aangeeft celmembraan compromis. Er zijn maar weinig cellen vertonen intens groen en geen rode fluorescentie, eventueel in dicative van celmembraan integriteit (c). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. cytologische kleuring van IC Sample. Cellen van het deksel ruitenwisser regio tonen uiteenlopende morfologie en verschillende keratinisatie graden. Blauwe kleur van kleine, zuil en kubische cellen met grote kernen in de marginale / tarsale conjunctiva, geeft geen keratinisatie (a); rood / oranje vlek grote plaveiselcellen met gecondenseerde kernen van de mucocutane junctie (Line MCJ / Marx) en kernloze cellen van de epidermis vormt advanced keratinisatie (c). Transitional kleur (rood / blauw) en de morfologie van de cellen in het deksel ruitenwisser conjunctivale gebied stel beperkt keratinisatie (b).g3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Samengesteld beeld van Deksel Wiper Cell Collection. Impressie cytologie van het deksel ruitenwisser gebied na cytologisch kleuring. Afbeelding aan elkaar gestikt met behulp van ca. 100 individuele foto's die met een microscoop en 20X objectief. (A) Kleine zuilvormige / kubisch epitheel van de tarsale / marginale conjunctiva. Cellen hier exposeren blauw / groen / paarse kleur aangeeft dat er geen keratinisatie; (B) cellen van het deksel ruitenwisser bindvlies, overgangs- in morfologie en kleur vlek tussen de regio's (a) en (c); (C) grote plaveiselcellen van de muco-cutane kruising / line Marx '. Oranje kleur beits geeft een zekere mate van keratinisatie, en rood / roze aangeven laat stadium geschubde overgang; (D) Meibum indruk; (E) kernloze, verhoornde cellen van de epidermis; (F) Goblet cel indruk of traanfilm mucinen. Neerwaartse pijl geeft tarsale conjunctivale gebied, opwaartse pijl geeft buitenste deksel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Impression cytologie wordt typisch uitgevoerd op de bulbaire conjunctiva, die gemengde cellulose-ester membranen. Monsters worden op maat gesneden van bulkmateriaal bladen gesteriliseerd, aangebracht en verwijderd uit de conjunctivale oppervlak met behulp van een tang. Met dezelfde membraanmateriaal werd een piston IC apparaat onlangs ontworpen om de oppervlakte geometrie van de bulbaire conjunctiva passen en constant hoge druk tussen 13 toepassingen. Deze benaderingen zijn inefficiënt voor de smalle, gebogen prominent Dekselwisser regio (zie figuur 1). Daarnaast heb gemengde cellulose-ester membranen niet zorgen voor de nodige transparantie voor opstellingen waarbij helder veld microscopie is nodig om monsters voorafgaande aan te passen aan fluorescerende beeldvorming. De in dit protocol voorgestelde celkweek inserts zijn handig omdat ze gesteriliseerd, ideaal formaat en kan handmatig worden verwerkt, zonder verdere apparatuur, zorgen voor een snelle collecties. De membranen worden gemaakt vanhydrofiele PTFE, die voldoende transparantie confocale microscopie analyse levert.
Over het algemeen, morfologische kenmerken van de verzamelde cellen samenvallen met eerdere literatuur verslagen 7,8,14,15. De meest gebruikte (en chromatisch zeer intens) perjoodzuur-Schiff (PAS) vlek met alcianblauw ter vervanging zorgt voor een latere Papanicolaou kleurstoffen fijnere chromatische variatie te geven, waardoor een meer gedetailleerde kijk op de cellulaire keratinisatie niveau, dan gemeld voor 7,8.
Microscopische beeldvorming van cytologische monsters gaat meestal visuele inspectie door de oculairen en sterke vergroting fotografie van structuren geacht "van belang". Met deze aanpak kunnen "grotere plaatje" aspecten van de gehele collectie verloren. Lage vergroting opnames zijn meestal lagere optische kwaliteit (door vignettering, aberraties, etc.) en de resolutie onvoldoende cellulaire detail beschrijvens. De panoramische stitching protocol voorgesteld hier, terwijl iets meer tijd, is voordelig, omdat het een overzicht van het volledige membraan, evenals de mogelijkheid om in te zoomen op celkerndetails, al een beeld. Kwantitatieve statistieken zoals het aantal cellen, kan nucleair cytoplasma (NC) verhouding tussen 16 en afstanden hier worden berekend.
Er zijn drie cruciale stappen in het protocol die speciale aandacht nodig hebben: de juiste toepassing van het membraan op het bindvlies (paragraaf 2.4), timing tussen monster bewerkingsstappen (paragrafen 2.6 en 3 tot en met 5) en consistente beeldvorming parameters voor een optimale panorama stitching (paragraaf 5.2 0,6 - 5.2.8). In tegenstelling tot de relatief vlakke bulbaire conjunctiva, het deksel ruitenwisser regio heeft een uitgesproken kromming, verspreid over een smalle breedte van slechts 1-2 mm tussen de epidermis en tarsal sulcus. Het is essentieel dat het membraan worden toegepast onder de juiste hoek, omdat dit sterk het soort cellen verzameld kunnen beïnvloeden. In de tweede plaats, membraan druk moet consequent tussen toepassingen. De onderzoeker moet daarom ontwikkeling van de nodige vaardigheid om te zorgen voor herhaalbare collecties. Zodra de bemonstering geschiedt volgens de indruk cytologie techniek, de timing van de verwerking wordt van cruciaal belang. De monsters mogen nooit worden toegestaan om uitdrogen, dat wil zeggen, het membraan mag niet worden ondoorzichtig (paragrafen 2.6, 3 tot en met 5). Terwijl het monster cytologische kleuring ondergaan kan worden achtergelaten in het fixeermiddel gedurende langere tijd (20 minuten - 2 uur) moet de immunocytochemische vlekken toegevoegd en afgebeeld onverwijld levensvatbaarheid van de cellen zo goed mogelijk in te schatten. Consistentie van timing is ook essentieel voor vergelijkbare resultaten tussen de monsters; men zou willen bevestigen en vlekken tijde gelijk te houden voor alle monsters te vergelijken. Tot slot, met het oog op kwalitatieve panoramische beelden van de cytologie monster te verkrijgen, alle grafische parameters (microscoop lichtsterkte, belichting, contrast, witbalans, etc.)moet worden gekalibreerd om een vertegenwoordiger van de sample, met de hoogste diversiteit aan functies van belang (dwz celtypen), en alle geautomatiseerde meting worden uitgeschakeld voor volgende opnamen (paragraaf 5.2.6). De onderzoeker moet ook gericht zijn op de cel collectie in lijn oriënteren met ofwel de X- of Y-as van de microscoop podium. Dit zal het beeld acquisitie en stiksels proces te vergemakkelijken. Doel het lokaliseren en gebruiken profilering op het monster (bijvoorbeeld cel pleisters, meibum, vuil, enzovoort) in de overlappende gebieden tussen aangrenzende afbeeldingen. De microscoop nadruk moet de enige aanpassing worden gecorrigeerd tussen de opnamen zijn.
De beperking van deze techniek ligt in de variabiliteit van cel collecties, zoals oorspronkelijk waargenomen door Jalbert 8, die een 67% succes bij het verkrijgen confluente stukken Dekselwisser cellen gerapporteerd. De toedieningshoek bepaalt het aantal en type cellen verzameld. In deze fase is het onzeker wHether collectie kwaliteit (dat wil zeggen, het aantal cellen op het monster) is gecorreleerd met oculaire gezondheid. Klinische studies met een grotere steekproefomvang zijn noodzakelijk om de geldigheid van deze techniek te bewijzen. Een verder nadeel ligt in de inherente invasiviteit van de IC techniek zelf. De superieure cel lagen worden met kracht uit het bindvlies verwijderd en dit kan schade veroorzaken. Terwijl de immunocytochemische vlekken zijn bedoeld cellevensvatbaarheid (en esterase activiteit in alle verzamelingen is) reflecteren, is het onduidelijk wat de rode fluorescentie van celkernen in onze collectie geven. Af en toe, meibum (dat wil zeggen, lipiden uitgescheiden op het deksel marge) en andere componenten van het oculaire oppervlak of traanfilm zal de neiging om cellulaire functies te dekken en analyse moeilijk of onmogelijk. Het protocol kan worden aangepast met een extra spoeling in xyleen om meibum lipiden te verwijderen. Tenslotte het effect van verdoving druppels op de conjunctivale cellen onbekend.
Verkrijgen van gegevens van de celstructuur van het deksel wisser regio zal helpen controleren of de correlatie tussen de wrijving die optreedt tussen deze cellen en het oogoppervlak, en subjectieve comfort. Dit zal waardevolle kennis te bieden en toestaan dat toekomstige klinische proeven om de cellulaire bijzonderheden van contactlensdragers te verkennen, onderwerpen met deksel ruitenwisser epitheliopathie, droge ogen of droogte symptomen, in tegenstelling tot asymptomatische proefpersonen, hopelijk licht werpen op het onderwerp van het oculair ongemak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue, 1% in 3% Acetic Acid | Sigma | B8438-250ML | |
| Hematoxylin, Gill 1 | Sigma | GHS116-500ML | |
| Papanicolaou stain, OG-6 | Sigma | HT40116-500 ml | |
| Papanicolaou stain, Modified EA | Sigma | HT40232-1L | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies | L-3224 | contains ethidium homodimer-1 and Calcein AM dyes |
| Alcaine (0.5% proparacaine hydrochloride) | Alcon | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | EMD Millipore | PICM01250 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |
References
- Barbato, G., et al. Diurnal variation in spontaneous eye-blink rate. Psychiatry Res. 93, 145-151 (2000).
- Korb, D. R., et al. Lid-Wiper Epitheliopathy and Dry-Eye Symptoms in Contact Lens Wearers. Eye & Contact Lens. 28, 211-216 (2002).
- Dumbleton, K., Woods, C. A., Jones, L. W., Fonn, D. The impact of contemporary contact lenses on contact lens discontinuation. Eye & Contact Lens. 39, 93-99 (2013).
- Roba, M., Duncan, E., Hill, G., Spencer, N., Tosatti, S. Friction measurements on contact lenses in their operating environment. Tribol Lett. 44, 387-397 (2011).
- Sickenberger, W., Pult, H., Sickenberger, B. LIPCOF and contact lens wearers: a new tool to forecast subjective dryness and degree of comfort of contact lens wearers. Contactologia. 22, 74-79 (2000).
- Pult, H., Purslow, C., Berry, M., Murphy, P. J. Clinical tests for successful contact lens wear: relationship and predictive potential. Optom Vis Sci. 85, E924-E929 (2008).
- Doughty, M. J. Morphological features of cells along Marx's line of the marginal conjunctiva of the human eyelid. Clin Exp Optom. 96, 76-84 (2013).
- Jalbert, I., et al. Assessing the human lid margin epithelium using impression cytology. Acta Ophthalm. 90, e547-e552 (2012).
- Nelson, J. D. Impression cytology. Cornea. 7, 71-81 (1988).
- Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. A simple conjunctival biopsy. Am J Ophthalmol. 84, 798-801 (1977).
- Wilson, T. Confocal microscopy. , Academic Press. London. 1-64 (1990).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Tomlins, P., Roy, P., Curnow, J., Rauz, S. Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival Impression for Flow Cytometry. Invest Ophthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).
- Knop, E., Korb, D. R., Blackie, C. A., Knop, N. The lid margin is an underestimated structure for preservation of ocular surface health and development of dry eye disease. Res Proj Dry Eye Syn. 45, 108-122 (2010).
- Knop, E., et al. The lid wiper and muco-cutaneous junction anatomy of the human eyelid margins: an in vivo confocal and histological study. J Anat. 218, 449-461 (2011).
- Christensen, J. A., Skaarland, E. Nuclear and cell area measurements in the cytological evaluation of pleural effusions: a study of subjective assessments and morphometric measurements. Diag Cytopathol. 3, 50-54 (1987).
