Introduction
La paupière supérieure humaine exécute environ 10.000 clignote chaque jour 1, avec seulement 1 - région conjonctival 2 mm étroite opposés du globe oculaire. En raison de son mouvement d'essuyage pendant le clignotement, cette partie de la marge de couvercle a été appelé le "couvercle essuie - glace" région 2. On suppose que le frottement est augmenté dans cette région pendant le clignotement habituelle, en raison du couvercle d'essuyage dans le monde entier. Cela peut jouer un rôle important dans le confort oculaire. Porteurs de lentilles de contact dans l' expérience particulière gêne oculaire et ceci est l' une des principales raisons pour cesser port des lentilles 3. Lorsqu'une lentille de contact est placée sur l'oeil, le coefficient de frottement entre le matériau de la lentille et la surface oculaire a été montré pour changer 4. Il existe des preuves pour suggérer que les symptômes de la sécheresse pourraient être liés à ce frottement modifié 2,5,6.
Cette association peut aussi se traduire par des phénomènes observables cliniquement, notamment couvercle wipar épithéliopathie (LWE), également appelé paupière supérieure marge coloration (ULMS) 6. LWE est un signe précoce d'irritation oculaire et un prédicteur potentiel de la maladie de l'oeil sec. On a observé et mesuré par la coloration vitale des régions de marge de couvercle supérieure et inférieure. Bien que ce système de classement 2 et sa validité clinique (c. -à- corrélation avec les symptômes subjectifs) sont encore en débat, gêne oculaire reste une énigme pour les cliniciens et les scientifiques et, surtout, un inconvénient pour les patients.
À ce jour, on sait peu sur les variations cliniquement pertinentes dans le (sous-) anatomie cellulaire et de la physiologie du couvercle zone d'essuie - glace 7 et un seul rapport fait appel à des méthodes cytologiques 8. Impression cytologie (IC) a été employé pendant plus de 40 ans pour recueillir des cellules de la surface épithéliale de la bulbaire ou conjonctive tarsienne par application d'une membrane 9,10. Lors de l'enlèvement, les cellules adhérentes subissent cytological coloration et d'imagerie microscopique. En raison des différences anatomiques et cellulaires de la région d'essuie-glace de couvercle, cette technique nécessite l'optimisation.
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Protocol
déclaration éthique: Avant de recueillir les cellules de sujets humains, le consentement éclairé et l'approbation de l'éthique doit être obtenue.
1. Préparer Stain
NOTE: Préparer la tache le jour de l'expérience.
- Ajouter 5 ul d'éthidium (ou 4 uM) et 5 pi de calcéine AM (ou 4 uM) à 2,5 ml de tampon phosphate salin (PBS) dans 15 ml tube de centrifugation; mélanger. Envelopper dans du papier d'aluminium pour protéger de la lumière et conserver à la température ambiante jusqu'à utilisation.
2. Cellules Collectionnez
- Retirer les inserts de culture cellulaire de leur emballage et l'étiquette pour chaque paupière à échantillonner. Indique l'orientation de prélèvement de cellules sur le côté du support en matière plastique de la membrane en utilisant un marqueur permanent. Conduite fente inspection de la lampe à un grossissement modéré (environ 20X) pour confirmer la santé appropriée de la région à subir IC.
- Déposer une goutte d'anesthésique topique (0,5% de chlorhydrate de proparacaine) dans le sac conjonctival inférieur de l'each oeil et demander des participants de garder les yeux fermés pendant une minute.
- Evert couvercle et oculaire supérieure maintenir en place par les cils; éviter tout contact avec la zone de couvercle d'essuie-glace.
Facultatif: l'aide d'un enquêteur secondaire peut être nécessaire pour effectuer cette étape. - Appliquer la membrane perpendiculairement à la partie centrale de la région d'essuie-glace de couvercle avec une pression minimale.
- Tenir membrane en place pendant 3 - 5 sec. Observer la membrane devient translucide dans la zone de contact. À ce stade, retirer délicatement la membrane et permettre le couvercle du participant de "flip" en place.
- appliquer rapidement une goutte de PBS à l'échantillon, pour l'empêcher de se dessécher. Membrane tournera translucide et ne doit pas devenir opaque à tout moment, car cela indique le séchage. Demandez à l'enquêteur secondaire procéder immédiatement au traitement d'échantillons (section 3).
- Procéder à l'enregistrement des yeux finale pour assurer l'intégrité de la conjonctive. Distribuer des lubrifiants oculaires et instruire participantpour éviter de se frotter les yeux jusqu'à ce que l'effet anesthésique se dissipe (env. 15 min).
Traitement 3. Sample
- Utilisation de micro-ciseaux, couper la membrane dans la moitié (moitié pour chacune des analyses en aval), perpendiculairement à travers le milieu de la collecte de cellules. Couper le long de la marge extérieure de la moitié de la membrane pour le séparer du support en plastique; éviter l'interaction avec les cellules recueillies sur la membrane, y compris veiller à ce que la membrane ne se replie pas sur elle-même.
- Fixer la membrane en utilisant une pince à épiler avant complètement détacher du support. Placer la membrane dans étiqueté tube de centrifugation de 2 ml contenant 500 pi de 95% (v / v) d'éthanol et laisser fixer pour un minimum de 20 minutes à un maximum de 2 heures avant le traitement (section 4.2).
- seconde moitié immédiatement séparée de la membrane (tel que décrit dans la section 3.2) et procéder rapidement à la section 4.1.
Coloration 4. Sample
- Immunocytochemical coloration
- Placez délicatement la membrane en 35 mm à fond de verre plat de la culture avec le côté de la collection vers le bas; assurer la membrane est plate.
- Pipette 20 pi de composition de teinture immunocytochimique assemblé à l'article 1 sur la membrane. Si enroule des échantillons, utiliser des embouts de pipette jetables pour aplatir soigneusement la membrane en poussant ses bords vers le bas. Éviter tout contact avec les zones de collecte de cellules.
- couvrir délicatement la membrane avec couvercle en verre de glissement. Évitez les mouvements inutiles de l'échantillon. Couvrir le plat avec couvercle et sceller avec le laboratoire de film sur les bords. Ne pas obstruer la transparence du plat (en haut et en bas) et la visibilité de l'échantillon. Étiquette avec le marqueur de laboratoire.
- procéder immédiatement à l'imagerie (section 5.1), puis revenir à la section 4.2 de continuer avec une coloration cytologique de l'autre moitié de la membrane.
- cytologique coloration
- Hydrater progressivement la membrane en ajoutant lentement 500 ul d'eau distillée dans le tube used pour la fixation dans la section 3.4. contenu plusieurs fois Aspirer dans la pointe de pipette pour mélanger, puis retirer le contenu.
- Ajouter 500 ul d'eau distillée. Laisser reposer pendant quelques secondes, puis retirez. Ajouter 500 pi de bleu alcian tache et laisser reposer pendant 3 min. Retirer les taches et effectuer 3 l'eau consécutive distillée 500 pi rinçages ou jusqu'à ce que le liquide de rinçage clair.
- Ajouter 500 pi de hématoxyline # 1 tache et laisser reposer pendant 3 min. Retirer les taches et effectuer trois consécutifs 500 pi rinçages à l'eau distillée ou jusqu'à ce que le liquide de rinçage clair. Déshydrater (inverse de la section 4.2.1) par aspiration le liquide clair.
- Ajouter 500 pi de Papanicolaou OG-6 tache et laisser reposer pendant 3 min. Enlever les taches et effectuer une 500 ul de 95% (v / v) rinçage à l'éthanol.
- Ajouter 500 pi de Papanicolaou EA-65 tache et laisser reposer pendant 3 min. Supprimer les taches et effectuer 3 consécutifs 500 ul de 95% (v / v) d'éthanol rinçages.
- déshydrater complètement en utilisant trois 500 ul à 100% d'éthanol rinçages consécutifs. Utilisation de tweezers, retirer l'échantillon de la solution; éviter les zones de collecte de cellules touchantes.
- Placer la membrane sur la lame de verre; faire en sorte que la ligne de collecte de cellules est parallèle ou perpendiculaire à coulisser marge pour faciliter l'alignement lors de l'imagerie.
- Appliquez une goutte de 100% d'éthanol et couvrir avec glissement de verre. procéder immédiatement à l'imagerie (section 5.2).
Imaging 5. Sample
- Imagerie de fluorescence immunocytochimiques Taches
- Utiliser un microscope confocal à balayage laser (CLSM) 11 ou un microscope à fluorescence 12, équipé d'une caméra couleur numérique, connecté à un ordinateur exécutant un logiciel d'acquisition d'images. En raison des échantillons étant contenu dans des boîtes de culture, d'un microscope inversé peut être nécessaire.
- Mettre en place un microscope 11,12 selon les spectres d'absorption et d' émission de éthidium homodimère-1 (528/617 nm des maxima Ex / Em , en présence d'ADN) et la calcéine AM (494/517 nm Ex / Em maxima).
- Sélectionnez le plus faible grossissement du microscope (par exemple, l' objectif 2.5X) et activer le système d'imagerie numérique; observer l'échantillon affiché sur l'écran d'ordinateur.
- Inspecter l'échantillon pour les fonctions cellulaires d'intérêt.
- Sélectionner le grossissement désiré du microscope et acquérir des images à l'aide d'un logiciel d'imagerie.
- Enregistrer les fichiers dans les deux format de fichier natif microscope ou un format de fichier non compressé (par exemple, * .raw, * .tiff).
- Imaging cytologique Taches
- Utilisez un microscope standard champ lumineux de laboratoire sans filtre, équipé d'une caméra numérique couleur, relié à un ordinateur exécutant un logiciel d'acquisition d'image.
- Lieu et lame de verre serrure (de l'étape 4.2.8) sur la scène du microscope. Réhydrater échantillon avec 100% d'éthanol comme nécessaire, tout au long de la procédure d'imagerie.
- Sélectionnez le plus faible grossissement du microscope (par exemple, l' objectif 2.5X) et activer ee système d'imagerie numérique; observer l'échantillon affiché sur l'écran d'ordinateur.
- Assurer la collecte des cellules est aligné avec l'un des axes X ou Y de contrôle de la platine du microscope. Ajuster si nécessaire, en retirant la lamelle et la rotation de l'échantillon à l'aide d'une pipette ou d'une pince.
- En utilisant le logiciel d'imagerie, l'image (s) de capture de l'ensemble de l'échantillon ayant la plus faible grossissement du microscope.
- Passer à un grossissement de microscope modérée (par exemple, 10 - 20X objectif) et régler la source de lumière du microscope et des paramètres d'imagerie de logiciels (exposition, contraste, balance des blancs, etc.), et désactiver leur contrôle de logiciel automatisé. Enregistrer ces paramètres pour une utilisation future.
- Déterminer les points de balayage (par exemple, en haut à gauche et coins bas à droite de la collecte de cellules) début et de fin.
- En utilisant le logiciel d'imagerie, l'image (s) de capture de l'ensemble de la zone de collecte des cellules à l'intérieur des points de départ et de fin. Veiller à 20% d'un côté à côté et de haut en bas se chevauchent entreen toutes les images adjacentes.
- Enregistrer les fichiers en utilisant le format de fichier natif microscope ou un format de fichier non compressé (par exemple, * .raw, * .tiff).
- Générer image panoramique finale en utilisant un logiciel automatisé de couture de choix (par exemple, Adobe Photoshop Elements). Utiliser des images de référence prises à l'étape 5.2.5) pour confirmer l'exactitude de la couture automatisée dans l'image finale.
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Representative Results
La membrane de culture cellulaire sur enjambé le support en plastique est un outil pratique pour recueillir l'ordinateur de poche des cellules épithéliales de la conjonctive couvercle d'essuie-glace. Ce procédé élimine le besoin d'instruments stérilisés supplémentaires généralement utilisés pour préparer et gérer les membranes de circuits intégrés. La figure 1 représente le circuit intégré de la zone d'essuyage de couvercle au moyen d' un insert de culture cellulaire. Nous avons optimisé deux protocoles de coloration différentes qui se complètent mutuellement pour caractériser les cellules épithéliales de la zone d'essuyage de couvercle d'une façon nouvelle. Des colorants immunocytochimiques fluorescents révèlent une activité estérase, un indicateur de la viabilité des cellules et des acides nucléiques, la coloration qui reflète la cellule compromis de la membrane, comme représenté sur la figure 2. Le protocole de coloration cytologique permet une distinction fine entre kératinisation degrés. La figure 3 montre la transition entre le faible kératinisation de la conjonctive du tarse et de la kératine avancéesation dans le couvercle glace conjonctive et de l'épiderme. imagerie panoramique des collections de cellule cytologique taché permet l'analyse de toute la zone de recouvrement, par opposition à une région sélectionnée d'intérêt. La résolution d'image est suffisante pour zoomer jusqu'au niveau nucléaire; la morphologie des cellules peut être déterminée avec précision. La figure 4 montre l'image finale d'une collection de cellules cytologique taché, cousues ensemble à l' aide d' env. 100 fichiers haute résolution séparés. Ces outils peuvent être utilisés pour évaluer les effets de la friction et / ou les yeux secs d'une manière nouvelle.
Figure 1. Impression cytologique du couvercle d' essuie - glace zone. Impression cytologique réalisée sur le couvercle région d'essuie - glace exposée par éversion de la paupière supérieure. Membrane utilisée est la cellule Culture Insertion, 12 mm, PTFE hydrophile. Notez les onglets du support de membrane, qui peut être retenue (contrairement préétudes précé- sur la conjonctive bulbaire, dans lequel ils ont été enlevés avant l'application) car ils ne nuisent pas à l' application de la membrane sur le bord de la paupière étroite et peut effectivement aider l' alignement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Cellules fluorescentes à partir du couvercle d' essuie - glace et région. Confocale à balayage laser en microscopie montrant la variation de la morphologie des cellules entre les grandes cellules squameuses (A) et les cellules colonnaires / cuboïde plus petites (b). La fluorescence verte de la calcéine AM indique une activité d'estérase dans le corps de la cellule ( par exemple, la viabilité cellulaire). la fluorescence rouge de éthidium révèle des acides nucléiques, ce qui indique un compromis de la membrane cellulaire. Peu de cellules montrent un vert intense et aucune fluorescence rouge, éventuellement en dicative de l' intégrité de la membrane cellulaire (c). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. cytologique Coloration des IC Sample. Les cellules de la région montrent le couvercle d'essuie - glace morphologie et différents degrés de kératinisation variables. Bleu Couleur des petites, colonnaires et cuboïdes cellules avec de grands noyaux, trouvés dans la conjonctive marginale / tarse, indique l'absence de kératinisation (a); rouge / orange tache de grandes cellules squameuses avec des noyaux condensés de la jonction muco-cutanée (ligne MCJ / Marx ») et anucléées cellules de l'épiderme représente kératinisation avancé (c). couleur de transition (rouge / bleu) et la morphologie des cellules dans le couvercle racleur zone conjonctivale suggèrent kératinisation limité (b).g3large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Image composite du couvercle d' essuie - glace cellulaire Collection. Impression cytologie de la zone d'essuie - glace du couvercle après coloration cytologique. Image cousues ensemble à l'aide d'env. 100 photos individuelles prises avec un microscope et objectif 20X. (A) Petit colonnaire / cellules épithéliales cubiques du tarse / conjonctive marginale. Les cellules ici présentent / couleur vert bleu / violet indiquant aucune kératinisation; (B) des cellules de la conjonctive, le couvercle d'essuie-glace de transition dans la morphologie et la couleur des taches entre les zones (a) et (c); (C) grandes cellules squameuses de la ligne muco-cutanée jonction / Marx ». Orange tache de couleur indique un certain degré de kératinisation, et rouge / rose indique la fin de l'étape de transition épidermoïde; (D) meibum impression; (E) nucléaire est, les cellules cornées de l'épiderme; (F) Gimpression cellulaire Oblet ou mucines film lacrymal. Flèche vers le bas indique la zone conjonctival tarsien, flèche vers le haut indique le couvercle externe. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Impression cytologique est généralement effectuée sur la conjonctive bulbaire, en utilisant des membranes d'ester de cellulose mixte. Les échantillons sont coupés à la taille des feuilles de matériau en vrac, stérilisées, appliqué et retiré de la surface de la conjonctive à l'aide de pinces. En utilisant le même matériau de membrane, d' un dispositif à circuit intégré commandé par le piston a récemment été conçue pour correspondre à la géométrie de surface de la conjonctive bulbaire, et maintenir une pression constante entre les applications 13. Ces approches sont inefficaces pour l'étroit, couvercle en évidence courbe glace région (voir Figure 1). En outre, des membranes d'ester de cellulose mixte ne fournissent pas la transparence nécessaire pour les configurations où la microscopie en champ clair est nécessaire d'aligner des échantillons avant l'imagerie de fluorescence. Les inserts de culture cellulaire proposées dans ce protocole sont pratiques car ils sont stérilisés, idéalement dimensionné et peuvent être traitées manuellement, sans autre équipement, assurant collections rapides. Les membranes sont fabriquées à partirPTFE hydrophile, ce qui assure une transparence suffisante pour une analyse en microscopie confocale.
Dans l' ensemble, les caractéristiques morphologiques des cellules recueillies coïncident avec les rapports de la littérature précédents 7,8,14,15. Remplacement de la couramment utilisé (et chromatiquement très intense) l' acide-Schiff (PAS) tache périodique avec le bleu alcian permet pour les colorants Papanicolaou ultérieurs pour afficher une variation plus fine chromatique, ce qui permet une perspective plus détaillée sur le niveau de la kératinisation cellulaire, que rapporté avant 7,8.
imagerie microscopique d'échantillons cytologiques implique généralement une inspection visuelle à travers les oculaires, et fort grossissement photographie des structures jugées «d'intérêt». Avec cette approche, les aspects "plus grande image» de l'ensemble de la collection peuvent être perdues. Coups de faible grossissement sont généralement de qualité optique inférieure ( en raison du vignettage, les aberrations, etc.) et la résolution est insuffisante pour décrire en détail cellulaires. Le protocole panoramique de couture proposé ici, alors qu'un peu plus de temps, est avantageux, car il donne un aperçu de la membrane complète, ainsi que la possibilité de zoomer sur des détails nucléaires, le tout dans une seule image. Mesures quantitatives telles que le nombre de cellules, nucléaires cytoplasmique (NC) rapport 16 et les distances peuvent être calculées ici.
Il y a trois étapes critiques dans le protocole qui nécessitent une attention particulière: l'application correcte de la membrane sur la conjonctive (section 2.4), la synchronisation entre les étapes de traitement des échantillons (sections 2.6 et 3 à 5) et les paramètres d'imagerie cohérents pour la couture panoramique optimale (section 5.2 .6 - 5.2.8). Contrairement à la conjonctive bulbaire relativement plat, le couvercle essuie région a une courbure prononcée, couvrant une largeur étroite de seulement 1 - 2 mm entre l'épiderme et le sulcus tarse. Il est essentiel que la membrane soit appliquée à l'angle correct, car cela peut grandement influencer le type de cellules recueillies. Deuxièmement, mempression brane doit être cohérente entre les applications. L'enquêteur doit donc développer la dextérité nécessaire pour assurer les collections répétables. Une fois que les échantillons sont prélevés à l'aide de la technique de cytologie d'impression, le calendrier de traitement devient crucial. Les échantillons ne devraient jamais être autorisés à sécher, à savoir, la membrane ne doit pas devenir opaques (sections 2.6, 3 à 5). Bien que l'échantillon à subir une coloration cytologique peut être laissé dans le fixateur pendant une période prolongée (20 min - 2 h), les taches immunocytochimiques devraient être ajoutés et imagés sans délai, afin d'évaluer la viabilité des cellules aussi précisément que possible. La cohérence du timing est également essentiel pour obtenir des résultats comparables entre les échantillons; on devrait viser à maintenir fixation et de coloration fois égal pour tous les échantillons à comparer. Enfin, afin d'obtenir des images panoramiques qualitatives de l'échantillon de cytologie, tous les paramètres d'imagerie (intensité de microscope optique, exposition de l' appareil, le contraste, la balance des blancs, etc.)doit être étalonné à une région représentative de l'échantillon, avec la plus grande diversité de caractéristiques d'intérêt ( par exemple, les types de cellules), et tout dosage automatique est désactivé pour les suivantes (section 5.2.6). L'enquêteur doit aussi viser à orienter la collecte de cellules en ligne avec soit l'axe X ou Y de la platine du microscope. Cela facilitera l'acquisition de l'image et le processus de couture. But pour repérer et utiliser traits distinctifs sur l'échantillon (par exemple, des plaques de cellules, meibum, débris, etc.) dans les zones de chevauchement entre les images adjacentes. La mise au point du microscope doit être le seul ajustement à corriger entre les prises.
La limitation de cette technique réside dans la variabilité des collections de cellules, comme initialement observée par Jalbert 8, qui a rapporté un taux de réussite de 67% dans l' obtention des correctifs confluentes de cellules couvercle d'essuie - glace. L'angle d'application dicte le nombre et le type de cellules recueillies. À ce stade, il est incertain wu'il qualité de collection (nombre de cellules sur l'échantillon) est corrélée à la santé oculaire. Les essais cliniques avec des échantillons plus importants sont nécessaires pour prouver la validité de cette technique. Un autre inconvénient réside dans le caractère envahissant inhérente à la technique de circuit intégré lui-même. Les couches de cellules supérieures sont enlevées avec force à partir de la conjonctive, ce qui peut provoquer des dommages. Alors que les taches immunocytochimiques sont destinés à refléter la viabilité des cellules (et l'activité estérase est présent dans toutes les collections), on ne sait pas ce que la fluorescence rouge de noyaux de cellules dans nos collections indiquent. De temps en temps, meibum (ie, les lipides sécrétés au bord de la paupière) et d' autres composants de la surface oculaire ou film lacrymal aura tendance à couvrir les caractéristiques cellulaires et rendent difficile l' analyse , voire impossible. Le protocole peut être modifié avec un rinçage supplémentaire dans Xylène pour éliminer les lipides meibum. Enfin, l'effet de gouttes anesthésiques sur les cellules conjonctivales est inconnue.
Obtenir des données de la structure cellulaire de la région couvercle d'essuie-glace va aider à vérifier la corrélation entre la friction qui se produit entre ces cellules et la surface oculaire, et le confort subjective. Cela fournira de précieuses connaissances et permettre de futurs essais cliniques pour explorer les particularités cellulaires des porteurs de lentilles de contact, les sujets avec couvercle glace épithéliopathie, les symptômes oculaires ou sécheresse sèches, contrairement aux sujets asymptomatiques, pour jeter, espérons la lumière sur le sujet de l'inconfort oculaire.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue, 1% in 3% Acetic Acid | Sigma | B8438-250ML | |
| Hematoxylin, Gill 1 | Sigma | GHS116-500ML | |
| Papanicolaou stain, OG-6 | Sigma | HT40116-500 ml | |
| Papanicolaou stain, Modified EA | Sigma | HT40232-1L | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies | L-3224 | contains ethidium homodimer-1 and Calcein AM dyes |
| Alcaine (0.5% proparacaine hydrochloride) | Alcon | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | EMD Millipore | PICM01250 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |
References
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