Introduction
Den menneskelige øvre øyelokk utfører rundt 10.000 blinker hver dag en, med bare en 1 - 2 mm smal konjunktival region motstrid okulær kloden. På grunn av sin tørke bevegelse under blink, har denne del av lokket margin blitt kalt "lokket vindusvisker" region 2. Det antas at friksjonen økes i dette område i løpet av sedvanlig blinkingen, på grunn av lokket tørke over hele kloden. Dette kan spille en betydelig rolle i okulær komfort. Kontaktlinsebrukere særlig erfaring ubehag i øyet, og dette er en av de viktigste årsakene til å slutte linse slitasje tre. Når en kontaktlinse er plassert på øyet, er friksjonskoeffisienten mellom linsematerialet og den okulære overflate vist seg å endre 4. Det er bevis som tyder på at tørrhetssymptomer kan være relatert til dette endret friksjon 2,5,6.
Denne foreningen kan også gjenspeiles i klinisk observerbare fenomener, spesielt lokk wiper epitheliopathy (LWE), også kalt øvre øyelokk margin farging (ULMS) 6. LWE er et tidlig tegn på okulær irritasjon og en potensiell prediktor for sykdommen tørre øyne. Det er observert og målt ved den vitale farging av de øvre og nedre lokk margin regioner. Selv om dette karakterskala to og klinisk validitet (dvs. sammenheng med subjektive symptomer) er fortsatt under debatt, ubehag i øyet er fortsatt en gåte for klinikere og forskere både og, viktigst, en ulempe for pasientene.
To-date, er lite kjent om klinisk relevante variasjoner i (sub-) cellulære anatomi og fysiologi av lokket visker området 7 og bare en rapport gjør bruk av cytologiske metoder 8. Impression cytologi (IC) har vært ansatt i over 40 år å samle celler fra epithelial overflaten av slagflaten eller tarsal conjunctiva ved anvendelse av en membran 9,10. Ved fjerning de adherente celler gjennomgår cytological farging og mikroskopisk bildebehandling. På grunn av de anatomiske og cellulære forskjeller i lokket visker region, krever denne teknikk optimalisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk uttalelse: Før samle celler fra mennesker, informert samtykke og må innhentes etikk godkjenning.
1. Forbered Stain
MERK: Forbered flekk på dagen for forsøket.
- Tilsett 5 ul Ethidium (eller 4 uM) og 5 ul Calcein AM (eller 4 uM) til 2,5 ml fosfatbufret saltoppløsning (PBS) i 15 ml sentrifugerør; blande. Pakk inn i aluminiumsfolie for å skjerme mot lys og oppbevares ved romtemperatur før bruk.
2. samle celler
- Fjern cellekultur inserts fra sin pakke og merke for hvert øyelokk skal tas prøver. Mark orientering av celleansamling på den side av membranen plastholderen ved hjelp av permanent markør. Conduct spaltelampe inspeksjon ved moderat forstørrelse (ca. 20X) for å bekrefte riktig helsen til regionen for å gjennomgå IC.
- Tilsett en dråpe aktuell bedøvelse (0,5% proparacaine hydroklorid) i nedre konjunktivalsekken each øye og instruere deltaker å holde øynene lukket i ett minutt.
- Evert øvre øyelokket og hold på plass av vippene; unngå kontakt med lokket svisker området.
Valgfritt: Ved hjelp av en sekundær etterforsker kan være nødvendig å utføre dette trinnet. - Anvende membran vinkelrett på den sentrale del av lokket visker regionen med minimalt trykk.
- Hold membran på plass for 3-5 sek. Observer membranen bli gjennomskinnelig i kontaktområdet. På dette punktet, forsiktig fjerne membranen og tillate deltakerens lokket til "flip" tilbake på plass.
- Skyll gjelder en dråpe PBS til prøven, for å hindre at den tørker ut. Membranen vil slå gjennomskinnelig og skal ikke slå ugjennomsiktig til enhver tid, da det betyr tørking. Har den sekundære etterforsker fortsette umiddelbart med behandling av prøver (§ 3).
- Gjennomføre siste sjekk øye for å sikre integriteten til conjunctiva. Tilsett okulær smøremidler og instruere deltakerå unngå å gni øynene til bedøvelse effekten avtar (ca. 15 min.).
3. prøvebehandling
- Ved hjelp av mikro-saks, kuttet membranen i to (en halvdel for hver av de nedstrøms analyser), vinkelrett gjennom midten av cellen samlingen. Skjæres langs den ytre kanten av en membran halv å skille det fra plastholderen; unngå interaksjon med de oppsamlede cellene på membranen, herunder å sikre at membranen ikke kaste på seg selv.
- Sikre membranen ved hjelp av pinsett før helt løsne fra holderen. Plasser membranen inn merket 2 ml sentrifugerør inneholder 500 mL av 95% (v / v) etanol og la til rette for minimum 20 min til maksimalt 2 timer før (punkt 4.2) behandling.
- Umiddelbart separat andre halvdel av membran (som beskrevet i kapittel 3.2) og straks fortsette med avsnitt 4.1.
4. Prøve Farging
- Immunocytochemical Farging
- plassere membranen forsiktig i 35 mm glassbunn kultur tallerken med samling siden ned; sikre membran er flat.
- Pipetter 20 mL av immunocytokjemisk flekken sammensetning montert i § 1 på membranen. Hvis prøve krøller opp, bruke engangs pipettespisser å nøye flate membranen ved å trykke kantene ned. Unngå kontakt med cellen samling områder.
- Forsiktig dekke membranen med glass dekkglass. Unngå unødvendig bevegelse av prøven. Dekk fatet med lokk og forsegle med lab-film rundt kantene. Ikke blokker åpenhet av fatet (topp og bunn) og synligheten av prøven. Merk med lab markør.
- Umiddelbart fortsette med imaging (punkt 5.1), deretter tilbake til avsnitt 4.2 for å fortsette med cytologisk farging av den andre halvparten av membranen.
- cytologisk Farging
- Gradvis hydrat membran ved langsom tilsetning av 500 mL av destillert vann til røret used for fiksering i avsnitt 3.4. Sug innholdet flere ganger i pipette til å blande, og deretter fjerne innholdet.
- Legg 500 mL av destillert vann. La stå i noen sekunder, og deretter fjerne. Legg 500 mL av Alcian blå flekken og la stå i 3 min. Fjern flekken og utføre tre påfølgende 500 mL destillert vann skyller eller til væsken skyller klart.
- Legg 500 mL av Hematoxylin # 1 flekken og la stå i 3 min. Fjern flekken og utføre tre påfølgende 500 mL destillert vann skyller eller til væsken skyller klart. Dehydrere (omvendt § 4.2.1) ved å suge den klare væsken.
- Legg 500 mL av Papanicolaou OG-6 flekken og la stå i 3 min. Fjern flekken og utføre en 500 mL 95% (v / v) etanol skylling.
- Legg 500 mL av Papanicolaou EA-65 flekken og la stå i 3 min. Fjerne flekker og utføre tre påfølgende 500 ul 95% (v / v) etanol skyllinger.
- Fullt dehydrere bruker tre påfølgende 500 mL 100% etanol skyllinger. Bruke TWEezers, fjern prøven fra løsning; unngå å berøre celle samling områder.
- Plasser membran på glass lysbilde; sørge for at celle samling linjen er enten parallelt eller vinkelrett å skyve margin for enklere justering under bildebehandling.
- Påfør en dråpe 100% etanol og dekke med glass slip. Umiddelbart fortsette med imaging (punkt 5.2).
5. Prøve Imaging
- Imaging Fluorescent immunocytokjemisk Flekker
- Bruke en konfokal laser scanning mikroskop (CLSM) 11 eller fluorescens mikroskop 12, som er utstyrt med et digitalt fargekamera, som er koblet til en datamaskin som kjører et bilde-innhentings programvare. På grunn av de prøvene som inneholdt i kulturskåler, kan et invertert mikroskop være nødvendig.
- Sett opp mikroskop 11,12 henhold til absorpsjon og emisjonsspektra av ethidium homodimer-1 (528/617 nm Ex / Em maksima i nærvær av DNA) og calcein AM (494/517 nm Ex / Em maxima).
- Velg mikroskop laveste forstørrelse (f.eks 2,5x objektiv) og aktivere digital bildebehandling system; observere prøven som vises på dataskjermen.
- Inspiser prøven for cellulære funksjoner av interesse.
- Velg ønsket mikroskop forstørrelse og hente bilder ved hjelp av bildebehandlingsprogrammer.
- Lagre filer i enten mors mikroskop filformat eller en ukomprimert filformat (for eksempel * .RAW, * .tiff).
- Imaging Cytologisk Flekker
- Bruk en standard laboratorium lyse-feltet mikroskop med ingen filtre, utstyrt med et digitalt fargekamera, koblet til en datamaskin som kjører et image oppkjøpet programvare.
- Plasser og lås glass-slide (fra trinn 4.2.8) på mikroskop scenen. Rehydrere prøven med 100% etanol etter behov, under hele avbildningsprosedyren.
- Velg mikroskop laveste forstørrelse (f.eks 2,5x objektiv) og aktivere the digital bildebehandling system; observere prøven som vises på dataskjermen.
- Sørg celle samling er på linje med enten X eller Y-aksen av mikroskop scenen kontroll. Juster hvis nødvendig, ved å fjerne dekkglass og rotere prøven ved hjelp av en pipette eller pinsett.
- Ved hjelp av tilsvarende programvare fange bilde (r) av hele prøven med lavest mikroskop forstørrelse.
- Bytt til moderat mikroskop forstørrelse (f.eks 10 - 20X objektiv) og juster mikroskop lyskilde og programvarebildeparametre (eksponering, kontrast, hvitbalanse, etc.), og deaktivere deres automatisert programvare måling. Lagre disse innstillingene for fremtidig bruk.
- Bestem start- og sluttpunktene for skanning (f.eks øverst til venstre og nederst til høyre hjørne av cellen samling).
- Ved hjelp av bildebehandlingsprogrammer, ta bilde (r) av hele cellen samling område innenfor start- og sluttpunktene. Sikre en 20% side-til-side og topp til bunn overlapping between alle tilstøtende bilder.
- Lagre filer med de innfødte mikroskop filformatet eller en ukomprimert filformat (for eksempel * .RAW, * .tiff).
- Generere endelige panoramabilde ved hjelp av automatisert søm programvare for valg (for eksempel Adobe Photoshop Elements). Bruk referanse bilder tatt på trinn 5.2.5) for å bekrefte riktigheten av automatiserte søm i det endelige bildet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den cellekultur membran strakte seg over plastholderen er et praktisk verktøy for håndholdt samling av epitelceller fra lokket svisker conjunctiva. Denne metoden eliminerer behovet for ytterligere steriliserte instrumenter som vanligvis brukes for å fremstille og håndtere IC membraner. Figur 1 viser IC av lokket visker området ved hjelp av en cellekulturinnsats. Vi optimalisert to forskjellige fargeprotokoller som utfyller hverandre for å karakterisere epitelceller fra lokket svisker området i en roman mote. Fluorescerende immunocytokjemiske fargestoffer åpenbare esteraseaktivitet, en indikator på cellelevedyktigheten, og nukleinsyrer, til farging av noe som gjenspeiler cellemembranen kompromiss, som vist i figur 2. Den cytologiske farging protokollen tillater for en klar distinksjon mellom keratinisasjonsvirkninger grader. Figur 3 viser overgangen mellom lav keratinization i tarsal conjunctiva og avansert keratiniseringen i lokket svisker konjunktiva og epidermis. Panoramic avbildning av cytologi-farget cellesamlinger tillater analyse av hele samlingen området, i motsetning til et valgt område av interesse. Bildeoppløsningen er tilstrekkelig for å zoome til atomnivå; cellemorfologi kan bestemmes med nøyaktighet. Figur 4 viser den endelige bilde av et cytologisk farget celleansamling, sydd sammen ved hjelp av omtrent. 100 separate høyoppløste filer. Disse verktøyene kan anvendes for å vurdere virkningene av friksjon og / eller tørt øye på en ny måte.
Figur 1. Impression Cytologi av Lid Wiper området. Impression cytologi utført på lokket svisker regionen utsatt ved vrenging av det øvre øyelokket. Membranen som benyttes er den Cell Culture Sett, 12 mm, hydrofil PTFE. Merk kategoriene i membranen holder, som kan beholdes (i motsetning til pregere studier på slagflaten conjunctiva, der de ble fjernet før søknad) som de ikke kommer i konflikt med påføring av membranen på den smale kanten av øyelokket og kan faktisk hjelpe justering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Fluorescent Celler fra Lid Wiper Region. Confocal laser scanning mikroskopi som viser variasjonen av cellen morfologi mellom store plateepitel celler (A) og de mindre søyle / cuboidal celler (b). Grønn fluorescens av Calcein AM indikerer esteraseaktivitet i cellelegemet (dvs. cellenes levedyktighet). Rød fluorescens fra Ethidium avslører nukleinsyrer, noe som indikerer cellemembran kompromiss. Få celler viser intens grønn og ingen rød fluorescens, eventuelt i dicative av cellemembranen integritet (c). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Cytologisk Farging av IC Sample. Celler av lokket svisker regionen viser varierende morfologi og ulike keratinisasjonsvirkninger grader. Blå farge av små, søyle og cuboidal celler med store kjerner, som finnes i den marginale / tarsal conjunctiva, indikerer at det ikke keratinisering (a); rød / orange flekk av store plateepitel celler med kondenserte kjerner av muco-kutan knutepunkt (MCJ / Marx 'linje) og anuclear celler i overhuden representerer avansert keratinisering (c). Transitional farge (rød / blå) og morfologi av celler i lokket svisker konjunktival området foreslår begrenset keratinization (b).g3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Composite Bilde av Lid Wiper Cell Collection. Impression cytologi av lokket svisker området etter cytologisk farging. Bilde sydd sammen ved hjelp av ca.. 100 enkeltbilder tatt med et mikroskop og 20X objektiv. (A) Lite søyle / cuboidal epitelceller i tarsal / marginal conjunctiva. Cellene her utviser blå / grønn / lilla farge indikerer ingen keratinization; (B) celler av lokket visker conjunctiva, overgangs i morfologi og flekkfarge mellom regioner (a) og (c); (C) store plateepitel celler av muco-kutan junction / Marx 'linje. Orange flekk farge indikerer en viss grad av keratinization, og rød / rosa indikerer sent stadium plateepitel overgang; (D) Meibum inntrykk; (E) anuclear, forhomede celler i overhuden; (F) Goblet celle inntrykk eller rive film slimstoffer. Nedadgående pil viser tarsal konjunktival området indikerer oppover pil ytre lokket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Impression cytologi er vanligvis utføres på slagflaten konjunktiva, ved hjelp av blandet celluloseestermembraner. Prøver som er kuttet til riktig størrelse fra massegods ark, sterilisert, brukes og fjernes fra bindehinneoverflaten ved hjelp av tang. Ved bruk av samme membranmaterialet, ble en stempelstyrt IC-enheten nylig er utformet for å samsvare med overflaten geometrien til slagflaten conjunctiva, og opprettholde konsistente trykk mellom programmer 13. Disse metodene er ineffektive for den smale, fremtredende buet lokk svisker region (se figur 1). I tillegg gjør blandet celluloseestermembraner ikke gi nødvendig innsyn for oppsett hvor lyse felt mikroskopi er nødvendig å justere prøver før fluorescerende bildebehandling. Cellekultur innsatser som foreslås i denne protokollen er praktisk fordi de er sterilisert, ideell størrelse og kan håndteres manuelt, uten ytterligere utstyr som sikrer rask samlinger. Membranene er fremstilt avhydrofil PTFE, som gir tilstrekkelig åpenhet for konfokalmikroskopi analyse.
Totalt sett morfologiske trekk av oppsamlede celler sammenfaller med tidligere litteratur rapporter 7,8,14,15. Skifte brukte (og kromatisk veldig intens) periodisk syre-Schiff (PAS) flekken med Alcian blå åpner for påfølgende Papanicolaou fargestoffer for å vise finere kromatisk variasjon, slik at en mer detaljert perspektiv på celle keratinization nivå, enn rapportert før 7,8.
Mikroskopisk avbildning av cytologiske prøver vanligvis innebærer visuell inspeksjon gjennom okularene og høy forstørrelse fotografering av strukturer anses "av interesse". Med denne tilnærmingen, kan "store bildet" aspekter av hele samlingen tapt. Lav forstørrelse skudd er vanligvis av dårlig optisk kvalitet (pga vignettering, avvik, osv) og oppløsningen er tilstrekkelig til å skildre cellular detaljs. Dette panorama protokollen foreslått her, mens litt mer tidkrevende, er en fordel, da det gir en oversikt over hele membranen, samt muligheten til å zoome inn på atom detalj, alt i ett bilde. Kvantitative beregninger som legemer, kan atom cytoplasma (NC) ratio 16 og avstander beregnes her.
Det er tre viktige skritt i protokollen som krever spesiell oppmerksomhet: riktig anvendelse av membranen på konjunktiva (punkt 2.4), timing mellom prøvebehandlingstrinn (avsnitt 2.6 og 3 til 5) og konsekvent bildeparametere for optimal panorama søm (punkt 5.2 0,6 - 5.2.8). I motsetning til den relativt flat slagflaten konjunktiva, lokket svisker regionen har en uttalt krumning, som spenner over en smal bredde på kun 1-2 mm mellom epidermis og tarsal sulcus. Det er viktig at membranen skal anvendes i riktig vinkel, da dette kan i stor grad påvirke den type celler som samles inn. Dernest, memBrane press burde være konsekvent mellom programmer. Etterforskeren bør derfor utvikle den nødvendige ferdighet for å sikre repeterbare samlinger. Etter at prøvene er samlet ved hjelp av inntrykk cytologi teknikk, blir tidspunktet for behandlingen avgjørende. Prøvene bør aldri få lov til å tørke ut, dvs. membranen bør ikke bli ugjennomsiktige (§§ 2.6, 3 til 5). Mens prøven for å gjennomgå cytological flekker kan stå i fiksativ i en lengre tid (20 min - 2 timer), bør immunocytokjemiske flekker tilsettes og avbildes uten forsinkelse, for å vurdere cellelevedyktighet så nøyaktig som mulig. Konsistens av timing er også viktig for sammenlignbare resultater mellom prøvene; man bør ta sikte på å holde feste og farging ganger lik for alle prøver som skal sammenlignes. Til slutt, for å få kvalitative panoramabilder av cytologi prøven, alle bildeparametre (mikroskop lysintensitet, kamera eksponering, kontrast, hvitbalanse, etc.)bør kalibreres med en representant region av prøven, med høyest mangfold av funksjoner av interesse (dvs. celletyper), og alt automatisert måling deaktiveres for påfølgende skudd (§ 5.2.6). Undersøkeren bør også sikte på å orientere den celleansamling på linje med enten X- eller Y-aksen av mikroskop scenen. Dette vil lette bildet anskaffelses og søm prosessen. Mål å finne og bruke særpreg på prøven (f.eks celle patcher, meibum, rusk, etc.) i de overlappende områdene mellom tilstøtende bilder. Mikroskopet fokus bør være den eneste justeringen som skal korrigeres mellom skuddene.
Begrensningen av denne teknikken ligger i variasjonen av cellesamlinger, som opprinnelig observert av Jalbert 8, som rapporterte en 67% suksessrate i å skaffe konfluente flekker av lokket visker celler. Søknaden vinkel bestemmer antall og type celler oppsamlet. På dette stadiet er det usikkert whether samling kvalitet (dvs. antall celler i prøven) er korrelert med okular helse. Kliniske studier med større utvalgsstørrelsene er nødvendig for å bevise gyldigheten av denne teknikken. En ytterligere ulempe ligger i den iboende invasivitet av IC-teknikken i seg selv. Den overlegne cellelag blir kraftig fjernet fra konjunktiva og dette kan forårsake skade. Mens immunocytokjemiske flekker er ment å gjenspeile celleviabilitet (og esterase aktivitet er til stede i alle samlinger), er det uklart hva den røde fluorescens cellekjerner i våre samlinger tilsi. Av og til, meibum (dvs. lipider skilles ut ved lokket marg) og andre komponenter fra den okulære overflaten eller tårefilm vil ha en tendens til å dekke cellulære funksjoner og gjøre analysen vanskelig eller umulig. Protokollen kan være modifisert med en ekstra skylling i xylen for å fjerne meibum lipider. Til slutt, er effekten av anestesi dråper på konjunktivale celler ukjent.
Innhenting av data fra cellestrukturen av lokket visker region vil bidra til å verifisere korrelasjonen mellom den friksjonen som oppstår mellom disse celler og okulær overflate, og subjektive komfort. Dette vil gi verdifull kunnskap og tillate fremtidige kliniske studier for å utforske de cellulære særegenkontaktlinsebrukere, personer med lokk svisker epitheliopathy, tørre øyne eller tørrhetssymptomer, i motsetning til asymptomatiske fag, for å forhåpentligvis belyse temaet ubehag i øyet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue, 1% in 3% Acetic Acid | Sigma | B8438-250ML | |
| Hematoxylin, Gill 1 | Sigma | GHS116-500ML | |
| Papanicolaou stain, OG-6 | Sigma | HT40116-500 ml | |
| Papanicolaou stain, Modified EA | Sigma | HT40232-1L | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies | L-3224 | contains ethidium homodimer-1 and Calcein AM dyes |
| Alcaine (0.5% proparacaine hydrochloride) | Alcon | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | EMD Millipore | PICM01250 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |
References
- Barbato, G., et al. Diurnal variation in spontaneous eye-blink rate. Psychiatry Res. 93, 145-151 (2000).
- Korb, D. R., et al. Lid-Wiper Epitheliopathy and Dry-Eye Symptoms in Contact Lens Wearers. Eye & Contact Lens. 28, 211-216 (2002).
- Dumbleton, K., Woods, C. A., Jones, L. W., Fonn, D. The impact of contemporary contact lenses on contact lens discontinuation. Eye & Contact Lens. 39, 93-99 (2013).
- Roba, M., Duncan, E., Hill, G., Spencer, N., Tosatti, S. Friction measurements on contact lenses in their operating environment. Tribol Lett. 44, 387-397 (2011).
- Sickenberger, W., Pult, H., Sickenberger, B. LIPCOF and contact lens wearers: a new tool to forecast subjective dryness and degree of comfort of contact lens wearers. Contactologia. 22, 74-79 (2000).
- Pult, H., Purslow, C., Berry, M., Murphy, P. J. Clinical tests for successful contact lens wear: relationship and predictive potential. Optom Vis Sci. 85, E924-E929 (2008).
- Doughty, M. J. Morphological features of cells along Marx's line of the marginal conjunctiva of the human eyelid. Clin Exp Optom. 96, 76-84 (2013).
- Jalbert, I., et al. Assessing the human lid margin epithelium using impression cytology. Acta Ophthalm. 90, e547-e552 (2012).
- Nelson, J. D. Impression cytology. Cornea. 7, 71-81 (1988).
- Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. A simple conjunctival biopsy. Am J Ophthalmol. 84, 798-801 (1977).
- Wilson, T. Confocal microscopy. , Academic Press. London. 1-64 (1990).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Tomlins, P., Roy, P., Curnow, J., Rauz, S. Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival Impression for Flow Cytometry. Invest Ophthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).
- Knop, E., Korb, D. R., Blackie, C. A., Knop, N. The lid margin is an underestimated structure for preservation of ocular surface health and development of dry eye disease. Res Proj Dry Eye Syn. 45, 108-122 (2010).
- Knop, E., et al. The lid wiper and muco-cutaneous junction anatomy of the human eyelid margins: an in vivo confocal and histological study. J Anat. 218, 449-461 (2011).
- Christensen, J. A., Skaarland, E. Nuclear and cell area measurements in the cytological evaluation of pleural effusions: a study of subjective assessments and morphometric measurements. Diag Cytopathol. 3, 50-54 (1987).
