Introduction
A pálpebra superior humano executa cerca de 10.000 pisca a cada dia 1, com apenas um 1 - região conjuntival 2 milímetros estreita opostos do globo ocular. Devido ao seu movimento de limpeza durante o pestanejar, esta porção da margem da pálpebra foi denominada a "tampa do limpador" região 2. Supõe-se que o atrito é aumentada nessa região durante a piscar habitual, devido à tampa limpar todo o globo. Isto pode desempenhar um papel significativo no conforto ocular. Lente de contato usuários em particular experiência de desconforto ocular e esta é uma das razões principais para cessar o uso das lentes 3. Quando uma lente de contacto é colocada sobre o olho, o coeficiente de atrito entre o material da lente e a superfície ocular foi mostrado para alterar 4. Há evidências que sugerem que os sintomas de secura pode estar relacionado a este atrito alterado 2,5,6.
Esta associação também pode ser refletida em fenômenos observáveis clinicamente, nomeadamente wi tampapor epiteliopatia (LWE), também chamado superior da tampa margem de coloração (ULMS) 6. LWE é um sinal precoce de irritação ocular e um preditor potencial para a doença do olho seco. Ele é observado e medido pela coloração vital das regiões superiores e inferiores margem palpebral. Embora este sistema de classificação 2 e sua validade clínica (ou seja, correlação com sintomas subjetivos) ainda estão em debate, desconforto ocular permanece um enigma para os médicos e cientistas e, mais importante, um inconveniente para os pacientes.
Até à data, pouco se sabe sobre as variações clinicamente relevantes no (sub) anatomia celular e fisiologia da área do limpador a tampa 7 e apenas um relatório faz uso de métodos citológicos 8. Citologia de impressão (CI) foi utilizada há mais de 40 anos para recolher as células a partir da superfície do epitélio da conjuntiva tarsal bulbar ou por aplicação de uma membrana de 9,10. Após remoção, as células aderentes submeter Cytological coloração e de imagem microscópica. Devido às diferenças anatómicos celulares e na região do limpador a tampa, esta técnica requer a optimização.
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Protocol
declaração de ética: Antes da coleta de células de seres humanos, consentimento informado e aprovação ética deve ser obtida.
1. Prepare Stain
NOTA: Prepare mancha no dia do experimento.
- Adicionar 5 uL de etídio (ou 4 mM) e 5 ul de calceína AM (ou 4 mM) a 2,5 ml de tampão fosfato salino (PBS) em 15 ml de tubo de centrifugação; misturar. Embrulhe em papel alumínio para proteger da luz e armazenar a RT até o uso.
2. Células Colete
- Remover inserções de cultura de células a partir de sua embalagem e rotulagem para cada pálpebra a amostrar. Marca de orientação de recolha de células, no lado do suporte de plástico membrana utilizando marcador permanente. Conduta fenda inspecção lâmpada com uma ampliação moderada (aproximadamente 20X) para confirmar a saúde adequada da região de se submeter IC.
- Dispensar uma gota de anestésico tópico (0,5% de cloridrato de proparacaína) no fundo do saco conjuntival de EAch olho e instruir participante para manter os olhos fechados por um minuto.
- Evert tampa e parte superior do olho manter no lugar pelos cílios; evitar qualquer contato com a área da tampa do limpador.
Opcional: a ajuda de um investigador secundária pode ser necessário para executar esta etapa. - Aplicar membrana perpendicularmente sobre a parte central da região do limpador a tampa com o mínimo de pressão.
- Segure membrana no local por 3-5 seg. Observe a membrana se tornar translúcida na área de contato. Neste ponto, remover suavemente a membrana e permitir tampa do participante para "flip" de volta no lugar.
- Prontamente aplicar uma gota de PBS à amostra, para impedir que sequem. Membrana girará translúcida e opaca não deve ligar a qualquer momento, como isso indica secagem. Têm o investigador secundário prosseguir imediatamente com o processamento de amostras (secção 3).
- Realizar verificação final olho para garantir a integridade da conjuntiva. Dispensar lubrificantes oculares e instruir participantepara evitar esfregar os olhos até que o efeito anestésico desgasta fora (aprox. 15 min).
Processamento 3. Amostra
- Utilizando micro-tesoura, cortar a membrana na metade (metade de cada uma das análises a jusante), perpendicular através do meio da recolha de células. O corte ao longo da margem exterior de uma metade da membrana para separar o do suporte de plástico; evitar a interacção com as células recolhidas na membrana, incluindo assegurar que a membrana não se dobra sobre si própria.
- Garantir a membrana usando uma pinça antes completamente desconectar do titular. Ponto de membrana para dentro do tubo de centrífuga de 2 ml rotulados, contendo 500 ul de 95% (v / v) de etanol e deixa-se fixar durante um mínimo de 20 min a um máximo de 2 horas antes do processamento (secção 4.2).
- segunda metade imediatamente separada da membrana (como descrito na seção 3.2) e proceder imediatamente com a secção 4.1.
Coloração 4. Amostra
- Immunocytochemical coloração
- Com cuidado, coloque membrana em 35 milímetros de vidro prato de cultura inferior com o lado coleção voltada para baixo; garantir a membrana é plana.
- Pipetar 20 l de composição mancha imunocitoquímica montada na secção 1 para a membrana. Se amostra cachos, use pontas de pipeta descartáveis para achatar cuidadosamente a membrana, empurrando suas bordas para baixo. Evitar o contacto com as zonas de recolha de células.
- Gentilmente cobrir a membrana com tampa de vidro deslizante. Evite movimento desnecessário da amostra. Cubra a assadeira com tampa e vedação com laboratório de película em torno das bordas. Não obstrua a transparência de prato (superior e inferior) e visibilidade da amostra. Etiqueta com marcador de laboratório.
- proceder imediatamente à imagem (secção 5.1), em seguida, voltar a secção 4.2 para continuar com coloração citológica da outra metade da membrana.
- citológico coloração
- Gradualmente hidratar membrana por adição lenta de 500 mL de água destilada para o tubo de retornosed para fixação na secção 3.4. conteúdo aspirado várias vezes na ponta da pipeta para misturar, em seguida, remover conteúdo.
- Adicionar 500 uL de água destilada. Deixe repousar por alguns segundos, em seguida, remover. Adicionar 500 mL de mancha azul Alcian e deixe por 3 min. Remover manchas e realizar 3 consecutiva 500 mL de água destilada lavagens ou até que o líquido lavagens claras.
- Adicionar 500 mL de Hematoxilina # 1 mancha e deixe por 3 min. Remover manchas e realizar três consecutivos 500 mL lavagens água destilada ou até que o líquido lavagens claras. Desidratar (inverso do ponto 4.2.1) por aspiração do líquido claro.
- Adicionar 500 mL de Papanicolaou OG-6 mancha e deixe por 3 min. Remover mancha e executar um de 500 ul 95% (v / v) de lavagem etanol.
- Adicionar 500 ul de corante Papanicolaou EA-65 e deixar durante 3 min. Remover mancha e executar três consecutiva de 500 ul de 95% (v / v) de etanol lavagens.
- Totalmente desidratar usando 500 ul três lavagens consecutivas de 100% de etanol. usando tweezers, retirar amostra de solução; evitar áreas de coleta de células tocantes.
- Coloque membrana sobre lâmina de vidro; assegurar que a linha de colheita de células é paralela ou perpendicular a deslizar margem para o alinhamento mais fácil durante o exame.
- Aplique uma gota de etanol 100% e cubra com deslizamento de vidro. proceder imediatamente à imagem (secção 5.2).
5. Amostra de imagem
- Imagens fluorescentes imunocitoquímicos Stains
- Use um microscópio confocal de varredura a laser (CLSM) 11 ou microscópio de fluorescência 12, equipado com uma câmera de cor digital, conectado a um computador com um software de aquisição de imagem. Devido às amostras a ser contido dentro placas de cultura, um microscópio invertido pode ser necessário.
- Defina-se 11,12 microscópio de acordo com espectros de absorção e emissão de etídio homodímero-1 (528/617 nm máximos Ex / Em na presença de ADN) e calceína AM (494/517 nm Ex / Em máximos).
- Selecione menor ampliação do microscópio (por exemplo, objetiva 2,5X) e ativar o sistema de imagem digital; observar a amostra indicada no monitor do computador.
- Inspecione amostra para características celulares de interesse.
- Selecione ampliação microscópio desejado e adquirir imagens usando software de imagem.
- Salvar arquivos em qualquer formato de arquivo microscópio nativo ou um formato de arquivo não compactado (por exemplo, * .raw, * .tiff).
- Imagem citológica Stains
- Use um microscópio padrão de laboratório de campo brilhante sem filtros, equipado com uma câmera de cor digital, conectado a um computador com um software de aquisição de imagem.
- Local e lâmina de vidro bloqueio (do passo 4.2.8) no palco microscópio. Rehidratar amostra com etanol a 100%, conforme necessário, ao longo do procedimento de imagem inteira.
- Selecione menor ampliação do microscópio (por exemplo, objetiva 2,5X) e ativar thsistema de imagem digital e; observar a amostra indicada no monitor do computador.
- Assegurar a recolha de células é alinhado com um dos eixos X ou Y de controle do estágio de microscópio. Ajuste, se necessário, pela remoção da tampa de deslizamento e rotação da amostra, utilizando uma ponta de pipeta ou pinças.
- Usando a imagem (s) de captura de toda a amostra com o microscópio de ampliação menor software de imagem,.
- Mudar para a ampliação do microscópio moderada (por exemplo, 10 - 20X objetiva) e ajustar fonte de luz do microscópio e parâmetros de imagem de software (exposição, contraste, balanço de brancos, etc.), e desativar a sua medição de software automatizado. Salvar essas configurações para uso futuro.
- Determinar pontos inicial e final de varredura (por exemplo, superior esquerdo e direito cantos inferiores de recolha de células).
- Usando a imagem (s) de captura de toda a área de colheita de células dentro dos pontos inicial e final software de imagem,. Certifique-se a 20% lado-a-lado e de cima para baixo sobreposição between todas as imagens adjacentes.
- Salvar arquivos usando o formato de arquivo microscópio nativo ou um formato de arquivo não compactado (por exemplo, * .raw, * .tiff).
- Gerar imagem panorâmica final usando o software automatizado costura de escolha (por exemplo, o Adobe Photoshop Elements). Use imagens de referência tomadas no passo 5.2.5) para confirmar a precisão da costura automatizada na imagem final.
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Representative Results
A membrana de cultura de células durou mais o suporte de plástico é uma ferramenta conveniente para a recolha de mão de células epiteliais da conjuntiva tampa do limpador. Este método elimina a necessidade de instrumentos esterilizados adicionais tipicamente utilizados para preparar e manipular membranas IC. A Figura 1 representa a área de IC limpador a tampa usando uma inserção de cultura de células. Nós otimizamos dois protocolos de coloração diferentes que se complementam para caracterizar células epiteliais da área do limpador a tampa de uma forma nova. Corantes imunocitoquímicos fluorescentes revelam actividade de esterase, um indicador da viabilidade das células, e os ácidos nucleicos, a coloração das quais reflecte compromisso membrana celular, como mostrado na Figura 2. O protocolo de coloração citológica permite uma fina distinção entre queratinização graus. A Figura 3 mostra a transição entre o baixo queratinização na conjuntiva tarsal e queratina avançadazação na conjuntiva limpador tampa e epiderme. formação de imagens panorâmicas de colecções de células coradas com citologia permite a análise de toda a área de recolha, em oposição a uma região de interesse seleccionados. A resolução da imagem é adequada para aumentar o zoom até o nível nuclear; morfologia celular pode ser determinado com precisão. A Figura 4 mostra a imagem final de uma colecção de células citologicamente coradas, cosida em conjunto, utilizando aprox. 100 arquivos de alta resolução separadas. Essas ferramentas podem ser utilizadas para avaliar os efeitos de atrito e / ou do olho seco de uma nova maneira.
Figura 1. citologia de impressão da tampa do limpador Área. A citologia de impressão realizada na região da tampa do limpador exposta por eversão da tampa superior. Membrana utilizada é de Cultura Celular Inserir, 12 mm, de PTFE hidrofílico. Nota as abas de suporte da membrana, o que pode ser retido (ao contrário préestudos riores sobre a conjuntiva bulbar, em que foram removidos antes da aplicação) como eles não interfiram com a aplicação da membrana na margem palpebral estreita e pode realmente ajudar no alinhamento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Células fluorescentes da tampa do limpador Região. Microscopia confocal de varrimento laser mostrando variação da morfologia celular entre grandes células escamosas (A) e as células colunares / cubóide menores (b). Fluorescência verde de calceína AM indica a actividade de esterase no corpo da célula (isto é, a viabilidade das células). fluorescência vermelha de Ethidium revela ácidos nucleicos, indicando comprometimento da membrana celular. Poucas células mostram verde intenso e sem fluorescência vermelha, possivelmente em dicative da integridade da membrana celular (c). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. citológica Coloração de IC da amostra. As células da região mostram tampa do limpador morfologia variada e diferentes graus de queratinização. cor azul de células pequenas, cilíndricas e cúbicas com núcleos grandes, encontrados na conjuntiva marginal / tarsal, indica que não há queratinização (a); mancha vermelha / laranja de grandes células escamosas com núcleos condensados da junção muco-cutânea (Linha MCJ / Marx ") e anuclear células da epiderme representa queratinização avançado (c). cor de Transição (vermelho / azul) e morfologia das células na área do limpador conjuntival a tampa sugerem queratinização limitado (b).g3large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. imagem composta da tampa do limpador Coleção Cell. Citologia de impressão da área do limpador a tampa após a coloração citológica. Imagem costurada usando aprox. 100 fotos individuais tiradas com um microscópio e objetiva 20X. (A) colunar Small / epitélio cúbico do tarsal conjuntiva / marginal. Células aqui exibem cores azul / verde / roxa indicando nenhuma queratinização; (B) as células da conjuntiva tampa do limpador, de transição na morfologia e cor da mancha entre as regiões (a) e (c); (C) grandes células escamosas da linha muco-cutânea junção / Marx ". Cor laranja mancha indica algum grau de queratinização, e vermelho / rosa indicam tarde fase de transição escamosas; (D) Meibum impressão; (E) anuclear, células cornified da epiderme; (F) Limpressão celular oblet ou mucinas do filme lacrimal. Seta para baixo indica tarsal área conjuntival, seta para cima indica tampa exterior. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
citologia de impressão é tipicamente realizada na conjuntiva bulbar, utilizando membranas de ésteres de celulose misturados. As amostras são cortadas ao tamanho a partir de folhas de material a granel, esterilizado, aplicado e removido da superfície conjuntival utilizando fórceps. Usando o mesmo material de membrana, um dispositivo de IC controlado-pistão foi recentemente concebido para coincidir com a geometria da superfície da conjuntiva bulbar, e manter a pressão constante entre 13 aplicações. Essas abordagens são ineficientes para a tampa estreita, com destaque curva limpador região (veja a Figura 1). Além disso, as membranas de éster de celulose mista não fornecem a transparência necessária para configurações onde a microscopia de campo claro é necessário alinhar as amostras antes da imagem fluorescente. As inserções de cultura de células propostas neste protocolo são convenientes porque são esterilizadas, de preferência dimensionados e pode ser manuseado manualmente, sem mais equipamento, assegurando colecções rápidas. As membranas são feitas a partir dehidrofílico PTFE, que fornece uma transparência adequada para análise de microscopia confocal.
No geral, as características morfológicas das células coletadas coincidem com relatos da literatura anteriores 7,8,14,15. Substituindo a-Schiff ácido mancha comumente usado (e cromaticamente muito intenso) periódico (PAS) com o azul alcian permite corantes Papanicolaou subsequentes para exibir variação mais fina cromática, permitindo uma perspectiva mais detalhada sobre o nível de queratinização celular, do que o relatado antes de 7,8.
imagens microscópicas de amostras citológicas geralmente envolve inspeção visual através das oculares, e fotografia de alta ampliação de estruturas consideradas "de interesse". Com esta abordagem, os aspectos "visão global" de toda a coleção pode ser perdida. Tiros de baixa ampliação são geralmente de qualidade óptica inferior (devido à vinheta, aberrações, etc.) ea resolução é insuficiente para descrever detalhes celularess. O protocolo panorâmica costura proposto aqui, enquanto um pouco mais demorado, é vantajoso, uma vez que fornece uma visão geral da membrana integral, bem como a capacidade de zoom ao detalhe nuclear, tudo em uma imagem. Métricas quantitativas, tais como a contagem de células, nuclear-citoplasmática (NC) relação de 16 e distâncias podem ser computados aqui.
Há três passos críticos no âmbito do protocolo que requerem atenção especial: a aplicação correcta da membrana sobre a conjuntiva (secção 2.4), o tempo entre as etapas de processamento de amostras (seções 2.6 e 3 a 5) e parâmetros de imagem consistentes para costura panorâmica ideal (secção 5.2 0,6 - 5.2.8). Ao contrário da conjuntiva bulbar relativamente plana, a tampa do limpador região tem uma curvatura acentuada, abrangendo uma largura estreita de apenas 1 - 2 mm entre epiderme e sulco tarsal. É essencial que a membrana ser aplicada, com o ângulo correcto, tal como isto pode influenciar grandemente do tipo de células recolhidas. Em segundo lugar, MEMpressão brana deve ser consistente entre os aplicativos. O pesquisador deve, portanto, desenvolver a destreza necessária para garantir coleções repetíveis. Uma vez que as amostras são coletadas utilizando a técnica de citologia de impressão, o tempo de processamento torna-se crucial. Amostras nunca deve ser permitida a secar, ou seja, a membrana não deve tornar-se opacos (seções 2.6, 3 a 5). Enquanto a amostra a passar por coloração citológico pode ser deixado no fixador durante um tempo prolongado (20 min - 2 horas), as manchas imunocitoquímicos deve ser adicionado e fotografada, sem atraso, para avaliar a viabilidade celular como a maior precisão possível. Consistência de timing também é essencial para resultados comparáveis entre amostras; deve-se procurar manter o tempo de fixação e coloração igual para todas as amostras a serem comparadas. Finalmente, a fim de obter imagens panorâmicas qualitativos da amostra de citologia, todos os parâmetros de imagem (microscópio de intensidade de luz, exposição da câmera, contraste, balanço de branco, etc.)deve ser calibrado para uma região representativa da amostra, com a maior diversidade de características de interesse (ou seja, tipos de células), e todos de medição automatizada ser desativada para as fotografias subsequentes (seção 5.2.6). O investigador deve também visam orientar a coleta de células de acordo com X ou eixo Y do estágio do microscópio. Isso irá facilitar a aquisição de imagem e processo de costura. Aponte para localizar e utilizar características distintivas da amostra (por exemplo, manchas celulares, meibum, detritos, etc.) nas regiões de sobreposição entre as imagens adjacentes. O foco do microscópio deve ser o único ajustamento que deve ser corrigido entre os disparos.
A limitação desta técnica reside na variabilidade das coleções de células, como inicialmente observado por Jalbert 8, que relataram uma taxa de sucesso de 67% na obtenção de manchas confluentes de células tampa do limpador. O ângulo de aplicação determina o número e tipo de células coletadas. Nesta fase, é incerto wuer qualidade da captação (isto é, o número de células na amostra) é correlacionada com a saúde ocular. Os ensaios clínicos com amostras maiores são necessários para comprovar a validade desta técnica. Um outro inconveniente reside na capacidade de invasão inerente à técnica de IC si. As camadas de células superiores são removidos à força a partir da conjuntiva, o que pode induzir danos. Enquanto as manchas imunocitoquímicos destinam-se a reflectir a viabilidade celular (e atividade esterase está presente em todas as coleções), não está claro o que a fluorescência vermelha de núcleos celulares nas nossas colecções indicam. Ocasionalmente, meibum (isto é, lípidos segregados na margem da pálpebra) e outros componentes a partir da superfície ocular ou filme lacrimal tenderá a cobrir características celulares e fazer a análise difícil ou impossível. O protocolo pode ser modificado com uma lavagem adicional em xileno para remover os lípidos meibum. Finalmente, o efeito de gotas de anestésico sobre as células da conjuntiva é desconhecido.
A obtenção de dados da estrutura celular da região da tampa do limpador irá ajudar a verificar a correlação entre a fricção que ocorre entre estas células e a superfície ocular, e o conforto subjectivo. Isto irá fornecer um conhecimento valioso e permitir que os ensaios clínicos futuros para explorar as particularidades celulares de usuários de lentes de contato, indivíduos com epiteliopatia tampa do limpador, sintomas oculares ou secura secos, em contraste com indivíduos assintomáticos, para lançar espero luz sobre o tema de desconforto ocular.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue, 1% in 3% Acetic Acid | Sigma | B8438-250ML | |
| Hematoxylin, Gill 1 | Sigma | GHS116-500ML | |
| Papanicolaou stain, OG-6 | Sigma | HT40116-500 ml | |
| Papanicolaou stain, Modified EA | Sigma | HT40232-1L | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies | L-3224 | contains ethidium homodimer-1 and Calcein AM dyes |
| Alcaine (0.5% proparacaine hydrochloride) | Alcon | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | EMD Millipore | PICM01250 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |
References
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