Introduction
El párpado superior humano ejecuta alrededor de 10.000 parpadea cada día 1, con sólo un 1 - 2 mm región conjuntival estrecha opuestos del globo ocular. Debido a su movimiento de limpieza durante el parpadeo, esta porción de la margen del párpado se ha denominado la región "tapa de limpiaparabrisas" 2. Se supone que la fricción se incrementa en esta región durante el parpadeo habitual, debido a la tapa limpia el mundo. Esto puede jugar un papel importante en la comodidad ocular. Los portadores de lentes de contacto, en particular, la experiencia malestar ocular y esta es una de las principales razones para cesar el uso de lentes 3. Cuando una lente de contacto se coloca en el ojo, el coeficiente de fricción entre el material de la lente y la superficie ocular se ha demostrado que cambiar 4. Hay evidencias que sugieren que los síntomas de sequedad podrían estar relacionados con esta fricción alterada 2,5,6.
Esta asociación también se puede reflejar en los fenómenos clínicamente observables, especialmente wi tapapor epiteliopatía (LSA), también llamado margen del párpado superior tinción (ULMS) 6. LSA es una señal temprana de la irritación ocular y un predictor potencial para la enfermedad del ojo seco. Se observa y se mide por la tinción vital de las regiones borde del párpado superior e inferior. Si bien este sistema de clasificación 2 y su validez clínica (es decir, la correlación con síntomas subjetivos) están siendo objeto de debate, molestia ocular sigue siendo un enigma para los médicos y científicos por igual y, sobre todo, un inconveniente para los pacientes.
Hasta la fecha, poco se sabe acerca de las variaciones clínicamente relevantes en el (sub) la anatomía y la fisiología celular de la zona del limpiaparabrisas tapa 7 y un único informe hace uso de métodos citológicos 8. La citología de impresión (IC) ha sido empleado durante más de 40 años para recoger las células de la superficie epitelial de la conjuntiva tarsal bulbar o mediante la aplicación de una membrana de 9,10. Tras la retirada, las células adherentes se someten a ctinción ytological y de imágenes microscópicas. Debido a las diferencias anatómicas y celulares de la región de limpiaparabrisas tapa, esta técnica requiere la optimización.
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Protocol
Ética declaración: Antes de la recolección de células de sujetos humanos, el consentimiento informado y se debe obtener la aprobación ética.
1. Preparar a las manchas
NOTA: Preparar mancha en el día del experimento.
- Añadir 5 l de etidio (o 4 M) y 5 l de calceína AM (o 4 M) a 2,5 ml solución salina tamponada con fosfato (PBS) en 15 ml tubo de centrífuga; mezcla. Envolver en papel de aluminio para protegerlo de la luz y se almacena a temperatura ambiente hasta su uso.
2. Las células Collect
- Retire insertos de cultivo celular de su paquete y la etiqueta de cada párpado a muestrear. Marca de orientación de recogida de células en el lado del soporte de plástico de la membrana usando un marcador permanente. Conducta cortó la inspección de la lámpara con un aumento moderado (aproximadamente 20 veces) para confirmar la salud apropiada de la región que someterse a IC.
- Deje caer una gota de anestésico tópico (0,5% de hidrocloruro de proparacaına) en el saco conjuntival inferior del eaojo ch e instruir a los participantes para mantener los ojos cerrados durante un minuto.
- Evert párpado superior y mantenga en su lugar por las pestañas; evitar el contacto con la zona de la tapa del limpiaparabrisas.
Opcional: la ayuda de un investigador secundario puede ser requerido para realizar este paso. - Aplicar membrana perpendicularmente sobre la parte central de la región de limpiaparabrisas tapa con una presión mínima.
- Mantenga la membrana en su lugar por 3 - 5 segundos. Observar la membrana translúcida convertido en el área de contacto. En este punto, retire con cuidado la membrana y permitir la tapa del participante de "flip" en su lugar.
- Inmediatamente aplicar una gota de PBS a la muestra, para evitar que se sequen. Membrana a su vez, translúcido y opaco no debe girar en cualquier momento, ya que esto indica secado. Tiene el investigador secundaria proceder inmediatamente con el procesamiento de las muestras (sección 3).
- Realizar comprobación final del ojo para asegurar la integridad de la conjuntiva. Prescindir de los lubricantes oculares e instruir a los participantespara evitar frotarse los ojos hasta que el efecto anestésico desaparece (aprox. 15 min).
Procesamiento 3. Muestra
- El uso de micro-tijeras, corte de la membrana en un medio (un medio para cada uno de los análisis aguas abajo), perpendicular a través de la mitad de la recogida de células. Corte a lo largo del margen exterior de una media membrana para separarla de la soporte de plástico; evitar la interacción con las células recogidas en la membrana, incluyendo asegurar que la membrana no se pliega sobre sí mismo.
- Asegure la membrana con unas pinzas antes de separar por completo del soporte. Lugar membrana en la etiqueta del tubo de centrífuga de 2 ml que contenía 500 l de 95% (v / v) de etanol y dejar de fijar durante un mínimo de 20 minutos hasta un máximo de 2 horas antes del procesamiento (sección 4.2).
- segunda mitad inmediatamente separada de la membrana (tal como se describe en la sección 3.2) y proceder de inmediato con la sección 4.1.
La tinción 4. Muestra
- ImmunocytochemiLa tinción cal
- Coloque con cuidado la membrana de vidrio de placa de cultivo de 35 mm con fondo colección lado hacia abajo; asegurar membrana es plana.
- Pipeta de 20 l de composición de tintura inmuno montado en la sección 1 a la membrana. Si rizos de ejemplo, utilizar puntas de pipeta desechables para aplanar cuidadosamente la membrana presionando sus bordes hacia abajo. Evitar el contacto con las zonas de recogida de células.
- cubrir con cuidado la membrana con cubierta de vidrio deslizante. Evitar movimientos innecesarios de la muestra. Cubrir el plato con la tapa y el sello con el laboratorio de película alrededor de los bordes. No obstruya la transparencia del plato (superior e inferior) y la visibilidad de la muestra. La etiqueta del marcador de laboratorio.
- Inmediatamente proceder con la proyección de imagen (sección 5.1), y luego volver a la sección 4.2 para continuar con la tinción citológica de la otra mitad de la membrana.
- La tinción citológica
- Poco a poco hidratar la membrana por adición lenta de 500 l de agua destilada en el tubo uSed para su fijación en el apartado 3.4. Aspirar los contenidos varias veces a punta de pipeta para mezclar, a continuación, eliminar el contenido.
- Añadir 500 l de agua destilada. Dejar reposar durante unos segundos, luego retire. Añadir 500 l de tinción de azul Alcian y dejar actuar durante 3 minutos. Retire las manchas y realice 3 consecutiva de 500 l de agua destilada enjuagues o hasta que el líquido se enjuaga clara.
- Añadir 500 l de hematoxilina # 1 de manchas y dejar actuar durante 3 minutos. Retire las manchas y realizar tres lavados consecutivos 500 l de agua destilada o hasta que el líquido se enjuaga clara. Deshidratar (inversa de la sección 4.2.1) aspirando el líquido claro.
- Añadir 500 l de Papanicolaou OG-6 mancha y dejar actuar durante 3 minutos. Retirar la mancha y realice una 500 l 95% (v / v) de enjuague de etanol.
- Añadir 500 l de Papanicolaou EA-65 mancha y dejar actuar durante 3 minutos. Quitar las manchas y realizar 3 consecutiva 500 l 95% (v / v) de etanol se enjuaga.
- Totalmente deshidratar usando tres 500 l 100% aclarados consecutivos de etanol. El uso de TWEezers, retire la muestra de la solución; evitar las zonas de recolección de células tocar.
- Coloque la membrana sobre portaobjetos de vidrio; asegurar que la línea de recogida de células es paralela o perpendicular a deslizarse margen para la alineación más fácil durante la exploración.
- Aplicar una gota de etanol al 100% y cubrir con el resbalón de vidrio. Inmediatamente proceder con la proyección de imagen (sección 5.2).
5. Muestra de Imágenes
- Las manchas fluorescentes de imágenes Inmunocitoquímico
- Use un microscopio confocal de barrido láser (CLSM) 11 o microscopio de fluorescencia 12, equipado con una cámara digital de color, conectado a un equipo que ejecuta un software de adquisición de imágenes. Debido a las muestras que se están contenidos dentro de placas de cultivo, un microscopio invertido puede ser necesario.
- Configurar microscopio 11,12 de acuerdo con los espectros de absorción y emisión de etidio homodímero-1 (528/617 nm maxima Ex / Em en presencia de DNA) y calceína AM (494/517 nm Emáximos x / Em).
- Seleccionar aumento más bajo del microscopio (por ejemplo, el objetivo 2,5X) y activar el sistema de imagen digital; observar la muestra exhibida en el monitor de la computadora.
- Inspeccionar la muestra para características celulares de interés.
- Seleccionar magnificación del microscopio deseado y adquirir imágenes utilizando software de imagen.
- Guardar archivos en cualquier formato de archivo nativo de microscopio o un formato de archivo sin comprimir (por ejemplo, * .raw, * .tiff).
- Las manchas de imagen citológica
- Utilizar un microscopio estándar de laboratorio de campo brillante sin filtros, equipado con una cámara digital en color, conectado a un ordenador con un software de adquisición de imágenes.
- Lugar y portaobjetos de vidrio de bloqueo (de la etapa 4.2.8) en la platina del microscopio. Rehidratar la muestra con 100% de etanol, según sea necesario, a lo largo de todo el procedimiento de formación de imágenes.
- Seleccionar aumento más bajo del microscopio (por ejemplo, el objetivo 2,5X) y activar THsistema de imagen digital e; observar la muestra exhibida en el monitor de la computadora.
- garantizar la recogida de células se alinea con X o Y del eje de control de platina del microscopio. Ajustar si es necesario, mediante la eliminación de la hoja de la cubierta y la rotación de la muestra usando una punta de pipeta o pinzas.
- El uso de la imagen (s) de captura de la totalidad de la muestra con el microscopio óptico bajo el software de imágenes,.
- Cambiar a la magnificación del microscopio moderada (por ejemplo, 10 - 20X objetivo) y ajustar la fuente de luz del microscopio y los parámetros de imagen de software (exposición, contraste, balance de blancos, etc.), y desactivar la medición de software automatizado. Guardar esta configuración para su uso futuro.
- Determinar puntos de inicio y final de la exploración (por ejemplo, esquinas superiores izquierda y derecha inferior de la recolección de células).
- El uso de la imagen (s) de captura de toda la zona de recogida de células dentro de los puntos inicial y final del software de imágenes,. Garantizar un 20% de lado a lado y de arriba a abajo solapamiento between todas las imágenes adyacentes.
- Guardar archivos usando el formato de archivo nativo de microscopio o un formato de archivo sin comprimir (por ejemplo, * .raw, * .tiff).
- Generar una imagen panorámica final utilizando el software automatizado de costura de elección (por ejemplo, Adobe Photoshop Elements). Usar imágenes de referencia tomados en el paso 5.2.5) para confirmar la exactitud de la costura automatizada en la imagen final.
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Representative Results
La membrana de cultivo celular abarcado sobre el soporte de plástico es una herramienta conveniente para la recolección de mano de las células epiteliales de la conjuntiva tapa del limpiaparabrisas. Este método elimina la necesidad de instrumentos esterilizados adicionales típicamente usados para preparar y manejar las membranas de IC. La Figura 1 representa el IC de la zona de limpiaparabrisas tapa usando un inserto de cultivo celular. Hemos optimizado dos protocolos de tinción diferentes que se complementan entre sí para caracterizar las células epiteliales de la zona del limpiaparabrisas tapa de una manera novedosa. Colorantes inmunocitoquímicos fluorescentes revelan actividad de esterasa, un indicador de la viabilidad celular, y los ácidos nucleicos, la tinción de los cuales refleja el compromiso de la membrana celular, como se muestra en la Figura 2. El protocolo de tinción citológica permite una sutil distinción entre la queratinización grados. La Figura 3 muestra la transición entre el bajo queratinización en la conjuntiva tarsal y la queratina avanzadazación en la conjuntiva de limpiaparabrisas tapa y epidermis. de imagen panorámica de colecciones de células de citología manchados permite el análisis de toda la zona de recogida, en lugar de una región seleccionada de interés. Resolución de la imagen es adecuada para el zoom a nivel nuclear; la morfología celular se puede determinar con precisión. La Figura 4 muestra la imagen final de una colección de células citológicamente manchado, cosidas juntas usando aprox. 100 archivos de alta resolución separadas. Estas herramientas se pueden utilizar para evaluar los efectos de la fricción y / o el ojo seco en una forma novedosa.
Figura 1. Citología de Impresión de la tapa del limpiador de la zona. La citología de impresión a cabo en la región de tapa del limpiaparabrisas expuesto por eversión del párpado superior. Membrana utilizada es la célula Cultura Insertar, 12 mm, PTFE hidrofílico. Tenga en cuenta las lengüetas del soporte de la membrana, lo cual puede ser retenido (a diferencia de preLos estudios ante- sobre la conjuntiva bulbar, en el que se eliminaron antes de la aplicación), ya que no interfieren con la aplicación de la membrana en el borde del párpado estrecho y en realidad puede ayudar a la alineación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Las células fluorescentes de la tapa del limpiador Región. Microscopía de escaneo láser confocal que muestra la variación de la morfología celular entre las grandes células escamosas (A) y las células columnares / cuboidal más pequeños (b). Fluorescencia verde de calceína AM indica la actividad de esterasa en el cuerpo de la célula (es decir, la viabilidad celular). fluorescencia roja de etidio revela ácidos nucleicos, lo que indica el compromiso de la membrana celular. Algunas células muestran verde intenso y sin fluorescencia roja, posiblemente en indicativa de la integridad de la membrana celular (c). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. citológico La tinción de IC Sample. Las células de la región muestran la tapa del limpiaparabrisas variando la morfología y diferentes grados de queratinización. El color azul de las células pequeñas, cilíndricas y cúbicas con núcleos grandes, que se encuentran en la conjuntiva marginal / tarsal, indica que no hay queratinización (a); mancha roja / naranja de grandes células escamosas con núcleos condensados de la unión muco-cutánea (Línea MCJ / Marx) y anucleadas células de la epidermis representa la queratinización avanzada (c). el color de transición (rojo / azul) y la morfología de las células en el área del limpiaparabrisas conjuntival tapa sugieren queratinización limitados (b).g3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Imagen compuesta de la tapa del limpiador Recolección de células. La citología de impresión de la zona del limpiaparabrisas tapa después de tinción citológica. Imagen mantuvo unida usando aprox. 100 fotos individuales tomadas con un microscopio y objetivo 20X. (A) Pequeña columnar / células epiteliales cúbicas de la conjuntiva tarsal / marginal. Las células exhiben aquí color azul / verde / púrpura indica que no hay queratinización; (B) las células de la conjuntiva tapa de limpiaparabrisas, de transición en la morfología y color de la mancha entre las regiones (a) y (c); (C) las grandes células escamosas de la unión de la línea muco-cutánea / Marx. Naranja mancha de color indica un cierto grado de queratinización, y rojo / rosa indican etapa tardía transición escamosas; (D) meibum impresión; (E) anuclear, las células cornificadas de la epidermis; (F) Gimpresión oblet celular o mucinas de la película lagrimal. Flecha hacia abajo indica el área de la conjuntiva tarsal, flecha hacia arriba indica tapa exterior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La citología de impresión se lleva a cabo normalmente en la conjuntiva bulbar, utilizando membranas de ésteres mixtos de celulosa. Las muestras se cortan a tamaño de las hojas de material a granel, esterilizar, aplicar y retirar de la superficie conjuntival usando fórceps. Utilizando el mismo material de la membrana, un dispositivo de IC pistón controlado fue diseñado recientemente para que coincida con la geometría de la superficie de la conjuntiva bulbar, y mantener una presión constante entre las aplicaciones 13. Estos enfoques son ineficaces para la estrecha tapa, prominentemente curvada limpiaparabrisas región (véase la Figura 1). Además, las membranas de éster mixto de celulosa no proporcionan la transparencia necesaria para los casos en es necesario brillante microscopía de campo para alinear las muestras antes de la imagen fluorescente. Los insertos de cultivo celular que se proponen en este protocolo son convenientes porque se esterilizan, tamaño ideal y pueden ser manejados manualmente, sin más equipo, asegurando colecciones rápidas. Las membranas están hechas dehidrófila de PTFE, que proporciona una transparencia adecuada para el análisis de microscopía confocal.
En general, las características morfológicas de las células recogidas coinciden con informes anteriores de la literatura 7,8,14,15. Sustitución del ácido Schiff mancha de uso común (y cromáticamente muy intenso) periódico (PAS) con azul de Alcian permite posteriores tintes de Papanicolaou para mostrar la variación cromática más fina, lo que permite una perspectiva más detallada sobre el nivel de la queratinización celular, que se había informado antes de 7,8.
imágenes microscópicas de muestras citológicas por lo general implica la inspección visual a través de los oculares, y una gran ampliación fotografía de las estructuras consideradas "de interés". Con este enfoque, "de mayor amplitud" aspectos de toda la colección se pueden perder. Golpes bajos aumentos suelen ser de inferior calidad óptica (debido a las viñetas, las aberraciones, etc.) y la resolución es insuficiente para representar detalle celulars. El protocolo panorámica costura que aquí se propone, mientras que consume un poco más de tiempo, es ventajoso, ya que proporciona una visión general de la membrana completa, así como la posibilidad de ampliar a los detalles nuclear, todo en una sola imagen. Las mediciones cuantitativas tales como el recuento de células, relación núcleo-citoplasma (NC) 16 y las distancias se pueden calcular aquí.
Hay tres pasos críticos dentro del protocolo que requieren una atención especial: la correcta aplicación de la membrana en la conjuntiva (sección 2.4), el tiempo entre los pasos de procesamiento de muestras (secciones 2.6 y 3 a 5) y los parámetros de imagen consistentes de costura panorámica óptima (sección 5.2 0.6 - 5.2.8). A diferencia de la conjuntiva bulbar relativamente plana, la tapa de limpiaparabrisas región tiene una curvatura pronunciada, que abarca una anchura estrecha de sólo 1 - 2 mm entre la epidermis y el surco tarsal. Es esencial que la membrana se aplica en el ángulo correcto, ya que esto puede influir en gran medida del tipo de células recogidas. En segundo lugar, mempresión de membrana debe ser consistente entre aplicaciones. Por ello, el investigador debe desarrollar la destreza necesaria para garantizar colecciones repetibles. Una vez que las muestras se recogen utilizando la técnica de citología de impresión, el tiempo de procesamiento se convierte en crucial. Las muestras no se debe permitir que se seque, es decir, la membrana no debe convertirse opacos (secciones 2.6, 3 a 5). Mientras que la muestra a someterse a tinción citológica se puede dejar en el fijador durante un tiempo prolongado (20 min - 2 h), se deben añadir las manchas inmunocitoquímicas y la imagen sin demora, para evaluar la viabilidad celular con la mayor precisión posible. La consistencia de la sincronización es también esencial para obtener resultados comparables entre las muestras; uno debe tratar de mantener los tiempos de fijación y tinción igual para todas las muestras que deben compararse. Por último, con el fin de obtener imágenes panorámicas cualitativos de la muestra de citología, todos los parámetros de imagen (microscopio de intensidad de luz, exposición de la cámara, contraste, balance de blancos, etc.)deben ser calibrados a una región representativa de la muestra, con la mayor diversidad de características de interés (es decir, tipos de células), y todas las mediciones automatizadas se desactivará en los disparos siguientes (sección 5.2.6). El investigador también debería tener como objetivo orientar la recolección de células de acuerdo con cualquiera de los ejes X o Y de la platina del microscopio. Esto facilitará la adquisición de la imagen y el proceso de costura. El objetivo de localizar y utilizar las características distintivas de la muestra (por ejemplo, parches celulares, meibum, escombros, etc.) en las zonas de solapamiento entre las imágenes adyacentes. El foco del microscopio debe ser el único ajuste que debe corregirse entre disparos.
La limitación de esta técnica radica en la variabilidad de las colecciones de células, como se observa originalmente por Jalbert 8, que informó de una tasa de éxito del 67% en la obtención de parches confluentes de células tapa limpiaparabrisas. El ángulo de aplicación determina el número y tipo de células recogidas. En esta etapa no se sabe wanto calidad de la captación (es decir, el número de células en la muestra) se correlaciona con la salud ocular. Los ensayos clínicos con muestras de mayor tamaño son necesarias para demostrar la validez de esta técnica. Un inconveniente adicional radica en la invasividad inherente de la propia técnica de IC. Las capas celulares superiores se quitan por la fuerza de la conjuntiva y esto puede inducir daño. Mientras que las manchas de inmuno pretenden reflejar la viabilidad celular (y la actividad esterasa está presente en todas las colecciones), no está claro cuál es la fluorescencia roja de los núcleos celulares en nuestras colecciones indican. De vez en cuando, meibum (es decir, los lípidos secretados en el borde del párpado) y otros componentes de la superficie ocular o la película lagrimal tenderá a cubrir características celulares y realizar análisis difícil o imposible. El protocolo podría ser modificado con un enjuague adicional en xileno para eliminar los lípidos meibum. Por último, el efecto de las gotas de anestesia en las células conjuntivales es desconocida.
La obtención de datos de la estructura celular de la región de tapa limpiaparabrisas ayudar a verificar la correlación entre la fricción que se produce entre estas células y la superficie ocular, y el confort subjetivo. Esto proporcionará conocimientos valiosos y permitir futuros ensayos clínicos para explorar las particularidades celulares de los usuarios de lentes de contacto, los sujetos con epiteliopatía tapa del limpiaparabrisas, los síntomas de ojo seco o sequedad, en contraste con los sujetos asintomáticos, es de esperar que arrojan luz sobre el tema de las molestias oculares.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue, 1% in 3% Acetic Acid | Sigma | B8438-250ML | |
| Hematoxylin, Gill 1 | Sigma | GHS116-500ML | |
| Papanicolaou stain, OG-6 | Sigma | HT40116-500 ml | |
| Papanicolaou stain, Modified EA | Sigma | HT40232-1L | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies | L-3224 | contains ethidium homodimer-1 and Calcein AM dyes |
| Alcaine (0.5% proparacaine hydrochloride) | Alcon | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | EMD Millipore | PICM01250 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |
References
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