Introduction
タンパク質は、細胞中で最も豊富な巨大分子であり、それらは事実上すべての生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たしています。ほとんどのタンパク質の生物学的活性は、それらの中に折り畳み、そして、天然の三次元構造を維持することが必要です。異常なコンフォメーションを有するタンパク質は、それらの正常な機能を失うだけでなく、頻繁に他のタンパク質の機能を損ない、細胞1,2に対して毒性である可溶性オリゴマー種または凝集体を形成しません。タンパク質の誤った折り畳みに対抗するために、細胞は、ミスフォールドタンパク質3を除去分子鎖両その天然のコンフォメーションに到達するために折り畳まれていないまたは部分的に折り畳まれたポリペプチドを助けるシャペロン、および分解経路を利用します。複雑さと折り処理の確率的な性質を考えると、タンパク質ミスフォールディングは不可避であり、突然変異、生合成誤差、および翻訳後ダメージ1の場合には逆にしなくてもよいです。したがって、細胞は、最終的degradatに依存しますイオン経路は、それらのタンパク質の品質を維持します。
細胞タンパク質の品質管理（PQC）システムの重要性は、癌、糖尿病、アルツハイマー病などの多くの神経変性疾患、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病（HD）を含む、タンパク質の誤った折りたたみに起因する疾患の有病率によって強調され、そして脊髄小脳失調（SCA）4,5。例えば、腫瘍抑制因子p53の変異が全てのケース6の〜百分の50から70までに関連した腫瘍における単一の最も頻繁に遺伝的損傷、です。 p53変異のかなりの部分が凝集体7の形成をもたらすp53のコンホメーションを変化させるミスセンス変異です。また、拡張したポリQストレッチを有するタンパク質は、遺伝的および病理学的にHDとSCAに関連付けられています。影響を受けたタンパク質におけるポリQストレッチの長さが一定THRESを超えるマニフェストこれらの進歩的な、しばしば致命的な疾患ホールド、およびポリQストレッチの長さが8を延長するよう、ますます深刻になります。
これらの疾患を治療するための魅力的なアプローチは、治療的にセルラPQCシステム、特に分解経路を強化することです。しかし、欠陥タンパク質の分解に関与する経路は、特に、哺乳動物細胞中で、十分に理解残ります。プロテアソームは、ミスフォールドタンパク質の分解のために非常に重要であることが認識されているが、重要な問題は、未定義のまま：特異的に認識し、分解の標的とされている方法をミスフォールドタンパク質。 PQCシステムは、細胞質、小胞体およびミトコンドリアなどの細胞区画において同定されているが、さらに、核内PQCシステムは2不明です。
私たちの研究室による最近の研究では、核内のミスフォールドタンパク質の多様性を認識し、分解するシステムを同定しました9哺乳動物細胞。このシステムは、前骨髄球性タンパク質（PML）、核タンパク質と三者モチーフ含有（TRIM）タンパク質ファミリーのメンバー、及びRNF4、タンパク質を含有するRINGドメインから構成されています。 PML、およびいくつかの他のTRIMタンパク質は、タンパク質のSUMO化10の特異性および効率を促進SUMO（小さ なユビキチン様修飾因子）E3リガーゼ活性を有します。 RNF4は彼らにユビキチンリガーゼ活性11が得られるRINGドメインに加えて、1つまたは複数の大相撲相互作用モチーフ（SIMS）を含有するSUMO標的ユビキチンリガーゼ（STUbL）、の小さなグループに属しています。我々は、PMLは、具体的にミスフォールドタンパク質に明確な特徴を識別することができる個別の基質認識部位を介して、ミスフォールドタンパク質を認識することを発見しました。結合すると、PMLタグは内部SUMO化部位の存在に起因するポリ鎖を形成することができるSUMO2 / 3のポリ鎖、2ほぼ同一の哺乳動物のSUMOタンパク質を有するタンパク質をミスフォールド。 SUMOylatedミスフォールドタンパク質は、その後、それらのユビキチン化およびプロテアソーム分解につながるRNF4、によって認識されています。我々はさらにPMLの欠乏は、SCAタイプ1（SCA1）9のマウスモデルの行動と神経病理学的欠陥を悪化させるとしてPML-RNF4システムは、神経変性に対する保護のために重要であることを実証しました。
タンパク質レベルを調節することができる他の細胞機構からのタンパク質分解を区別するために、タンパク質の代謝回転率は9を測定しました。タンパク質の代謝回転を決定するために最も頻繁に使用される方法の中にパルス追跡およびシクロヘキシミド（CHX）チェイスです。これらの2つの方法は、それぞれ、時間をかけて翻訳熟練細胞および翻訳を阻害し、細胞中の目的の合計既存のタンパク質への関心の放射性同位体標識タンパク質を調べます。しかし、病原性とミスフォールディングが発生しやすいタンパク質を研究するための主要な課題は、これらのタンパク質の半減期は非常に見よすることができることですngの。例えば、アタキシン1、アタキシン7、ハンチンチン、αシヌクレイン、およびTDP-43のすべては、以上の12〜24時間9,12-16の半減期を有します。これらのタンパク質を保有する細胞は特にそれ自体が細胞に対して非常に毒性であり得るミスフォールドタンパク質ので、長時間の翻訳阻害に耐えられない可能性があるため、これらのタンパク質の遅い回転率は、CHXチェイス分析の使用を排除します。同位体標識とパルスチェイス分析も非常に凝集しやすいであるタンパク質のために挑戦することがあります。ほとんどのパルスチェイスアッセイはまた、放射性標識されているすべての他のタンパク質から目的のタンパク質を分離するために、免疫沈降に依存しています。この手順は、通常、不正確なSDS-PAGE電気泳動で解析を行う、SDS不溶性凝集体を形成することができる時に長い免疫沈降し、洗浄手順を含みます。
ここでは、低速回転率と核ミスフォールドタンパク質を分析するためのプロトコルが記載されている9。グルタミン82（Atxn1 82Q）のストレッチが含まれていアタキシン1（Atxn1）の病原型は、この目的の8のために使用されます。細胞内で発現された場合、核（ 図1A）でAtxn1 82Qの微視的形態可視介在物の増強された緑色蛍光タンパク質（GFP）融合。パルスチェイス分析はAtaxn1 82Qの半減期が18時間9以上であることが明らかになりました。 Atxn1 82Qは、ネイティブコンホメーションのミスフォールド特性の異なるコンフォメーションと同様に、種と種で構成されています。これらの種が異なる速度で分解される可能性があり、従って、別々に分析されるべきです。 Atxn1 82Q-GFP発現細胞からの溶解物は、NP-40水溶性（溶解性またはNS、おそらく天然のタンパク質またはミスフォールドオリゴマー/モノマータンパク質を表す）とNP-40不溶性（NI、集約/ミスフォールド）の部分に分画されます。 （;おそらく不規則凝集SS）又は（SDS耐性SR;後者は、さらにSDS可溶性に分割することができる可能性がアミロイド線維を）画分（ 図1B）。 SR画分をイムノ続くフィルター遅延アッセイにより検出することができるのに対し、NS及びSSフラクションを、ウェスタンブロットに続くSDS-PAGEによって分析することができます。 CHXチェイスは、界面活性剤分画法と組み合わせて、およびSS Atxn1 82Qの半減期は、SS画分が容易に認識し、分解され得ることを示し、NS Atxn1 82Qおよび総Atxn1 82Q（ 図2A）よりもはるかに短いことが発見されています細胞9インチしたがって、この方法は、ミスフォールドタンパク質のダイナミクスを研究するために、それらの分解パターンを比較するための強力なツールを提供します。
我々はまた、ミスフォールドタンパク質の分解を調節することができる巨大分子または小化合物を同定するためのハイスループットスクリーニングに適している方法を説明します。この方法は、ホタルルシフェラーゼ（LucDM）17、モデルシャペロン基板の立体構造的に不安定化変異体に基づいています。私たちは、ヒューズを持っています検出の便宜のためにdは、この細胞区画にPQCシステムをプローブする核局在化シグナル（NLS）にLucDM、およびGFP（NLS-LucDM-GFP）。細胞のわずかな割合でNLS-LucDM-GFPフォーム顕微鏡で見える核の凝集体（ 図3A）。 Atxn1 82Q、NLS-LucDM-GFP-ではなく、その野生型対応NLS-LucWT-GFP-さSUMO2 / 3によって修正されたとPML-RNF4経路9により規制と同様に。 SSおよびSR種の相対量は、プロトコル以下3に記載の条件を使用して、NSに比べてごくわずかですが、NLS-LucDM-GFPはまた、SSおよびSR種を形成しています。アッセイを簡素化するために、我々は唯一のSDS-PAGEおよびウェスタンブロットによって（NSとSS画分の両方を含む）SDS可溶性LucDMを分析します。重要なことには、CHXチェイスアッセイは、SDS可溶性NLS-LucDM-GFPの半減期はLucDMを認識し、劣化システムに特異的な基質であることを示唆し、その野生型対応物（ 図3B）よりもはるかに短いことが示されましたミスフォールドタンパク質。
LucDM-GFPの分解は、全体的な蛍光シグナルの有意な低下を引き起こします。したがって、我々はまた、マイクロプレート蛍光ベースのアッセイを用いて細胞LucDM-GFPのリアルタイム検出のためのプロトコルを開発しました。多くのハイスループットスクリーニング（HTS）システムは、異常なタンパク質18-20によって引き起こされる細胞凝集体および細胞生存率を変更する薬剤や遺伝子のために開発されています。しかし、非常に少数のHTSsは、具体的には、哺乳動物細胞中での分解を標的とするために設計されています。このプロトコルは、細胞のミスフォールドタンパク質の分解のタンパク質の発現、ノックダウン、および薬物治療の効果の迅速かつ大規模な分析のために強固なシステムとして機能します。我々は、これら2つのミスフォールドタンパク質の分析のためのプロトコルを説明する以下の実施例として、HeLa細胞を用いました。トランスフェクション条件および時間経過は、個々の細胞株について最適化される必要があるかもしれないが、アッセイはまた、他の細胞株にも適用することができます。
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Protocol
試薬の調製
- 細胞溶解緩衝液を調製し（50mMトリス、pHが8.8、100mMのNaCl、5mMのMgCl 2、0.5％NP-40）。補足2 mMのDTT、1×完全プロテアーゼカクテル、そして使用前に250 IU / mlのベンゾナーゼ。
- ペレットバッファー（20 mMトリス、pHが8.0、15のMgCl 2）を準備します。補足2 mMのDTT、使用前に1×完全プロテアーゼカクテルと250 IU / mlのベンゾナーゼ。
- 3倍沸騰バッファ（6％SDS、20 mMトリス、pHは8.0）を準備します。使用前に150mMのDTTを補います。
- マイクロプレート蛍光リーダーを用いたアッセイのための低蛍光DMEM培地を準備します。 25 mMグルコース、0.4 mMグリシン、0.4 mMのアルギニン、0.2 mMのシステイン、4.0 mMグルタミン、0.2 mMヒスチジン、0.8 mMのイソロイシン、0.8mMのロイシン、0.8 mMのリシン、0.2 mMのメチオニン、0.4 mMのフェニルアラニン、0.4 mMのセリン、0.8ミックスmMのスレオニン、0.078 mMのトリプトファン、0.4mMのチロシン、0.8 mMのバリン、1.8 mMのCaCl 2を、0.81 mMのMgSO 4を、5.33のKCl、44.0ミリモルのNaHCO 3、110 mMのNaClを、0.9 mMのNaH 2 PO 4。 pH7.4にHClまたはNaOHを用いて溶液のpHを調整します。濾過により培地を滅菌します。
注：この培地は、Fe（NO 3）3、ビタミンやフェノールレッドが省略されていることを除いて、高グルコースを標準DMEM培地のコンポーネントが含まれています。フェノールレッド、著しく蛍光信号21の検出を妨害する正規のDMEM培地中でリボフラビンおよびピリドキサール。これらの成分を含まない培地は、成功した生細胞のGFPイメージングのために重要です。媒体は、冷蔵保存された12ヶ月間安定です。
Atxn1 82Q GFPの2分解アッセイ
- プレート約10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したDMEM培地で35mmのプレートに3×10 5 HeLa細胞、O / N培養細胞は、トランスフェクションの時点で40〜60％のコンフルエンスまで増殖した後、そのように。
注：必要なプレートの数は、時間点の数に基づいており、処置D下記の傍接しました。 - Atxn1 82Q-GFP /のpRK5プラスミド0.3μgのでトランスフェクトしたHeLa細胞を用いて各ウェルトランスフェクション試薬に、製造元の指示9に従って。 DNAとトランスフェクション試薬を含むマスタートランスフェクション混合物を作成し、各ウェルのためにそれを分取。
- 4-5時間後、トランスフェクション、励起波長450〜490ナノメートルとのGFP発現のための倒立蛍光顕微鏡下で生きた細胞を調べます。撮影後にインキュベーターに戻し、細胞を返します。
注：この時点では核内の両方の拡散GFPシグナルおよびGFPシグナルの小さなスペックルを守ってください。 - 真空吸引によって培地を除去し、50μg/ mlののCHXを含む2ミリリットルの新鮮なDMEMを追加します。収穫前のCHXで0、4、8、12、16時間細胞を処理します。プロテアソーム分解を調べるために、対照として16時間処理1プレートにプロテアソーム阻害剤MG132（10μM）を含みます。
- 各時点で、細胞のプレートを収穫。真空吸引ANによって培地を除去3 mlの氷冷1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回プレートを洗浄Dはドライアイス上でプレートをスナップ凍結。
- 最終時点（16時間）した後、氷冷細胞溶解緩衝液150μlの中に（すべての時点から）凍結細胞をこすり、30分間氷上でインキュベートしました。
- 4℃で15分間、17000×gで卓上遠心機で細胞溶解物を遠心。
- ピペットを用いて別のチューブに、NP-40溶性（NS）タンパク質を含有する上清を、転送します。
注：必要に応じて、Bradfordアッセイによりタンパク質濃度を測定するために上清を使用してください。 - 優しくペレットを乱すことなくチューブに約200μlの1×PBSを添加することにより、ペレットをすすぎます。慎重に真空吸引またはピペットでPBSを削除します。氷上で15〜30分間インキュベートし、150μlの氷冷細胞ペレットをバッファに再懸濁します。
注：再懸濁したペレット画分は、NP-40不溶性（NI）のタンパク質が含まれています。 DIAGについては、 図1Bを参照してください。洗剤分画のラム。 - ペレットから再懸濁NS画分とNP-40不溶性（NI）の画分に3回沸騰バッファー75μlのを追加します。 5分間のヒートブロック上で95℃でサンプルを加熱します。
注：塊は、NP-40不溶性画分に加熱した後に溶解し、サンプルが明らかになるだろう。 - ゆでたNSとNIのアリコートにSDSゲルローディングバッファーを追加します。 SDS-PAGEゲルにすべての時点から採取したサンプルを等量ロードします。時間0注で採取した試料から約20μgのNSのに対応してロードされたボリューム：NS、ならびにNI派からSDS-可溶性（SS）タンパク質は、分離ゲルのSDSすることで解決できます。これとは対照的に、NI画分からSDS耐性（SR）凝集体はゲルローディングウェル（ 図1B）で立ち往生しています。ウェスタンブロット検出を改善するために、NIの2倍量をロードすることができます。
- 抗GFP抗体を用いたウエスタンブロットおよび増強化学発光（ECL）によりNSとSS Atxn1 82Q-GFPを検出します。
注：このプロトコルを使用する場合SS画分中Atxn1 82Qは、一般的に以下NS画分と比較されます。長いECL露光は、最適な信号のために必要とされます。 - ドットブロット装置（ 図1B）を使用してフィルタ遅延アッセイによりペレット画分からSR Atxn1 82Qを調べます。簡単に言うと、0.2μmのセルロースアセテート膜を保持するドットブロット装置を設定します。ドットブロット装置の各ウェルにゆでNIの負荷80-120μlの。
注：SR凝集体のわずかな量が細胞内で形成されているように、ドットブロットアッセイのために、ウェスタンブロット分析のために使用されるNS画分の容積の約10〜15倍であるSR画分の量を読み込みます。- 真空によって膜を通してサンプルを濾過した後、膜に付着Atxn1 82Q-GFP凝集体は、抗GFPは9,12,22を免疫ブロッティングすることによって検出することができます。
注：フィルタ遅延アッセイの詳細については、9,12,22、前のレポートを参照してください。この手順はオプションですSR Atxn1 82Qは、このプロトコルで説明する短いトランスフェクションを、以下SSとNS画分に比べて最小限であるため。また、SR Atxn1 82Qのレベルが大幅にCHXチェイス（ 図2B）を介して同じまま。しかし、SS Atxn1 82Qの量は、最初の実験で任意の薬物治療や遺伝子発現のための時間をかけて影響を受けているかどうかを検討することが重要です。 SSタンパク質種は、ウェスタンブロットによって検出することができるSDS-PAGEゲルローディングウェルにとどまります。しかし、この方法はあまり敏感であり、多くの変数の結果（ 図1B）を生成します 。
- 真空によって膜を通してサンプルを濾過した後、膜に付着Atxn1 82Q-GFP凝集体は、抗GFPは9,12,22を免疫ブロッティングすることによって検出することができます。
SDS-PAGEおよびウエスタンブロットを使用してNLS-ルシフェラーゼGFP 3.分解アッセイ
- プレート約10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したDMEM培地で35mmのプレートに3×10 5 HeLa細胞。 O / N培養した後、40から60パーセントの合流は、トランスフェクションの時点で到達しました。必要なプレートの数は、Tの数に基づいていますIMEポイントと治療は、以下に説明します。
- 1.0μgのNLSルシフェラーゼ-GFP /のpRK5プラスミドでトランスフェクトしたHeLa細胞を用いて各ウェルトランスフェクション試薬に、製造元の指示9に従って。各ウェルのアリコートのためのDNAとトランスフェクション試薬を含むマスタートランスフェクションミックスを作成します。
- （15時間程度）O / Nトランスフェクションした後、励起波長450〜490ナノメートルとのGFP発現のための倒立蛍光顕微鏡下で生きた細胞を調べます。撮影後にインキュベーターに戻し、細胞を返します。
注：拡散処理核GFPシグナルは、細胞（70％）の大部分で観察することができます。細胞の小さな割合（5％）は、核凝集体を持っています。 - 真空吸引によって培地を除去し、50μg/ mlののCHXを含む2ミリリットルの新鮮なDMEMを追加します。収穫前のCHXで0、1.5、3、4.5および6時間細胞を処理します。プロテアソーム分解を調べるために、対照として6時間処理1のプレートに追加のプロテアソーム阻害剤MG132（10μM）を含みます。
- 各時点で、細胞のプレートを収穫。真空吸引によって培地を除去し、3ミリリットルの氷冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回プレートを洗浄します。ドライアイス上でプレートをスナップ凍結。
- 最後の時点（6時間）が終了した後に、すべての時点で凍結細胞を氷冷細胞溶解緩衝液150μlの中に掻き取り、氷上で30分間インキュベートします。
- 最終的に2％のSDSの濃度および50mMのDTTのための全細胞溶解物をSDSゲルローディングバッファーを追加します。 95℃で5分間ヒートブロック上でサンプルをインキュベートします。
- SDS-PAGEと抗GFP抗体を用いたウェスタンブロットによってNLS-ルシフェラーゼGFPを分析します。 SDS-PAGEゲルにすべての時点から採取したサンプルを等量ロードします。ロードされたボリュームは、約20μgの時間0で採取した試料からの全細胞溶解物のに対応しています。
蛍光マイクロプレートリーダーを使用したNLS-ルシフェラーゼ-GFPの4リアルタイム分解アッセイ
- 種子約1×10 4透明な底を有する黒色96ウェル組織培養プレートに、HeLa細胞。 O / N培養した後、百分の50から70までの合流は、トランスフェクションの時点で到達しました。
注：完全に懸濁したHeLa細胞を含有する培地の60μlの各ウェルに直接播種します。播種後前後に追加の媒体や岩板を追加しないでください、そうでなければ細胞が不均一に分布することができます。 - 各ウェル使用してトランスフェクション試薬へのNLSルシフェラーゼ-GFP /のpRK5プラスミド9の0.05〜0.1μgのでトランスフェクトしたHeLa細胞を製造業者の指示に従って。 DNAとトランスフェクション試薬を含むマスタートランスフェクション混合物を作成し、各ウェルのためにそれを分取。細胞との3つのウェルを、各処理条件の背景蛍光信号のための対照として役立つDNAでトランスフェクトされていません。
注：トランスフェクションの変動を低減する別の方法は、播種前に細胞をトランスフェクトすることです。しかし、細胞の大部分は、ミスフォールドタンパク質をトランスフェクトしましたsが添付またはこのメソッドを使用して減少した生存率を示すことができません。いくつかの細胞が毒性ミスフォールドタンパク質を発現させる際に、トリプシン消化により生じる応力に耐えられないことがありそうです。その結果、全体的な蛍光シグナルが大幅に低減されます。 - トランスフェクション後20-24時間、励起波長450〜490ナノメートルとのGFP発現のための倒立蛍光顕微鏡下で生きた細胞を調べます。
- 真空吸引によって培地を除去します。各ウェルにPBS 1×約200μlを添加し、その後DMEM培地の残留量を除去するために、それを吸引します。
- 5％FBSおよび50μg/ mlのCHXで低蛍光DMEM培地60μlのを追加します。プロテアソーム分解を調べるために、サンプルの一組に付加的なプロテアソーム阻害剤MG132（10μM）を含みます。各治療/条件のために、ウェルの三重を設定します。
注：のfluoの低下を引き起こす可能性が他の要因を排除することが重要であるため、MG132処理は、プロテアソームによる分解のためのコントロールとして含まれています細胞死および蛍光消光含むrescence信号。 - CHXを追加した後、蛍光プレートリーダーですぐにGFPの蛍光シグナルを測定します。
注：ソフトウェアの測定設定は、 表1に示します。 - プレートにまで8-10時間ごとに時間をお読みください。お読みになった後、細胞培養インキュベーターにバックプレートを返します。
- スプレッドシートファイルとしてデータをエクスポートします。各だけでなく、蛍光強度をマルチ読み込みの平均値を使用してください。各グループにおける時間0の平均値を、各データ点の値を正規化します。 図4Aおよび図4B、 図5、右パネルに示すように、時間をかけて正規化された蛍光強度をプロットします。
- 反復測定23との双方向ANOVAを使用して、2つの条件の間の分解速度の統計分析を実行します。
注：この分析では、「蛍光強度」とは、「treatm一方、従属変数でありますENT条件」と「時間」は、2つの要因である。その代わりに、個々の時点でデータを比較する、双方向ANOVA反復測定と全時間経過にわたって2つの治療群間の差を分析します。
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Representative Results
トランスフェクション後20時間（ 図1A）HeLa細胞の50％ -定常解析では、顕微鏡で可視Atxn1 82Q-GFPの核凝集体が30で観察することができます。抗GFP抗体を用いたNSとSS画分のウェスタンブロット分析は、タンパク質の分子量（ 図1B）に対応し、100キロダルトンと150 kDaのマーカー間Atxn1 82Q-GFPの別個のバンドを示します。 Atxn1 82Q-GFP SR画分中には、スタッキングゲル（ 図1B）の上部の種類のフィルタ遅延アッセイにより、またはSDS-PAGEおよびウェスタンブロットのいずれかによって検出することができます。任意の大きな核の凝集体が形成される前に、上記のプロトコルを使用して、半減期の分析のために、CHXチェイスは、最初のトランスフェクション後4-5時間を開始します。 SS画分中のAtxn1 82Q-GFPの半減期は16時間（ 図2A）の上にNS画分中のAtxn1 82Q-GFPのわずか又は全く減少とは対照的に、約5時間です。 degraAtxn1 82Q-GFPのdationは、部分的にMG132（ 図2A）で細胞を処理することによって阻害されます。我々は以前PMLが自分のSUMO化を促進することにより、ミスフォールドタンパク質の分解を刺激することを示しました。ここでは、変更された分解経路の一例として、PMLノックダウンを使用します。 PML siRNA処理はSS画分（ 図2A）にAtxn1 82Q-GFPの半減期を延長しました。 SR Atxn1 82Q-GFPに明らかな変化は制御またはPML siRNA処理細胞（ 図2Bおよび2C）のいずれかで検出されません。
二十時間トランスフェクション後、NLS-LucDM-GFP凝集体は5で顕微鏡見えるようになる- HeLa細胞の15％が、これは（ 図3A）をトランスフェクトされたDNAの量に依存して変化し得ます。 3時間（ 図3Bおよび3C） - SDS可溶性NLS-LucDM-GFPの半減期は2です。トランスフェクトされた細胞の蛍光強度は、また、上に減少しますCHX処理（ 図4Aおよび4B）時の時間。 CHX処理後6時間では、蛍光強度が安定した段階に達すると（ 図4Aおよび4B）を減少停止します。同じ時点で、可溶性NLS-LucDM-GFPは、残りの蛍光は、分解に耐性凝集種から生成されることを示唆している（ 図3Bおよび3C）大きく低下してしまいます。一貫して、集約ではなく、拡散、GFPは、9時間のCHX処理（ 図4C）後の細胞に残っています。分解速度は、（ 図4Aおよび4B）に影響されないが、興味深いことに、NLS-LucDM-GFPプラスミドの高い量を使用してトランスフェクションは、より多くの核の集合体だけでなく、残りの蛍光のより高い強度を生成します。ウェスタンブロットまたは蛍光読み取りに続くSDS-PAGEのいずれかを使用して、我々は、MG132処理によってNLS-LucDM-GFP分解の阻害を検出することができますか PMLのsiRNA（ 図3C、4A、4B、及び5）。
蛍光顕微鏡洗剤分別によってAtxn1 82Q-GFPの 図1 検出。（A）HeLa細胞をAtxn1 82Q-GFPでトランスフェクトし、DAPIで染色しました。個人およびマージされた画像が表示されます。 =10μmのスケールバー。 （B）2.分子量マーカーはAtxn1-Atxn 82Qのウエスタンブロット画像の左側に表示されているプロトコールに記載されているようAtxn1-82Q発現細胞の洗剤分画を示す図である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 。
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（ - ）またはPMLのsiRNA（AおよびC）、または未処理（B） 界面活性剤分画を用いてAtxn1 82Q-GFPの 図2 分解アッセイ HeLa細胞を、以前にコントロールで処理しました。細胞はAtxn1 82Q-GFPでトランスフェクトし、MG132の非存在下または存在下でCHXで処理しました。細胞溶解物の画分を、抗GFP抗体を用いて、（SR画分について、BおよびC）ウェスタンブロット（NSとSS画分A）またはフィルタ遅延アッセイに続いてSDS-PAGEによって分析した。 の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図。
NLS-LucDM-GFP分解の分析蛍光MICRによって 図3oscopy及びウェスタンブロット。NLS-LucDM-GFPでトランスフェクトされた（A）HeLa細胞をDAPIで染色しました。個人およびマージされた画像が表示されます。 =25μmのスケールバー。アローヘッドは、核の凝集物と細胞を示しています。 （B及びC）のHeLa細胞は、NLS-LucDM-GFPトランスフェクション（続いて、NLS-LucDM-GFPおよび野生型ルシフェラーゼ融合タンパク質NLS-LucWT-GFP（B）でトランスフェクトし、または制御、またはPML siRNAをトランスフェクトしました。 C）。示されるように、細胞は、CHXとMG132で処理しました。全細胞溶解物を、抗GFP抗体を用いたウェスタンブロットによって分析しました。画像は許可9と以前の出版物から変更されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
NLS-LucDM-GFPの分解については、 図4 の蛍光マイクロプレートベースのアッセイ96ウェルプレートに播種したHeLa細胞は、0.05μgの（A）または0.1μgの（B及びC）NLS-LucDM-GFPでトランスフェクトし、内CHXで処理しました。 MG132の存在または不在。ウェルの（A及びB）の蛍光強度を示した時点（±標準偏差平均値、N = 3）で測定しました。右側のパネルは、各治療群では時間0での測定値に正規化した値を示しているのに対し、左側のパネルには、元の蛍光読み取りを示します。 MG132でとすることなく、処理群間の差は反復測定との双方向ANOVAによって分析しました。 2つの治療群間のP値が示されています。 （C）ウェルを9時間のCHX処理の前または後、またはCHXおよびMG132処理後、蛍光顕微鏡で検査しました。より良い両方の明るい集約NLC-LucDM-GFPを有する細胞と薄暗い拡散タンパク質とそれらを表示するには、1.5のガンマ値は、すべての画像に適用しました。スケールバー=100μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5のAは、PMLノックダウン細胞におけるNLS-LucDM-GFPの分解速度を低下させた。以前に制御またはPML siRNAで処理したHeLa細胞を96ウェルプレートに播種しました。図4で説明したように、NLS-LucDM-GFPの分解を分析した（二元配置ANOVA; P <0.0001）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Atxn1 82Q-GFPの 図6. 蛍光はCHXチェイスにわたって変わらない。HeLa細胞をAtxn1 82Q-GFPをトランスフェクトしました。 図4で説明したように24時間のトランスフェクション後、Atxn1 82Q-GFPの分解を分析した。図は、元の蛍光読み取りを示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
細胞質LucDM-GFPの分解 図7 の蛍光マイクロプレートベースのアッセイは、96ウェルプレートに播種したHeLa細胞を、MG132の存在下または非存在下でCHXで処理した0.1μgのLucDM-GFPでトランスフェクトしました。 図4で説明したように、結果を解析した（二元配置ANOVA; p <0.0001）。TPS：//www.jove.com/files/ftp_upload/54266/54266fig7large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
表1：蛍光マイクロプレートリーダー上で測定の設定。
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Discussion
ミスフォールドタンパク質の分解を調節するメカニズムは、細胞タンパク質の恒常性を維持するために必須であり、それらはおそらく神経変性疾患および他のタンパク質の誤った折りたたみに起因する疾患を治療するための価値ある薬物標的を表します。ここでは、ミスフォールドタンパク質の分解を調べるアッセイは、例として、病原Atxn1タンパク質（Atxn1 82Q）および核局在化ルシフェラーゼ変異体（NLS-LucDM）を使用して、記載されています。
18時間を超える半減期を有する劣化Atxn1 82Qを、調べるために、我々は古典的なCHX 9と細胞分画を組み合わせることにより、新規な方法を導入しました。この方法は、時間の経過とともにAtxn1 82Qのミスフォールド種のはるかに迅速にクリアランスを明らかにしました。また、LucDMの導入は、ミスフォールドタンパク質の一般的な劣化メカニズムを研究するためのモデルミスフォールド基板を提供します。哺乳動物細胞においてミスフォールドタンパク質の分解を検出するためのHTSシステムの必要性に対処するためにsの、我々は、蛍光マイクロプレートリーダーを用いてLucDMための高速分解アッセイを開発しました。システムは、化学的および遺伝子スクリーニングのための強力なツールとして機能します。
Atxn1 82Qタンパク質はNS、SS、および細胞溶解物のSR画分に存在します。 SR画分は、アミロイド線維、例えば 、尊敬または劣化されにくい形態であることを示唆し、トランスフェクション後の長期培養中にますます普及します。容易に分解することができない毒性ミスフォールド種または凝集体の生成は、異常なタンパク質24、25,26を制御する内因性細胞機構の解析を妨げ、タンパク質分解経路を遮断することができます。 SRの大量の形成を回避するために、我々は最初のトランスフェクション後CHXチェイス4-5の時間を開始します。これはSS画分の分解を遅延させることができる細胞の状態の分析のために重要であることを見出しました。トランスフェクションの時間に加えて、また、オーバーしないように重要です非常に高いレベルでAtxn1 82Qタンパク質を発現して細胞を水に沈めます。全くまたは非常にゆっくりとした分解がすべての画分について観察されない場合は、Atxn1 82Qプラスミドの少ない量は、トランスフェクションのために使用されるべきです。アポトーシス細胞は、この時点を越えて気づいているように理想的には、アッセイは、12時間以内に完了する必要があります。 図2Aに、対照細胞におけるSS Atxn1 82の量は、8時間と短いPML siRNA処理細胞中のものと著しく異なっています。注意は、処置群の差はわずか12時間を越えて観察される場合、それは、細胞生存率はなくタンパク質分解に影響を与える他の要因によって引き起こされうるように、注意する必要があります。
NS Atxn1 82Qと比較して、SS画分中Atxn1 82Qは、それが容易にプロテアソーム（ 図2A）によって分解され得るミスフォールド種であることを示す、急速に排除されます。これとは対照的に、SR Atxn1 82Qのレベルが確認され、同じ時間経過（ 図2B）を介して変わりませんそれは非分解性の種です。それでも、SR画分の分析は、直接細胞質の凝集体（ 例えば、オートファジー）を除去するか、これらの凝集体の形成に影響を与えるメカニズムを分析するために重要であるべきです。顕著に、MG132は、SSの画分にAtxn1 82Qの低下を防止するにはあまり効果的であると思われます。これはAtxn1 82Qの凝集を促進する可能性がプロテアソーム阻害27時ROSレベルの上昇によって引き起こされ得ます。
LucDM-GFPアッセイの大きな利点は、蛍光プレートリーダーを使用して、HTS分析に適合させることができるということです。私たちは、最初にAtxn1 82Q用HTSシステムを開発しようとしました。全体的なAtxn1 82Qタンパク質のごく一部のみが時間の経過とともに低下しているのでしかし、GFP-Atxn1 82Qを発現する細胞の蛍光は、CHXチェイス（ 図6）の過程で大幅に変更されません。全体的に長い半減期を有する他のミスフォールドタンパク質は、リアルタイムフッ素と同様の問題を持っているでしょうescentアッセイ。対照的に、全体的なNLS-lucDM-GFPタンパク質の顕著な減少が観察される（ 図3及び4）。この機能は、一緒にその短い半減期（2~3時間）で、このモデルシャペロン基板を容易に蛍光分光法によって検出することが可能になります。以前の研究では、GFPu、建設的劣化信号（CL-1）に融合したGFPタンパク質は、広くユビキチン-プロテアソーム系28,29の機能のためのレポーターとして使用されています。それはまた、細胞および動物モデル30の著名な代理ミスフォールドタンパク質です。 GFPuと比較して、ここで説明する分解アッセイの一つの利点は、誤って折り畳まれたルシフェラーゼが広く使用されるモデルシャペロンの基質であることです。ルシフェラーゼ活性を調べることによって、人は簡単にin vitroおよびin vivoでのルシフェラーゼの天然変性及びリフォールディングコンフォメーションを評価することができます。したがって、私たちのシステムはとの結合アッセイおよびタンパク質のフォールディングを接続するために非常に有用なプラットフォームとして機能します同じ基板9を使用したセルラ分解システム。
出発蛍光強度、安定した残りの蛍光強度、およびタンパク質の半減期：次の値を得ることができる、リアルタイム蛍光測定を介し。これらの値は、チェイス前全体タンパク質の量、分解に耐性タンパク質の量、およびタンパク質代謝回転の速度とそれぞれ相関します。したがって、別のミスフォールドタンパク質種の濃度と動力学の総合的な分析を行うために、リアルタイム蛍光アッセイを使用することが可能です。時折、レプリケート間の開始蛍光の比較的大きな変動が観測される（ 例えば、 図5、左パネル）。これは、細胞播種またはトランスフェクションの変動によって引き起こされる可能性があります。しかし、開始蛍光強度の差にもかかわらず、すべての複製の信号は非常に同様の速度で降下します。信号の正規化あちこち（ 図4A、4B及び図5は 、右のパネル対左）、時間0での強度に対する各時間点はウェル間のばらつきを低減し、より正確な分解速度を反映することができますメートル。
核の形態に加えて、我々はまた、細胞質LucDM-GFPを分析しました。細胞質LucDM-GFPは、プロトコル4（ 図7）に記載したのと同じ実験手順を適用した場合、残りの蛍光の高い割合が観察された以外は同様の分解パターンを有します。分解は完全に、このアッセイは、プロテアソーム分解を介して、細胞質タンパク質の品質管理を監視するために使用することができることを示し、MG132を抑制することができます。今後の研究のためには、特定の細胞区画局在化シグナルに融合した場合LucDM-GFPは、他の細胞区画、 例えば、ミトコンドリアや小胞体に適用できるかどうかを調査するために興味深いものになるだろう。
蛍光ベースのアッセイのためのプロトコルで述べたように、蛍光バックグラウンドを低減し、ウェル間のトランスフェクションのばらつきを低減するためにDNAとトランスフェクション試薬のマスターミックスを使用する低蛍光媒体を使用することが重要です。利得制御は、いくつかの蛍光プレートリーダー上で調整することができます。その代わりに、最適化された手動のゲインを設定し、全体のアッセイ（ 表1）全体で同じ値を使用することが重要です。利得の値は、読み取りが検出限界を超えない限り、細胞のGFP蛍光の読み取りを最大にするように調整することができます。
現在の段階では、我々はまだLucDMを表現するために、トランスフェクションに依存しています。ばらつきを低減し、HTSのためのアッセイを簡素化するために、将来の目標はLucDMの誘導性発現を有する安定な細胞株を確立することです。マイクロプレートおよび培地の両方は、バックグラウンド蛍光を有するしかし、バックグラウンドより有意に高いGFPシグナルを有することが重要です。 Unfortunately、我々は最近設立された安定したラインがすべてLucDMの低い発現を有します。したがって、より高いタンパク質発現を有する安定したラインの発展が著しく、スクリーニングの効率を改善します。
ここで説明する分解アッセイは、他のミスフォールドタンパク質にも適用することができます。ミスフォールドタンパク質の動的特徴のために、これらのアッセイは、タンパク質の品質管理の詳細なメカニズムを明らかにするために、他の分析と結合する必要があります。これらの分析は、異なる細胞画分（ 図1）内の凝集体およびそれらのパーティションの定常状態レベルを測定し、精製された組換えタンパク質を用いてフォールディングまたは凝集タンパク質を分析することが挙げられます。これらのアッセイは、タンパク質分解または凝集に対する薬剤または遺伝子発現の直接的または間接的な影響を区別するのに役立ちます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M8699 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | 45000232 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Boehringer Mannheim | 4693159001 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Living Colors GFP Monoclonal Antibody | Clonetech | 632375 | |
| Anti-Actin mAb Rabbit, IgG | Sigma-Aldrich | A45060-200UL | |
| Amino acids | Sigma-Aldrich | Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium | |
| Olympus IX-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX71/IX81 | |
| 96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom | Sigma-Greiner | 89135-048 | |
| Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO | TECAN | Infinite 200® PRO | |
| Cellulose acetate membrane 0.2 µm | Sterlitech | CA023001 | |
| Prism 5 | GraphPad | Statistical analysis software |
References
- Dobson, C. M.
- Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
- Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H.
- Selkoe, D. J.
- Vousden, K. H., Prives, C. Blinded by the Light: The Growing Complexity of p53. Cell. 137, 413-431 (2009).
- Xu, J., et al. Gain of function of mutant p53 by coaggregation with multiple tumor suppressors. Nat Chem Biol. 7, 285-295 (2011).
- Orr, H. T., Zoghbi, H. Y.
- Guo, L., et al. A cellular system that degrades misfolded proteins and protects against neurodegeneration. Mol Cell. 55, 15-30 (2014).
- Chu, Y., Yang, X. SUMO E3 ligase activity of TRIM proteins. Oncogene. 30, 1108-1116 (2011).
- Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins. EMBO J. 26, 4102-4112 (2007).
- Janer, A., et al. PML clastosomes prevent nuclear accumulation of mutant ataxin-7 and other polyglutamine proteins. J Cell Biol. 174, 65-76 (2006).
- Bauer, P. O., et al. Harnessing chaperone-mediated autophagy for the selective degradation of mutant huntingtin protein. Nat Biotechnol. 28, 256-263 (2010).
- Austin, J. A., et al. Disease causing mutants of TDP-43 nucleic acid binding domains are resistant to aggregation and have increased stability and half-life. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 4309-4314 (2014).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nat Chem Biol. 10, 677-685 (2014).
- Paxinou, E., et al. Induction of alpha-synuclein aggregation by intracellular nitrative insult. J Neurosci. 21, 8053-8061 (2001).
- Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nat Methods. 8, 879-884 (2011).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313, 324-328 (2006).
- Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466, 1069-1075 (2010).
- Fortini, M. E., Bonini, N. M. Modeling human neurodegenerative diseases in Drosophila: on a wing and a prayer. Trends Genet. 16, 161-167 (2000).
- Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. Anti-fading media for live cell GFP imaging. PLoS One. 7, (2012).
- Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
- McDonald, J. H. Handbook of Biological Statistics. 3, 3rd, 173-179 (2014).
- Holmberg, C. I., Staniszewski, K. E., Mensah, K. N., Matouschek, A., Morimoto, R. I. Inefficient degradation of truncated polyglutamine proteins by the proteasome. EMBO J. 23, 4307-4318 (2004).
- Verhoef, L. G., Lindsten, K., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. Aggregate formation inhibits proteasomal degradation of polyglutamine proteins. Human molecular genetics. 11, 2689-2700 (2002).
- Jana, N. R., Zemskov, E. A., Wang, G., Nukina, N. Altered proteasomal function due to the expression of polyglutamine-expanded truncated N-terminal huntingtin induces apoptosis by caspase activation through mitochondrial cytochrome c release. Human molecular genetics. 10, 1049-1059 (2001).
- Fribley, A., Zeng, Q., Wang, C. Y. Proteasome inhibitor PS-341 induces apoptosis through induction of endoplasmic reticulum stress-reactive oxygen species in head and neck squamous cell carcinoma cells. Molecular and cellular biology. 24, 9695-9704 (2004).
- Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
- Chen, Q., et al. Intrasarcoplasmic amyloidosis impairs proteolytic function of proteasomes in cardiomyocytes by compromising substrate uptake. Circulation research. 97, 1018-1026 (2005).
- Link, C. D., et al. Conversion of green fluorescent protein into a toxic, aggregation-prone protein by C-terminal addition of a short peptide. The Journal of biological chemistry. 281, 1808-1816 (2006).
