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Biology

कोशिकाओं में misfolded प्रोटीन की गिरावट के लिए Assays

Published: August 28, 2016 doi: 10.3791/54266
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Department of Cancer Biology, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 2Department of Systems Pharmacology and Translational Therapeutics, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

Introduction

प्रोटीन कोशिकाओं में सबसे प्रचुर मात्रा में अणुओं हैं, और वे लगभग सभी जैविक प्रक्रियाओं में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं। सबसे अधिक प्रोटीन की जैविक गतिविधि में उनकी तह आवश्यकता है, और बनाए रखने, देशी तीन आयामी संरचना। न्यायपालिका रचना के साथ प्रोटीन केवल उनकी सामान्य कार्य नहीं खो देते हैं, लेकिन यह भी अक्सर घुलनशील oligomeric प्रजाति या समुच्चय है कि अन्य प्रोटीन के कार्यों ख़राब और कोशिकाओं 1,2 को विषाक्त कर रहे हैं के रूप में। प्रोटीन misfolding प्रतिक्रिया करने के लिए, कोशिकाओं दोनों आणविक chaperones है, जो सामने आया या आंशिक रूप से मुड़ा हुआ polypeptides की सहायता उनके मूल रचना तक पहुँचने के लिए, और गिरावट रास्ते, जो misfolded प्रोटीन 3 को समाप्त रोजगार। जटिलता और तह प्रक्रिया के स्टोकेस्टिक प्रकृति को देखते हुए, प्रोटीन misfolding अपरिहार्य है, और यह म्यूटेशन, biosynthetic त्रुटियों, और बाद translational हर्जाना 1 के मामले में वापस नहीं लिया जा सकता है। इसलिए, कोशिकाओं अंततः degradat पर भरोसाआयन रास्ते उनके प्रोटीन की गुणवत्ता बनाए रखने के लिए।

सेलुलर प्रोटीन की गुणवत्ता नियंत्रण के महत्व (PQC) सिस्टम कैंसर, मधुमेह और अल्जाइमर रोग, पार्किंसंस रोग, amyotrophic पार्श्व काठिन्य, हंटिंग्टन रोग (एचडी) के रूप में कई neurodegenerative विकारों सहित प्रोटीन misfolding रोगों के प्रसार से रेखांकित किया है, और spinocerebellar ataxias (एससीए) 4,5। उदाहरण के लिए, ट्यूमर शमन P53 में म्यूटेशन ट्यूमर में ही सबसे अधिक बार आनुवंशिक घाव, ~ के साथ सभी मामलों 6 की 50-70% जुड़ा हुआ है। P53 उत्परिवर्तनों का एक बड़ा हिस्सा missense उत्परिवर्तन कि P53 की रचना में परिवर्तन, समुच्चय 7 के गठन के लिए अग्रणी रहे हैं। इसके अलावा, विस्तार polyQ हिस्सों के साथ प्रोटीन आनुवंशिक रूप से और pathologically साथ HD और एससीए जुड़े रहे हैं। ये प्रगतिशील और अक्सर घातक रोगों प्रकट जब प्रभावित प्रोटीन में polyQ खिंचाव की लंबाई एक निश्चित thres से अधिकपकड़ है, और तेजी से गंभीर हो जाता है के रूप में polyQ खिंचाव की लंबाई 8 को बढ़ाता है।

इन रोगों के इलाज के लिए एक आकर्षक दृष्टिकोण उपचारात्मक सेलुलर PQC प्रणाली, विशेष रूप से गिरावट रास्ते को मजबूत करने के लिए है। हालांकि, दोषपूर्ण प्रोटीन, विशेष रूप से स्तनधारी कोशिकाओं में उन लोगों की गिरावट में शामिल रास्ते, खराब समझ रहते हैं। हालांकि यह स्वीकार किया गया है कि एंटीबॉडी misfolded प्रोटीन की गिरावट के लिए महत्वपूर्ण है, एक महत्वपूर्ण मुद्दा अपरिभाषित रहता है: कैसे misfolded प्रोटीन विशेष रूप से मान्यता प्राप्त है और गिरावट के लिए लक्षित कर रहे हैं। इसके अलावा, हालांकि PQC सिस्टम कोशिका द्रव्य, जालिका, और माइटोकॉन्ड्रियन सहित सेलुलर डिब्बों में पहचान की गई है, नाभिक में PQC सिस्टम अस्पष्ट रहते हैं 2।

हमारी प्रयोगशाला द्वारा हाल के अध्ययनों से एक प्रणाली है कि नाभिक में पहचानता है और misfolded प्रोटीन की एक किस्म की पहचान की है degradesके स्तनधारी कोशिकाओं 9। इस प्रणाली प्रोमाईलोसाईटिक प्रोटीन (पीएमएल), एक परमाणु प्रोटीन और त्रिपक्षीय मूल भाव युक्त (ट्रिम) प्रोटीन के परिवार के एक सदस्य है, और RNF4, एक अंगूठी-डोमेन प्रोटीन युक्त के शामिल है। पीएमएल, और कई अन्य ट्रिम प्रोटीन, सूमो (छोटे यूबीक्यूटिन-तरह आपरिवर्तक) E3 ligase गतिविधि है, जो विशिष्टता और प्रोटीन sumoylation 10 की दक्षता की सुविधा के पास है। RNF4 सूमो-लक्षित यूबीक्यूटिन ligases (STUbL), जो अंगूठी डोमेन है कि उन्हें यूबीक्यूटिन ligase गतिविधि 11 परमिट के अलावा एक या एक से अधिक सूमो बातचीत रूपांकनों (एस) होते हैं के एक छोटे समूह के अंतर्गत आता है। हमने पाया है कि पीएमएल विशेष रूप से असतत सब्सट्रेट मान्यता साइटों है कि misfolded प्रोटीन पर विशिष्ट सुविधाओं विचार कर सकते हैं के माध्यम से misfolded प्रोटीन को पहचानता है। पर बाध्यकारी, पीएमएल टैग misfolded SUMO2 / 3 की पाली-चेन, दो लगभग समान स्तनधारी सूमो प्रोटीन है कि एक आंतरिक sumoylation साइट के अस्तित्व के कारण पाली-चेन के रूप में कर सकते हैं के साथ प्रोटीन। एसUMOylated misfolded प्रोटीन तो RNF4, जो उनके ubiquitination और proteasomal गिरावट की ओर जाता है द्वारा मान्यता प्राप्त हैं। हम आगे प्रदर्शन किया है कि पीएमएल-RNF4 प्रणाली neurodegeneration खिलाफ संरक्षण के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में पीएमएल में कमी एससीए प्रकार के एक माउस मॉडल 1 (Sca1) 9 के व्यवहार और नयूरोपथोलोगिकल दोष exacerbates।

अन्य सेलुलर तंत्र है कि प्रोटीन के स्तर को विनियमित सकता से प्रोटीन गिरावट भेद करने के लिए, प्रोटीन कारोबार की दर 9 मापा गया था। सबसे अक्सर इस्तेमाल किया तरीकों प्रोटीन कारोबार का निर्धारण करने के अलावा पल्स चेस और cycloheximide (CHX) का पीछा कर रहे हैं। इन दोनों तरीकों में समय के साथ जांच, क्रमशः, अनुवाद-कुशल कोशिकाओं और अनुवाद-हिचकते कोशिकाओं में ब्याज की कुल पहले से मौजूद प्रोटीन के हित में रेडियो आइसोटोप लेबल प्रोटीन। हालांकि, रोगजनक और misfolding-प्रवण प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए एक बड़ी चुनौती है कि इन प्रोटीनों की आधा जीवन बेहद लो हो सकता हैएनजी। उदाहरण के लिए, Ataxin -1, Ataxin-7, हनटिंग्टन, α-synuclein, और तेदेपा -43 सब अधिक से अधिक 12 का आधा जीवन 24 घंटा 9,12-16 किया है। इन प्रोटीनों की धीमी कारोबार दरों CHX चेस विश्लेषण के उपयोग में बाधा क्योंकि कोशिकाओं इन प्रोटीनों को शरण देने, लंबे समय तक अनुवाद निषेध नहीं बच सकता है, खासकर इसलिए misfolded प्रोटीन खुद को अत्यधिक कोशिकाओं को विषाक्त हो सकता है। समस्थानिक लेबलिंग के साथ पल्स-चेस विश्लेषण भी प्रोटीन है कि अत्यधिक एकत्रीकरण-प्रवण हैं के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है। अधिकांश पल्स-चेस assays immunoprecipitation पर भरोसा सभी अन्य प्रोटीन भी है कि radioactively चिह्नित कर रहे हैं से ब्याज की प्रोटीन को अलग करने के लिए। यह प्रक्रिया सामान्य रूप से लंबा immunoprecipitation और धोने प्रक्रियाओं, जिसके दौरान एसडीएस अघुलनशील समुच्चय के रूप में कर सकते हैं शामिल, एसडीएस पृष्ठ वैद्युतकणसंचलन गलत के साथ विश्लेषण कर रही है।

यहाँ एक प्रोटोकॉल परमाणु misfolded प्रोटीन का विश्लेषण करने के साथ एक धीमी कारोबार दर 9 वर्णन किया गया है। Ataxin-1 (Atxn1) है कि 82 ग्लूटामाइन (Atxn1 82Q) का एक खिंचाव होता है की एक रोगजनक फार्म इस उद्देश्य 8 के लिए प्रयोग किया जाता है। जब कोशिकाओं में व्यक्त की, नाभिक (चित्रा 1 ए) में Atxn1 82Q रूपों microscopically दिखाई समावेशन के एक बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) संलयन। पल्स चेस विश्लेषण से पता चलता है कि Ataxn1 82Q के आधे-जीवन पर 18 घंटा 9 है। Atxn1 82Q मूल रचना के साथ अलग अलग विशेषताओं के misfolded रचना, साथ ही प्रजातियों के साथ प्रजाति से बना है। यह संभावना है कि इन प्रजातियों में अलग दरों पर अपमानित कर रहे हैं, और इस तरह अलग से विश्लेषण किया जाना चाहिए। से lysates Atxn1 82Q-GFP व्यक्त कोशिकाओं एनपी 40 घुलनशील (घुलनशील या एन एस, संभावना देशी प्रोटीन या misfolded monomeric / oligomeric प्रोटीन का प्रतिनिधित्व) और एनपी-40-अघुलनशील (एनआई, एकत्रित / misfolded) भागों में fractionated रहे हैं। या एसडीएस प्रतिरोधी (एसआर, बाद आगे एसडीएस घुलनशील (संभावना अव्यवस्थित समुच्चय एसएस); में विभाजित किया जा सकता है की संभावना amyloid तंतु) भिन्न (चित्रा 1 बी)। एन एस और एस एस भिन्न, एसडीएस पृष्ठ पश्चिमी सोख्ता के बाद से विश्लेषण किया जा सकता है, जबकि एसआर अंश immunoblotting द्वारा पीछा किया फिल्टर मंदता assays से पता लगाया जा सकता है। CHX चेस डिटर्जेंट विभाजन विधि के साथ संयुक्त है, और पता चला कि एसएस Atxn1 82Q के आधे जीवन एन एस Atxn1 82Q और कुल Atxn1 82Q (2A चित्रा) की तुलना में बहुत कम है, यह दर्शाता है कि एसएस अंश आसानी से पहचाना जा सकता है और अपमानित 9 कोशिकाओं में। इस प्रकार, इस विधि misfolded प्रोटीन की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए और उनके गिरावट पैटर्न तुलना करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है।

हम भी एक विधि अणुओं या छोटे यौगिकों कि misfolded प्रोटीन की गिरावट मिलाना कर सकते हैं की पहचान करने के लिए उच्च throughput प्रदर्शन के लिए उपयुक्त है कि वर्णन है। इस विधि जुगनू luciferase (LucDM) 17, एक मॉडल निगरानी सब्सट्रेट के एक conformationally अस्थिर उत्परिवर्ती पर आधारित है। हम फ्यूजएक परमाणु स्थानीयकरण संकेत (एनएलएस) के डी LucDM का पता लगाने की सुविधा के लिए इस सेलुलर डिब्बे में PQC प्रणालियों की जांच के लिए, और GFP (एनएलएस LucDM GFP)। एनएलएस LucDM-GFP रूपों microscopically कोशिकाओं (चित्रा 3 ए) का एक छोटा सा प्रतिशत में दिखाई परमाणु समुच्चय। Atxn1 82Q, एनएलएस LucDM-GFP-नहीं, बल्कि अपने जंगली प्रकार के समकक्ष एनएलएस LucWT-GFP-SUMO2 है / 3 से पीएमएल-RNF4 मार्ग 9 से संशोधित और विनियमित करने के लिए भी इसी तरह। एनएलएस LucDM-GFP भी एस एस और एसआर प्रजातियों रूपों, हालांकि एस एस और एसआर प्रजातियों के रिश्तेदार मात्रा एन एस की तुलना में कम कर रहे हैं, शर्तों के नीचे प्रोटोकॉल 3 में वर्णित का उपयोग कर। परख को आसान बनाने के लिए, हम केवल एसडीएस घुलनशील LucDM एसडीएस पृष्ठ और पश्चिमी धब्बा (दोनों एन एस और एस एस अंशों सहित) का विश्लेषण। महत्वपूर्ण बात है, CHX चेस परख से पता चला कि एसडीएस घुलनशील एनएलएस LucDM-GFP के आधे जीवन अपने जंगली प्रकार के समकक्ष (चित्रा 3 बी) की तुलना में बहुत कम है, सुझाव है कि LucDM प्रणाली है कि पहचानता है और degrades के लिए एक विशिष्ट सब्सट्रेट हैmisfolded प्रोटीन।

LucDM-GFP की गिरावट समग्र प्रतिदीप्ति संकेत में उल्लेखनीय गिरावट का कारण बनता है। इसलिए, हम भी सेलुलर LucDM-GFP microplate प्रतिदीप्ति आधारित परख का उपयोग कर के वास्तविक समय का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है। कई उच्च throughput स्क्रीन (एचटीएस) सिस्टम दवाओं या जीन सेलुलर समुच्चय और न्यायपालिका प्रोटीन 18-20 की वजह से सेलुलर व्यवहार्यता को संशोधित करने के लिए विकसित कर रहे हैं। लेकिन, बहुत कम HTSs विशेष स्तनधारी कोशिकाओं में गिरावट को निशाना बनाने के लिए तैयार कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल सेलुलर misfolded प्रोटीन गिरावट पर प्रोटीन अभिव्यक्ति, पछाड़ना, और नशीली दवाओं के उपचार के प्रभाव के तेजी से और बड़े पैमाने पर विश्लेषण के लिए एक मजबूत प्रणाली के रूप में कार्य करता है। उदाहरण के रूप में हेला कोशिकाओं का प्रयोग, नीचे हम इन दो misfolded प्रोटीन के विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन है। assays भी अन्य सेल लाइनों के लिए लागू किया जा सकता है, हालांकि अभिकर्मक की स्थिति और समय बेशक अलग-अलग सेल लाइनों के लिए अनुकूलित किया जाना पड़ सकता है।

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Protocol

1. अभिकर्मक की तैयारी

  1. सेल बफर तैयार (50 मिमी Tris, पीएच 8.8, 100 मिमी NaCl, 5 मिमी 2 MgCl, 0.5% एनपी 40)। अनुपूरक 2 मिमी डीटीटी, 1x पूरा प्रोटीज कॉकटेल और 250 आइयू / एमएल Benzonase उपयोग करने से पहले।
  2. गोली बफर तैयार (20 ​​मिमी Tris, पीएच 8.0, 15 मिमी 2 MgCl)। अनुपूरक 2 मिमी डीटीटी, 1x पूरा प्रोटीज कॉकटेल और 250 आइयू / एमएल Benzonase उपयोग करने से पहले।
  3. 3x उबलते बफर (6% एसडीएस, 20 मिमी Tris, 8.0 पीएच) तैयार करें। उपयोग करने से पहले अनुपूरक 150 मिमी डीटीटी।
  4. microplate प्रतिदीप्ति रीडर का उपयोग assays के लिए कम प्रतिदीप्ति DMEM मध्यम तैयार करें। मिक्स 25 मिमी ग्लूकोज, 0.4 मिमी ग्लाइसिन, 0.4 मिमी arginine, 0.2 मिमी सिस्टीन, 4.0 मिमी glutamine, 0.2 मिमी हिस्टिडीन, 0.8 मिमी isoleucine, 0.8 मिमी leucine, 0.8 मिमी लाइसिन, 0.2 मिमी methionine, 0.4 मिमी फेनिलएलनिन, 0.4 मिमी सेरीन, 0.8 मिमी threonine, 0.078 मिमी नियासिन, 0.4 मिमी tyrosine, 0.8 मिमी valine, 1.8 मिमी 2 CaCl, 0.81 मिमी MgSO 4, 5.33 मिमी KCl, 44.0 मिमी 3 NaHCO, 110 मिमी NaCl, 0.9 मिमीनः 2 4 पीओ। 7.4 पीएच को एचसीएल या NaOH का उपयोग कर समाधान का पीएच को समायोजित करें। छानने के माध्यम से मध्यम जीवाणुरहित।
    नोट: यह माध्यम है कि फे को छोड़कर उच्च ग्लूकोज के साथ मानक DMEM माध्यम के घटक हैं (3) 3, विटामिन और फिनोल लाल छोड़े गए हैं। फिनोल लाल, राइबोफ्लेविन और नियमित रूप से DMEM संस्कृति माध्यम में pyridoxal काफी प्रतिदीप्ति संकेत 21 का पता लगाने के साथ हस्तक्षेप। उन घटकों के बिना संस्कृति के माध्यम से सफल रहते सेल GFP इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है। मध्यम 12 महीनों के लिए स्थिर जब प्रशीतित संग्रहीत है।

Atxn1 82Q GFP के 2. गिरावट परख

  1. प्लेट लगभग 35 मिमी DMEM मध्यम के साथ प्लेटों 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक में 3 एक्स 10 5 हेला कोशिकाओं है, ताकि बाद हे / एन संवर्धन कोशिकाओं अभिकर्मक के समय में 40-60% की एक संगम के लिए बढ़ता है।
    नोट: जरूरत प्लेटों की संख्या समय अंक और उपचार डी की संख्या पर आधारित हैनीचे escribed।
  2. Transfect हेला प्रत्येक अच्छी तरह से उपयोग अभिकर्मक निर्माता के अनुदेश 9 के अनुसार अभिकर्मक में Atxn1 82Q-GFP / pRK5 प्लाज्मिड के 0.3 माइक्रोग्राम के साथ कोशिकाओं। डीएनए और अभिकर्मक अभिकर्मक युक्त एक मास्टर अभिकर्मक मिश्रण बनाने के लिए और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए इसे विभाज्य।
  3. 4-5 घंटा के बाद अभिकर्मक, उत्तेजना तरंगदैर्ध्य 450-490 एनएम के साथ GFP अभिव्यक्ति के लिए एक औंधा फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे जीवित कोशिकाओं की जांच। इमेजिंग के बाद इनक्यूबेटर वापस करने के लिए कोशिकाओं लौटें।
    नोट: इस समय में दोनों दूर तक फैला हुआ GFP संकेतों और नाभिक में GFP संकेतों के छोटे speckles का निरीक्षण करें।
  4. वैक्यूम आकांक्षा से मध्यम निकालें और 2 मिलीलीटर 50 माइक्रोग्राम / एमएल CHX युक्त ताजा DMEM जोड़ें। कटाई से पहले CHX साथ 0, 4, 8, 12 और 16 घंटे के लिए कोशिकाओं को समझो। proteasomal गिरावट की जांच करने के लिए, एक प्लेट एक नियंत्रण के रूप में 16 घंटे के लिए इलाज किया एंटीबॉडी अवरोध करनेवाला MG132 (10 माइक्रोन) के शामिल हैं।
  5. हर समय बिंदु पर कोशिकाओं की एक प्लेट हार्वेस्ट। वैक्यूम आकांक्षा एक से मध्यम निकालेंD 3 मिलीलीटर ठंडा 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ दो बार प्लेटें धोने। सूखी बर्फ पर प्लेट स्नैप फ्रीज।
  6. पिछली बार बिंदु (16 घंटा) के बाद, ठंडा सेल बफर के 150 μl में (सभी समय अंक से) जमे हुए कोशिकाओं परिमार्जन और 30 मिनट के लिए बर्फ पर incubated।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 17,000 XG पर एक benchtop अपकेंद्रित्र में सेल lysates अपकेंद्रित्र।
  8. सतह पर तैरनेवाला, जो एनपी 40 घुलनशील (एन एस) प्रोटीन होता स्थानांतरण, एक पिपेट का उपयोग कर एक और ट्यूब के लिए।
    नोट: ब्रैडफोर्ड परख द्वारा प्रोटीन सांद्रता को मापने के लिए अगर जरूरत supernatants का प्रयोग करें।
  9. धीरे छर्रों के बिना परेशान ट्यूबों के लिए लगभग 200 μl 1x पीबीएस जोड़कर छर्रों कुल्ला। ध्यान से वैक्यूम आकांक्षा या पिपेट द्वारा पीबीएस को हटा दें। उन्हें 150 μl ठंडा सेल गोली बफर में फिर से निलंबित, बर्फ पर 15-30 मिनट ऊष्मायन द्वारा पीछा किया।
    ध्यान दें: resuspended गोली अंश एनपी 40 अघुलनशील (एनआई) प्रोटीन होता है। एक निदान के लिए चित्रा 1 बी देखेंडिटर्जेंट विभाजन की रैम है।
  10. एन एस भिन्न और एनपी 40 अघुलनशील (एनआई) अंशों छर्रों से resuspended में 3x उबलते बफर के 75 μl जोड़ें। 5 मिनट के लिए एक गर्मी ब्लॉक पर 95 डिग्री सेल्सियस पर नमूने हीट।
    नोट: एनपी 40 अघुलनशील भागों में Clumps हीटिंग और नमूने स्पष्ट हो जाएगा के बाद भंग कर रहे हैं।
  11. उबला हुआ एन एस और एनआई की एक विभाज्य करने के लिए एसडीएस जेल लोड हो रहा बफर जोड़ें। एसडीएस पृष्ठ जेल के लिए हर समय बिंदुओं से एकत्र नमूनों की बराबर मात्रा लोड। मात्रा लोड नमूना से लगभग 20 माइक्रोग्राम एन एस के लिए मेल खाती समय 0. नोट पर एकत्र: NI गुट से एन एस, साथ ही एसडीएस घुलनशील (एसएस) प्रोटीन, एसडीएस को अलग जेल से हल किया जा सकता है। इसके विपरीत, एनआई अंश से एसडीएस प्रतिरोधी (एसआर) समुच्चय जेल लोड हो रहा कुओं (चित्रा 1 बी) में फंस रहे हैं। पश्चिमी धब्बा पता लगाने में सुधार करने के लिए, एनआई के दोहरे मात्रा लोड किया जा सकता है।
  12. एन एस और एस एस Atxn1 82Q-GFP का पता लगाने के पश्चिमी धब्बा विरोधी GFP एंटीबॉडी और बढ़ाया chemiluminescence (ईसीएल) का उपयोग करके।
    नोट: जब इस प्रोटोकॉल का उपयोग एसएस अंश में Atxn1 82Q आम तौर पर कम एन एस अंश की तुलना में है। लंबे समय तक ईसीएल जोखिम इष्टतम संकेतों के लिए आवश्यक है।
  13. फिल्टर मंदता एक डॉट धब्बा तंत्र (चित्रा 1 बी) का उपयोग assays के द्वारा गोली अंश से एसआर Atxn1 82Q जांच करते हैं। संक्षेप में, एक डॉट धब्बा तंत्र एक 0.2 माइक्रोन सेलूलोज एसीटेट झिल्ली धारण की स्थापना की। लोड 80-120 डॉट धब्बा तंत्र के प्रत्येक कुएं में उबला हुआ नी μl।
    नोट: के रूप में एसआर समुच्चय की ही छोटी मात्रा में कोशिकाओं में बनते हैं, डॉट धब्बा परख के लिए, एसआर अंश है कि पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए इस्तेमाल एन एस अंश की मात्रा का लगभग 10-15 गुना की एक मात्रा लोड।
    1. वैक्यूम द्वारा झिल्ली के माध्यम से नमूने को छानने के बाद, Atxn1 82Q-GFP झिल्ली पर अटक समुच्चय विरोधी GFP immunoblotting 9,12,22 से पता लगाया जा सकता है।
      नोट: फिल्टर मंदता परख के विस्तृत विवरण के लिए पिछली रिपोर्टों 9,12,22 देखें। यह कदम वैकल्पिक हैक्योंकि एसआर Atxn1 82Q कम अभिकर्मक इस प्रोटोकॉल में वर्णित निम्नलिखित एस एस और एन एस अंशों की तुलना में कम है। इसके अलावा, एसआर Atxn1 82Q के स्तर को काफी हद तक CHX चेस (चित्रा 2 बी) पर ही रहते हैं। हालांकि, यह अभी भी जांच करने के लिए है कि क्या एसएस Atxn1 82Q की मात्रा किसी भी दवा उपचार या प्रारंभिक प्रयोगों में जीन की अभिव्यक्ति के लिए समय के साथ प्रभावित कर रहे हैं महत्वपूर्ण है। एसएस प्रोटीन प्रजातियों पश्चिमी धब्बा से पता लगाया जा सकता है एसडीएस पृष्ठ जेल लोड हो रहा कुओं में रहते हैं। हालांकि, इस पद्धति कम संवेदनशील है और अधिक चर परिणाम (चित्रा 1 बी) उत्पन्न करता है।

3. एनएलएस-luciferase-GFP की गिरावट परख एसडीएस पृष्ठ और वेस्टर्न ब्लाट का प्रयोग

  1. प्लेट लगभग 35 मिमी DMEM मध्यम के साथ प्लेटों 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक में 3 एक्स 10 5 हेला कोशिकाओं। हे / एन संवर्धन के बाद, 40-60% का संगम अभिकर्मक के समय पर पहुँच जाता है। जरूरत प्लेटों की संख्या टी की संख्या पर आधारित हैIME अंक और उपचार के नीचे वर्णित है।
  2. प्रत्येक अच्छी तरह से उपयोग अभिकर्मक निर्माता के अनुदेश 9 के अनुसार अभिकर्मक में 1.0 माइक्रोग्राम एनएलएस-luciferase-GFP / pRK5 प्लाज्मिड के साथ Transfect हेला कोशिकाओं। अच्छी तरह से प्रत्येक के विभाज्य के लिए डीएनए और अभिकर्मक अभिकर्मक युक्त एक मास्टर अभिकर्मक मिश्रण बनाओ।
  3. हे / एन अभिकर्मक (15 घंटा के आसपास) के बाद, उत्तेजना तरंगदैर्ध्य 450-490 एनएम के साथ GFP अभिव्यक्ति के लिए एक औंधा फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे जीवित कोशिकाओं की जांच। इमेजिंग के बाद इनक्यूबेटर वापस करने के लिए कोशिकाओं लौटें।
    नोट: दूर तक फैला परमाणु GFP संकेत कोशिकाओं (70%) के बहुमत में मनाया जा सकता है। कोशिकाओं के एक छोटे प्रतिशत (5%) परमाणु समुच्चय है।
  4. वैक्यूम आकांक्षा से मध्यम निकालें और 2 मिलीलीटर 50 माइक्रोग्राम / एमएल CHX युक्त ताजा DMEM जोड़ें। कटाई से पहले CHX साथ 0, 1.5, 3, 4.5 और 6 घंटे के लिए कोशिकाओं को समझो। proteasomal गिरावट की जांच करने के लिए, एक प्लेट नियंत्रण के रूप में 6 घंटे के लिए इलाज किया में अतिरिक्त एंटीबॉडी अवरोध करनेवाला MG132 (10 माइक्रोन) के शामिल हैं।
  5. हर समय बिंदु पर कोशिकाओं की एक प्लेट हार्वेस्ट। वैक्यूम आकांक्षा से मध्यम निकालें और 3 मिलीलीटर ठंडा फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ दो बार प्लेटें धोने। सूखी बर्फ पर प्लेट स्नैप फ्रीज।
  6. पिछली बार बिंदु (6 घंटा) के बाद समाप्त हो गया है, कोशिकाओं जमे हुए सभी समय अंक ठंडा सेल बफर के 150 μl में स्क्रैप और 30 मिनट के लिए बर्फ पर incubated हैं।
  7. 2% एसडीएस के अंतिम एकाग्रता और 50 मिमी डीटीटी के लिए पूरे सेल lysates के लिए एसडीएस जेल लोडिंग बफर जोड़ें। 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्मी ब्लॉक पर नमूने सेते हैं।
  8. एसडीएस पृष्ठ और पश्चिमी धब्बा विरोधी GFP एंटीबॉडी का उपयोग करके एनएलएस-luciferase-GFP का विश्लेषण। एसडीएस पृष्ठ जेल के लिए हर समय बिंदुओं से एकत्र नमूनों की बराबर मात्रा लोड। मात्रा लगभग 20 माइक्रोग्राम प्रति नमूना से पूरे सेल lysates समय 0 पर एकत्र की से मेल खाती भरा हुआ है।

एनएलएस-luciferase-GFP के 4. वास्तविक समय गिरावट परख प्रतिदीप्ति Microplate रीडर का उपयोग

  1. बीज लगभग 1 एक्स 10 4पारदर्शी नीचे के साथ काले रंग की 96 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में हेला कोशिकाओं। हे / एन संवर्धन के बाद, 50-70% का संगम अभिकर्मक के समय पर पहुँच जाता है।
    नोट: पूरी तरह से निलंबित कर दिया हेला कोशिकाओं से युक्त मध्यम के 60 μl अच्छी तरह से प्रत्येक में सीधे वरीयता प्राप्त हैं। आगे और पीछे बोने के बाद अतिरिक्त मध्यम या रॉक प्लेट न जोड़ें, अन्यथा कोशिकाओं असमान रूप से वितरित किया जा सकता है।
  2. Transfect हेला प्रत्येक अच्छी तरह से उपयोग अभिकर्मक निर्माता अनुदेश के अनुसार अभिकर्मक में एनएलएस-luciferase-GFP / pRK5 प्लाज्मिड 9 के 0.05-0.1 माइक्रोग्राम के साथ कोशिकाओं। डीएनए और अभिकर्मक अभिकर्मक युक्त एक मास्टर अभिकर्मक मिश्रण बनाने के लिए और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए इसे विभाज्य। कोशिकाओं के साथ तीन कुओं डीएनए है, जो प्रत्येक उपचार हालत के लिए पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति संकेत के लिए नियंत्रण के रूप में कार्य करता है के साथ ट्रांसफ़ेक्ट नहीं कर रहे हैं।
    नोट: अभिकर्मक भिन्नता को कम करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका बोने से पहले कोशिकाओं transfect करने के लिए है। हालांकि, कोशिकाओं के एक बड़े हिस्से misfolded प्रोटीन के साथ ट्रांसफ़ेक्टरों देते हैं या इस विधि का उपयोग कम व्यवहार्यता को दिखाने के लिए असफल। यह संभावना है कि कुछ कोशिकाओं trypsin पाचन की वजह से जब विषाक्त misfolded प्रोटीन व्यक्त तनाव बर्दाश्त नहीं कर सकता है। नतीजतन, समग्र फ्लोरोसेंट संकेत काफी कम है।
  3. अभिकर्मक के बाद 20-24 घंटा, उत्तेजना तरंगदैर्ध्य 450-490 एनएम के साथ GFP अभिव्यक्ति के लिए एक औंधा फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे जीवित कोशिकाओं की जांच।
  4. वैक्यूम आकांक्षा से मध्यम निकालें। अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए पीबीएस 1x लगभग 200 μl जोड़ें और फिर यह aspirate DMEM माध्यम के अवशिष्ट राशि निकालने के लिए।
  5. 5% FBS और 50 माइक्रोग्राम / एमएल CHX के साथ कम प्रतिदीप्ति DMEM माध्यम के 60 μl जोड़ें। proteasomal गिरावट की जांच करने के लिए, नमूनों में से एक सेट में अतिरिक्त एंटीबॉडी अवरोध करनेवाला MG132 (10 माइक्रोन) के शामिल हैं। प्रत्येक उपचार / हालत के लिए कुओं की तीन प्रतियों सेट करें।
    नोट: क्योंकि यह महत्वपूर्ण है कि अन्य कारकों Fluo की गिरावट पैदा कर सकता बाहर शासन करने के लिए MG132 उपचार proteasomal गिरावट के लिए नियंत्रण के रूप में शामिल किया जाता हैकोशिका मृत्यु और प्रतिदीप्ति शमन सहित rescence संकेत।
  6. GFP प्रतिदीप्ति संकेत को मापने के तुरंत CHX जोड़ने के बाद एक फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर पर।
    नोट: सॉफ्टवेयर माप सेटिंग्स तालिका 1 में दिखाया जाता है।
  7. अप करने के लिए 8-10 घंटे के लिए प्लेट हर एक घंटे में पढ़ें। पढ़ने के बाद, सेल संस्कृति इनक्यूबेटर के लिए वापस थाली लौटें।
  8. स्प्रेडशीट फ़ाइल के रूप में डेटा निर्यात करें। मतलब मूल्य प्रयोग की अच्छी तरह से बहु-पढ़ता प्रत्येक के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता के रूप में। संबंधित समूहों में समय 0 का मतलब मूल्यों के लिए प्रत्येक डेटा बिंदु के मूल्यों को मानक के अनुसार। समय के साथ सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता साजिश के रूप में चित्रा -4 ए और 4 बी, और चित्रा 5, सही पैनल में दिखाया गया है।
  9. दोहराया उपायों 23 के साथ दो तरह से एनोवा का उपयोग कर दो स्थितियों के बीच गिरावट दरों के सांख्यिकीय विश्लेषण करते हैं।
    नोट: इस विश्लेषण में, "प्रतिदीप्ति तीव्रता" जबकि "उपचार निर्भर चर रहा हैईएनटी की स्थिति "और" समय "दो कारक हैं। अलग-अलग समय बिंदुओं पर आंकड़ों की तुलना करने के बजाय, दोहराया उपायों के साथ दो तरह से एनोवा पूरे समय के पाठ्यक्रम पर दो उपचार समूहों के बीच के अंतर का विश्लेषण करती है।

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Representative Results

एक स्थिर राज्य विश्लेषण में, microscopically दिखाई Atxn1 82Q-GFP परमाणु समुच्चय 30 में मनाया जा सकता है - हेला कोशिकाओं का 50% अभिकर्मक (चित्रा 1 ए) के बाद 20 घंटा। विरोधी GFP एंटीबॉडी का उपयोग एन एस और एस एस अंशों की पश्चिमी धब्बा विश्लेषण, 100 केडीए और 150 केडीए मार्करों के बीच Atxn1 82Q-GFP की एक अलग बैंड से पता चलता प्रोटीन की आणविक वजन (चित्रा 1 बी) के लिए इसी। Atxn1 82Q-GFP एसआर अंश में या तो फिल्टर मंदता परख द्वारा, या एसडीएस पृष्ठ और स्टैकिंग जेल (चित्रा 1 बी) के शीर्ष पर प्रजाति के रूप में पश्चिमी धब्बा से पता लगाया जा सकता है। ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग आधा जीवन विश्लेषण के लिए, CHX चेस प्रारंभिक अभिकर्मक के बाद 4-5 घंटा के शुरू होता है किसी भी बड़े परमाणु समुच्चय का गठन कर रहे हैं पहले। एसएस अंश में Atxn1 82Q-GFP के आधा जीवन एक मामूली या 16 घंटा (2A चित्रा) पर एन एस अंश में Atxn1 82Q-GFP की कोई कमी के विपरीत लगभग 5 घंटा है। degraAtxn1 82Q-GFP के फाउंडेशन आंशिक रूप से MG132 (2A चित्रा) के साथ कोशिकाओं के इलाज से हिचकते हैं। हम पहले से पता चला है कि पीएमएल उनकी sumoylation बढ़ावा देने के द्वारा misfolded प्रोटीन की गिरावट उत्तेजित करता है। यहाँ हम बदल गिरावट मार्ग का एक उदाहरण के रूप में पीएमएल पछाड़ना का उपयोग करें। पीएमएल siRNA उपचार एसएस अंश (2A चित्रा) में Atxn1 82Q-GFP के आधे जीवन लंबे समय तक। एसआर Atxn1 82Q-GFP में कोई स्पष्ट परिवर्तन नियंत्रण अथवा पीएमएल siRNA इलाज कोशिकाओं (चित्रा 2 बी और 2 सी) में पता चला रहे हैं।

अभिकर्मक के बाद बीस मानव संसाधन, एनएलएस LucDM-GFP समुच्चय में 5 microscopically दिखाई देने लगते हैं - हेला कोशिकाओं का 15% है, लेकिन इस डीएनए की मात्रा में है कि (चित्रा 3 ए) ट्रांसफ़ेक्ट हैं पर निर्भर करता है भिन्न हो सकते हैं। 3 घंटा (चित्रा 3 बी और 3 सी) - एसडीएस घुलनशील एनएलएस LucDM-GFP के आधे जीवन 2 है। ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति तीव्रता भी कम हो जाती है खत्मCHX उपचार (चित्रा -4 ए और 4 बी) पर समय। छह मानव संसाधन CHX उपचार के बाद, प्रतिदीप्ति तीव्रता एक स्थिर अवस्था तक पहुँचता है और बंद हो जाता है कम (चित्रा -4 ए और 4 बी)। एक ही समय बिंदु पर, घुलनशील एनएलएस LucDM-GFP सुझाव है कि शेष प्रतिदीप्ति गिरावट के लिए प्रतिरोधी एकत्रित प्रजातियों से उत्पन्न होता है, मोटे तौर पर अपमानित (चित्रा 3 बी और 3 सी) है। लगातार, एकत्रित, लेकिन नहीं दूर तक फैला हुआ, GFP CHX उपचार (चित्रा 4C) के बाद 9 घंटा कोशिकाओं में रहता है। दिलचस्प बात यह है एनएलएस LucDM-GFP प्लाज्मिड के एक उच्च राशि का उपयोग अभिकर्मक, और अधिक परमाणु समुच्चय के साथ ही शेष प्रतिदीप्ति के उच्च तीव्रता उत्पन्न करता है, हालांकि गिरावट की दर प्रभावित नहीं है (चित्रा -4 ए और 4 बी)। या तो एसडीएस पृष्ठ पश्चिमी धब्बा या प्रतिदीप्ति पढ़ने के बाद का उपयोग करना, हम MG132 उपचार या द्वारा एनएलएस LucDM-GFP गिरावट के निषेध का पता लगाने में सक्षम हैं पीएमएल siRNA (आंकड़े -3 सी, 4 ए, 4 बी, और 5)।

आकृति 1
चित्रा 1. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और डिटर्जेंट विभाजन से Atxn1 82Q-GFP की जांच। (ए) हेला कोशिकाओं Atxn1 82Q-GFP के साथ ट्रांसफ़ेक्ट और DAPI के साथ दाग रहे थे। व्यक्तिगत और मर्ज किए गए चित्र दिखाए जाते हैं। स्केल बार 10 माइक्रोन =। (बी) के प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में 2. आण्विक वजन मार्करों Atxn1-Atxn 82Q के पश्चिमी धब्बा छवियों की बाईं तरफ संकेत कर रहे हैं Atxn1-82Q कोशिकाओं को व्यक्त करने का डिटर्जेंट विभाजन दिखा एक चित्र। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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। (-) या पीएमएल siRNA (ए और सी) या संयुक्त राष्ट्र का इलाज (बी) चित्रा 2. Atxn1 82Q-GFP की गिरावट परख डिटर्जेंट विभाजन का उपयोग कर हेला कोशिकाओं पहले से नियंत्रण के साथ इलाज किया गया। प्रकोष्ठों Atxn1 82Q-GFP के साथ ट्रांसफ़ेक्ट और अभाव या MG132 की उपस्थिति में CHX के साथ इलाज किया गया। सेल lysate अंशों एसडीएस पृष्ठ पश्चिमी धब्बा (ए, एन एस और एस एस भागों के लिए) के बाद या फिल्टर मंदता परख (बी और सी, एसआर अंश के लिए) विरोधी GFP एंटीबॉडी का उपयोग करके विश्लेषण किया गया। का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा।

चित्र तीन
चित्रा 3. प्रतिदीप्ति माइकर द्वारा एनएलएस LucDM-GFP गिरावट का विश्लेषणएनएलएस LucDM-GFP के साथ ट्रांसफ़ेक्ट oscopy और पश्चिमी धब्बा। (ए) हेला कोशिकाओं DAPI के साथ दाग रहे थे। व्यक्तिगत और मर्ज किए गए चित्र दिखाए जाते हैं। स्केल बार = 25 माइक्रोन। Arrowhead परमाणु समुच्चय के साथ एक सेल इंगित करता है। (बी और सी) हेला कोशिकाओं एनएलएस LucDM-GFP और जंगली प्रकार luciferase संलयन प्रोटीन एनएलएस LucWT-GFP (बी) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे, या नियंत्रण या पीएमएल siRNA साथ ट्रांसफ़ेक्ट, एनएलएस LucDM-GFP के साथ अभिकर्मक (द्वारा पीछा किया सी)। संकेत के रूप में कोशिकाओं CHX और MG132 के साथ इलाज किया गया। पूरे सेल lysates पश्चिमी धब्बा विरोधी GFP एंटीबॉडी का उपयोग करके विश्लेषण किया गया। छवि अनुमति 9 के साथ पिछले प्रकाशन से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
एनएलएस LucDM-GFP गिरावट के लिए चित्रा 4. फ्लोरोसेंट microplate आधारित परख। हेला कोशिकाओं 96 अच्छी तरह से प्लेटों पर वरीयता प्राप्त 0.05 माइक्रोग्राम (ए) या ​​0.1 माइक्रोग्राम (बी और सी) एनएलएस LucDM-GFP के साथ ट्रांसफ़ेक्ट और CHX साथ इलाज किया गया उपस्थिति या MG132 के अभाव। (ए और बी) के कुओं की प्रतिदीप्ति तीव्रता (मानक विचलन ± मीन मूल्यों एन = 3) संकेत समय बिंदुओं पर मापा गया। बाईं तरफ पैनलों, मूल प्रतिदीप्ति पढ़ने दिखाने जबकि सही पर पैनल संबंधित उपचार समूहों में समय 0 पर मूल्यों रीडिंग के लिए सामान्यीकृत दिखा। साथ और MG132 बिना इलाज समूहों के बीच अंतर दोहराया उपायों के साथ दो तरह से एनोवा द्वारा विश्लेषण किया गया था। दो समूहों के बीच इलाज पी मूल्यों संकेत कर रहे हैं। (सी) वेल्स, पहले या 9 घंटा CHX उपचार के बाद जांच की गई, या CHX और MG132 उपचार के बाद प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप से। बेहतर उज्ज्वल एकत्रित एनएलसी-LucDM-GFP के साथ दोनों कोशिकाओं और मंद दूर तक फैला हुआ प्रोटीन के साथ उन लोगों को दिखाने के लिए, 1.5 के गामा मूल्य सभी छवियों के लिए लागू किया गया था। स्केल बार = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. एक पीएमएल पछाड़ना कोशिकाओं में एनएलएस LucDM-GFP की गिरावट की दर कम हो। हेला कोशिकाओं पहले से नियंत्रण के साथ इलाज या पीएमएल siRNA साथ 96 प्लेटों में वरीयता प्राप्त थे। एनएलएस LucDM-GFP की गिरावट चित्रा 4 में वर्णित के रूप में विश्लेषण किया गया था (दो तरह से एनोवा, पी <0.0001)। कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

54266 / 54266fig6.jpg "/>
चित्रा 6 Atxn1 82Q-GFP प्रतिदीप्ति CHX चेस अधिक अपरिवर्तित बनी हुई है। हेला कोशिकाओं Atxn1 82Q-GFP के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे। चित्रा 4 में वर्णित के रूप में 24 घंटा बाद अभिकर्मक, Atxn1 82Q-GFP की गिरावट विश्लेषण किया गया था। आंकड़ा मूल प्रतिदीप्ति पढ़ने से पता चलता। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
96 अच्छी तरह से प्लेटों पर वरीयता प्राप्त cytoplasmic LucDM-GFP। हेला कोशिकाओं के क्षरण के लिए चित्रा 7. फ्लोरोसेंट microplate आधारित परख 0.1 माइक्रोग्राम LucDM-GFP उपस्थिति या MG132 के अभाव में CHX के साथ इलाज के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे। चित्रा 4 में वर्णित के रूप में परिणाम का विश्लेषण किया गया (दो तरह से एनोवा, पी <0.0001)।टीपीएस: //www.jove.com/files/ftp_upload/54266/54266fig7large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

तालिका एक
तालिका 1 .: प्रतिदीप्ति microplate रीडर पर माप सेटिंग्स।

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Discussion

तंत्र है कि misfolded प्रोटीन की गिरावट को विनियमित सेलुलर प्रोटीन की homeostasis को बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं, और वे संभावना neurodegenerative विकारों और अन्य प्रोटीन misfolding रोगों के इलाज के लिए बहुमूल्य दवा लक्ष्यों प्रतिनिधित्व करते हैं। इधर, assays कि misfolded प्रोटीन की गिरावट की जांच वर्णित हैं, एक रोगजनक Atxn1 प्रोटीन (Atxn1 82Q) और एक परमाणु स्थानीय luciferase उत्परिवर्ती (एनएलएस LucDM) उदाहरण के रूप में इस्तेमाल करते हैं।

गिरावट Atxn1 82Q, जो 18 घंटा से अधिक एक आधा जीवन है की जांच करने के लिए, हम शास्त्रीय CHX 9 के साथ सेल विभाजन के संयोजन के द्वारा एक उपन्यास विधि की शुरुआत की। इस विधि में समय के साथ Atxn1 82Q के misfolded प्रजातियों में से एक बहुत जल्दी क्लीयरेंस का पता चला। इसके अलावा, LucDM की शुरूआत misfolded प्रोटीन की सामान्य गिरावट तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल misfolded सब्सट्रेट प्रदान करता है। स्तनधारी सेल में misfolded प्रोटीन गिरावट का पता लगाने के लिए एक एचटीएस प्रणाली के लिए जरूरत को संबोधित करने के लिएएस, हम LucDM प्रतिदीप्ति microplate रीडर का उपयोग करने के लिए एक तेजी से गिरावट परख विकसित की है। प्रणाली रासायनिक और आनुवंशिक स्क्रीन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में कार्य करता है।

Atxn1 82Q प्रोटीन एन एस, एस एस, और सेल lysates के एसआर भागों में मौजूद है। एसआर अंशों अभिकर्मक के बाद लंबे समय तक संस्कृति के दौरान तेजी से प्रचलित हो जाते हैं, सुझाव है कि इसे एक रूप है कि श्रद्धेय हो या अपमानित, जैसे, amyloid तंतु मुश्किल है में है। विषाक्त misfolded प्रजाति या समुच्चय है कि आसानी से प्रोटीन गिरावट रास्ते ब्लॉक कर सकते अपमानित नहीं किया जा सकता की पीढ़ी, अंतर्जात सेलुलर मशीनरी को नियंत्रित करने न्यायपालिका प्रोटीन 24, 25,26 के विश्लेषण बाधा। एसआर की एक बड़ी राशि के गठन से बचने के लिए, हम CHX का पीछा शुरू प्रारंभिक अभिकर्मक के बाद 4-5 घंटा। हमने पाया है कि इस सेलुलर स्थिति है कि एसएस अंश की गिरावट हो सकती है देरी के विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है। अभिकर्मक समय के अलावा, यह भी खत्म करने के लिए नहीं है महत्वपूर्णबहुत ही उच्च स्तर पर Atxn1 82Q प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं द्वारा whelm। नहीं या बहुत धीमी गति से गिरावट सभी भागों के लिए मनाया जाता है, Atxn1 82Q प्लाज्मिड की कम राशि अभिकर्मक के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। आदर्श रूप में, परख 12 घंटा के भीतर समाप्त किया जाना चाहिए के रूप में apoptotic कोशिकाओं इस समय बिंदु से परे देखा जाता है। चित्रा 2A में, नियंत्रण कक्षों में एसएस Atxn1 82 की राशि है कि 8 घंटे के रूप में के रूप में कम पीएमएल siRNA इलाज कोशिकाओं में से भिन्न हैं। सावधानी, अगर इलाज समूह में एक फर्क केवल 12 घंटा से परे मनाया जाता है लिया जाना है क्योंकि यह अन्य कारकों है कि प्रोटीन गिरावट सेल व्यवहार्यता के बजाय को प्रभावित की वजह से हो सकता है की जरूरत है।

एन एस Atxn1 82Q की तुलना में, Atxn1 82Q एसएस अंश में तेजी से समाप्त हो रहा है, यह दर्शाता है कि यह एक misfolded प्रजातियों है कि आसानी से एंटीबॉडी (2A चित्रा) द्वारा अपमानित किया जा सकता प्रतिनिधित्व करता है। इसके विपरीत, एसआर Atxn1 82Q के स्तर को एक ही समय कोर्स (चित्रा 2 बी) पर अपरिवर्तित रहते हैं, इस बात की पुष्टियह एक संयुक्त राष्ट्र सड़ सकने प्रजातियों है। फिर भी, एसआर अंश का विश्लेषण तंत्र है कि सीधे cytoplasmic समुच्चय (जैसे, भोजी) को हटा विश्लेषण करने के लिए महत्वपूर्ण होना चाहिए या इन समुच्चय के गठन को प्रभावित। ज़ाहिर, MG132 एसएस अंश में Atxn1 82Q कमी को रोकने में कम प्रभावी प्रतीत होता है। इस एंटीबॉडी निषेध 27 पर आरओएस स्तर है, जो Atxn1 82Q के एकत्रीकरण को बढ़ावा देने सकता है में ऊंचाई की वजह से हो सकता है।

LucDM-GFP परख का एक बड़ा लाभ यह है कि यह प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर का उपयोग एचटीएस विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। हम शुरू में Atxn1 82Q के लिए एक एचटीएस प्रणाली विकसित करने का प्रयास किया। हालांकि, क्योंकि केवल समग्र Atxn1 82Q प्रोटीन का एक छोटा सा अंश समय के साथ अपमानित किया जाता है, GFP-Atxn1 82Q कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति (चित्रा 6) CHX चेस के पाठ्यक्रम पर बड़े पैमाने पर अपरिवर्तित बनी हुई है। कुल मिलाकर लंबे समय तक आधा जीवन के साथ अन्य misfolded प्रोटीन वास्तविक समय स्त्राव के साथ इसी तरह की समस्याओं के लिए होता हैescent परख। इसके विपरीत, समग्र एनएलएस lucDM-GFP प्रोटीन की एक उल्लेखनीय कमी मनाया जाता है (आंकड़े 3 और 4)। यह सुविधा है, इसकी कम आधा जीवन (2-3 घंटा) के साथ एक साथ, इस मॉडल निगरानी सब्सट्रेट आसानी से प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा पता लगाया जा करने में सक्षम बनाता है। पिछले अध्ययनों में, GFPu, GFP प्रोटीन, एक रचनात्मक गिरावट के संकेत (सीएल -1) से जुड़े हुए व्यापक रूप से यूबीक्यूटिन-एंटीबॉडी प्रणाली 28,29 की कार्यक्षमता के लिए एक पत्रकार के रूप में नियोजित किया गया है। यह भी सेल और पशु मॉडल 30 में एक प्रमुख किराए की misfolded प्रोटीन होता है। GFPu की तुलना में, यहाँ वर्णित गिरावट परख में से एक लाभ यह है कि misfolded luciferase एक बड़े पैमाने पर इस्तेमाल मॉडल निगरानी सब्सट्रेट है। Luciferase गतिविधि की जांच करके, एक बड़ी आसानी से इन विट्रो में और vivo में luciferase की, देशी विकृत, और refolded रचना का आकलन कर सकते हैं। इस प्रकार, हमारी प्रणाली के साथ प्रोटीन बाध्यकारी और तह assays कनेक्ट करने के लिए एक बेहद उपयोगी मंच के रूप में कार्य करता हैसेलुलर गिरावट प्रणाली ही सब्सट्रेट 9 का उपयोग।

शुरू प्रतिदीप्ति तीव्रता, स्थिर शेष प्रतिदीप्ति तीव्रता, और प्रोटीन आधा जीवन: वास्तविक समय प्रतिदीप्ति माप निम्न मान प्राप्त किया जा सकता है के माध्यम से। इन मूल्यों का पीछा करने से पहले समग्र प्रोटीन की मात्रा, गिरावट के लिए प्रतिरोधी प्रोटीन की मात्रा, और प्रोटीन कारोबार की दर के साथ क्रमश: सहसंबद्ध होते हैं। इसलिए, यह स्तर और विभिन्न misfolded प्रोटीन प्रजातियों की गतिशीलता के लिए एक व्यापक विश्लेषण करने के लिए वास्तविक समय प्रतिदीप्ति परख का उपयोग करना संभव है। कभी कभी, प्रतिकृति के बीच शुरू प्रतिदीप्ति की एक अपेक्षाकृत बड़ी भिन्नता मनाया जाता है (जैसे, चित्रा 5, बाएं पैनल)। यह सेल बोने या अभिकर्मक में परिवर्तनशीलता की वजह से होने की संभावना है। हालांकि, शुरू प्रतिदीप्ति तीव्रता में अंतर के बावजूद, सभी प्रतिकृति के संकेत एक बहुत ही इसी दर पर चला जाता है। संकेतों को सामान्य बनाने इधर-उधरएम 0 समय पर तीव्रता करने के लिए हर बार अंक अच्छी तरह से करने के लिए अच्छी तरह से भिन्नता को कम और अधिक सही कर सकते हैं क्षरण दर (चित्रा -4 ए, 4 बी और चित्रा 5, बनाम सही पैनल छोड़ दिया है) को दर्शाता है।

परमाणु प्रपत्र के अलावा, हम भी cytoplasmic LucDM-GFP का विश्लेषण किया। Cytoplasmic LucDM-GFP को छोड़कर जब एक ही प्रयोगात्मक प्रक्रिया प्रोटोकॉल 4 (चित्रा 7) के रूप में वर्णित लागू किया गया था शेष प्रतिदीप्ति के उच्च प्रतिशत मनाया गया एक समान गिरावट पैटर्न है। गिरावट पूरी तरह से MG132 हिचकते जा सकता है, यह दर्शाता है इस परख proteasomal गिरावट के माध्यम से cytoplasmic प्रोटीन की गुणवत्ता नियंत्रण की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। भविष्य के अध्ययन के लिए, यह है कि क्या LucDM GFP, जब विशिष्ट सेलुलर डिब्बे स्थानीयकरण संकेतों से जुड़े हुए अन्य सेलुलर डिब्बों, जैसे, माइटोकॉन्ड्रिया या जालिका के लिए लागू किया जा सकता का पता लगाने के लिए दिलचस्प होगा।

के रूप में फ्लोरोसेंट आधारित परख के लिए प्रोटोकॉल में उल्लेख किया है, यह कम फ्लोरोसेंट माध्यम का उपयोग करने के लिए फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि को कम करने और डीएनए और अभिकर्मक अभिकर्मक के मास्टर मिश्रण का उपयोग करने के लिए अच्छी तरह से करने के लिए अच्छी तरह से अभिकर्मक भिन्नता को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। प्राप्त नियंत्रण कुछ फ्लोरोसेंट प्लेट पाठकों पर समायोजित किया जा सकता है। यह अनुकूलित करने के बजाय मैनुअल के लिए लाभ की स्थापना की और पूरे परख (तालिका 1) भर में एक ही मूल्य का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। लाभ का मूल्य सेलुलर GFP प्रतिदीप्ति से पढ़ने को अधिकतम करने के रूप में लंबे समय के रूप में पढ़ने का पता लगाने की सीमा से परे जाना नहीं है समायोजित किया जा सकता है।

मौजूदा स्तर पर, हम अभी भी LucDM व्यक्त करने के लिए अभिकर्मक पर भरोसा कर रहे हैं। भिन्नता को कम करने और एचटीएस के लिए परख को आसान बनाने के लिए, एक भविष्य के लक्ष्य LucDM की inducible अभिव्यक्ति के साथ एक स्थिर सेल लाइन स्थापित करने के लिए है। हालांकि, microplate और संस्कृति के माध्यम के रूप में दोनों पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति है, यह महत्वपूर्ण GFP संकेत पृष्ठभूमि की तुलना में काफी अधिक है। Unfortunately, स्थिर लाइनों हम हाल ही में स्थापित सभी LucDM की कम अभिव्यक्ति है। इस प्रकार, उच्च प्रोटीन अभिव्यक्ति के साथ एक स्थिर लाइन के विकास में काफी स्क्रीनिंग दक्षता में सुधार होगा।

गिरावट यहाँ वर्णित assays भी अन्य misfolded प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता है। misfolded प्रोटीन की गतिशील सुविधा के कारण, इन assays उजागर करने के लिए प्रोटीन की गुणवत्ता नियंत्रण का गहराई से विश्लेषण तंत्र अन्य के साथ मिलकर किया जा करने की जरूरत है। ये विश्लेषण स्थिर राज्य समुच्चय के विभिन्न भागों में सेल (चित्रा 1) के स्तर और उनके विभाजन को मापने और शुद्ध पुनः संयोजक प्रोटीन का उपयोग प्रोटीन तह या एकत्रीकरण का विश्लेषण करने में शामिल हैं। ये assays प्रोटीन गिरावट या एकत्रीकरण पर दवा या जीन अभिव्यक्ति की प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष प्रभाव भेद करने में मदद मिलेगी।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium Life Technologies 11995-092
Fetal Bovine Serum Life Technologies 10082147
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668019
NP-40 Sigma-Aldrich NP40S-500ML
SDS Sigma-Aldrich L3771
MG132 Sigma-Aldrich M8699
Cycloheximide Sigma-Aldrich C7698
Dithiothreitol (DTT) Fisher Scientific 45000232
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche Boehringer Mannheim 4693159001
Bio-Dot Apparatus  Bio-Rad 1706545
Living Colors GFP Monoclonal Antibody Clonetech 632375
Anti-Actin mAb Rabbit, IgG Sigma-Aldrich A45060-200UL
Amino acids Sigma-Aldrich Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium
Olympus IX-81  Inverted Fluorescence Microscope Olympus IX71/IX81
96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom Sigma-Greiner 89135-048
Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO TECAN Infinite 200® PRO
Cellulose acetate membrane 0.2 µm Sterlitech CA023001
Prism 5 GraphPad Statistical analysis software

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References

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 114 misfolded प्रोटीन प्रोटीन गिरावट प्रोटीन आधा जीवन Ataxin -1 luciferase डिटर्जेंट विभाजन फ्लोरोसेंट microplate परख
कोशिकाओं में misfolded प्रोटीन की गिरावट के लिए Assays
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Guo, L., Prall, W., Yang, X. Assays… More

Guo, L., Prall, W., Yang, X. Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells. J. Vis. Exp. (114), e54266, doi:10.3791/54266 (2016).

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