Introduction
Proteiner er de mest tallrike makromolekyler i cellene, og de spiller en viktig rolle i nesten alle biologiske prosesser. Den biologiske aktiviteten til de fleste proteiner krever deres bretting inn i, og opprettholder, de native tredimensjonale strukturer. Proteiner med avvikende conformations ikke bare miste sine normale funksjoner, men også ofte danner løselige oligomeric arter eller aggregater som svekker funksjonene til andre proteiner og er giftige for cellene 1,2. For å motvirke protein misfolding, celler benytter både molekylære anstand, som bistår brettede eller delvis foldet polypeptider å nå sitt opprinnelige eksteriør, og nedbrytningsmekanismer, som eliminerer misfoldede proteiner 3. På grunn av kompleksiteten og stokastiske natur av bretteprosessen, er protein misfolding uunngåelig, og det kan ikke reverseres i tilfelle av mutasjoner, biosyntetiske feil, og post-translasjonelle skader 1. Derfor celler slutt stole på degradation veier for å opprettholde sin proteinkvalitet.
Betydningen av celleprotein kvalitetskontroll (PQC) systemer er understreket av utbredelsen av protein-misfolding sykdommer, inkludert kreft, diabetes, og mange neurodegenerative lidelser så som Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, amyotrofisk lateral sklerose, Huntingtons sykdom (HD), og spinocerebellar ataksi (SCA) 4,5. For eksempel, mutasjoner i p53 tumor suppressor er den mest hyppig genetisk lesjon i tumorer, assosiert med ~ 50-70% av alle tilfellene 6. En betydelig fraksjon av p53-mutasjoner er missense mutasjoner som endrer konformasjonen av p53, som fører til dannelse av aggregater 7. Videre er proteiner med utvidede polyQ strekninger genetisk og patologisk forbundet med HD og SCA. Disse progressive og ofte fatale sykdommer åpenbar når lengden av polyQ strekk i de aktuelle proteinene overstiger en viss threshold, og blir stadig mer alvorlig som lengden av polyQ strekningen forlenger 8.
En attraktiv metode for behandling av disse sykdommene er til terapeutisk styrke cellulære PQC systemer, spesielt de degraderingsreaksjonsveier. Imidlertid, er involvert i nedbrytning av defekte proteiner, særlig de i pattedyrceller veier forblir dårlig forstått. Selv om det har vært kjent at proteosomet er kritisk viktig for nedbrytning av misfoldede proteiner, forblir en viktig sak udefinert: hvor misfolded proteiner er spesielt anerkjent og målrettet for degradering. Dessuten, selv om PQC systemer har blitt identifisert i cellulære inkludert i cytoplasma, det endoplasmatiske retikulum, og mitokondrie, PQC systemene i kjernen forblir uklare 2.
Nyere studier av vår lab har identifisert et system som gjenkjenner og forringer en rekke misfoldede proteiner i kjernenav pattedyrceller 9. Dette systemet består av promyelocytic protein (PML), en kjernefysisk protein og et medlem av den tredelte motiv holdige (TRIM) protein familie, og RNF4, en RING-domene som inneholder protein. PML, og flere andre TRIM proteiner, innehar SUMOs (liten ubiquitin-lignende modifiserende middel) E3-ligase aktivitet, noe som letter spesifisiteten og effektiviteten av protein SUMOylation 10. RNF4 tilhører en liten gruppe av SUMO-målrettet ubiquitin ligaser (Stubl), som inneholder en eller flere sumo-samspill motiver (SIMS) i tillegg til RING domenet som gir dem den ubiquitin ligase aktivitet 11. Vi fant ut at PML spesifikt gjenkjenner misfoldede proteiner gjennom diskrete substrat gjenkjenningsseter som kan skjelne forskjellige funksjoner på misfoldede proteiner. Ved binding, PML-koder misfoldede proteiner med poly-kjeder av SUMO2 / 3, to nesten identiske pattedyr SUMO proteiner som kan danne poly-kjedene på grunn av eksistensen av en intern SUMOylation nettstedet. SUMOylated misfoldede proteiner blir så gjenkjent av RNF4, noe som fører til deres ubiquitinering og proteasomal degradering. Vi videre vist at PML-RNF4 system er viktig for beskyttelse mot nevrodegenerasjon, som mangel på PML forverrer de atferdsmessige og nevropatologiske defekter i en musemodell for SCA type 1 (SCA1) 9.
For å skille protein degradering fra andre cellulære mekanismene som kan regulere proteinnivåer, ble satsene for protein omsetningen målt ni. Blant de mest brukte metoder for å bestemme protein omsetningen er puls jage og cycloheximide (CHX) jage. Disse to metoder undersøke over tid, henholdsvis de radioisotop-merkede proteiner av interesse i omregnings-dyktig celler og totalt antall forhåndseksisterende proteiner av interesse i omregnings-inhiberte celler. Imidlertid er en stor utfordring for å studere patogene og misfolding utsatt proteiner er at halveringstiden for disse proteinene kan være ekstremt long. For eksempel, Ataxin-en, Ataxin-7, huntingtin, α-synuclein, og TDP-43 har alle halveringstider på mer enn 12 til 24 timer 9,12-16. Den langsomme omsetning priser for disse proteinene utelukker bruk av den CHX chase analyse fordi celler som disse proteiner ikke kan overleve lengre tids oversettelse inhibering, spesielt fordi de misfoldede proteinene i seg selv kan være meget giftige for cellene. Pulsen-chase analyse med isotop merking kan også være utfordrende for proteiner som er svært aggregering utsatt. De fleste puls-chase assays er avhengige av immunopresipitering for å separere proteinet av interesse fra alle andre proteiner som også radioaktivt merkede. Denne prosedyren omfatter normalt lange immunoutfellingsstudier og vaskeprosedyrer, hvor SDS-uoppløselige aggregater kan dannes, noe som gjør analyse med SDS-PAGE elektroforese unøyaktig.
Her en protokoll for å analysere kjerne misfoldede proteiner med lav omløpshastighet er beskrevet 9. En patogene form av Ataxin-1 (Atxn1) som inneholder en strekning av 82 glutamines (Atxn1 82Q) er brukt til dette formålet 8. Når uttrykt i celler, en forbedret grønt fluorescerende protein (GFP) sammensmelting av Atxn1 82Q former mikroskopisk synlige inneslutninger i kjernen (figur 1A). Pulse jage analyse viser at halveringstiden for Ataxn1 82Q er over 18 timer 9. Atxn1 82Q er sammensatt av arter med misfoldede conformations av forskjellige egenskaper, samt arter med naturlig konformasjon. Det er sannsynlig at disse artene er degradert til ulike priser, og dermed bør analyseres separat. Lysates fra Atxn1 82Q-GFP-uttrykke celler blir fraksjonert i NP-40-oppløselig (løselig eller NS, sannsynligvis representerer innfødte proteiner eller misfoldede monomere / oligomere proteiner) og NP-40-uløselig (NI, aggregert / misfoldede) deler. Sistnevnte kan videre deles inn i SDS-oppløselig (SS; sannsynlig uordnede aggregater) eller SDS-resistente (SR, sannsynlige amyloidfibriler) Fraksjoner (figur 1B). NS og SS fraksjoner kan analyseres ved hjelp av SDS-PAGE etterfulgt av western-blotting, mens SR fraksjonen kan detekteres ved filter retardasjon analyser, etterfulgt av immunblotting. CHX chase er kombinert med vaskemiddel fraksjoneringsmetode, og oppdaget at halveringstiden til SS Atxn1 82Q er mye kortere enn for NS Atxn1 82Q og total Atxn1 82Q (figur 2A), som indikerer at SS fraksjonen lett kan gjenkjennes og nedbrytes i cellene 9. Således tilveiebringer denne fremgangsmåte et kraftig verktøy for å studere dynamikken i misfoldede proteiner og for å sammenligne deres degradering mønster.
Vi beskriver også en fremgangsmåte som er passende for høy kapasitets screening for å identifisere makromolekyler eller små forbindelser som kan modulere nedbrytningen av misfoldede proteiner. Denne metoden er basert på et konformasjonelt destabilisert mutant av ildflueluciferase (LucDM) 17, en modell anstand substrat. Vi har sikringd LucDM til et kjernefysiske lokalisering signal (NLS) til sondere PQC systemer i denne cellerommet, og GFP (NLS-LucDM-GFP) for bekvemmeligheten av gjenkjenning. NLS-LucDM-GFP former mikroskopisk synlige atomstørrelser i en liten prosentandel av celler (figur 3A). I likhet med Atxn1 82Q, NLS-LucDM-GFP-men ikke sin villtype motstykke NLS-LucWT-GFP-modifisert ved SUMO2 / 3 og regulert av PML-RNF4 vei 9. NLS-LucDM-GFP danner også SS og SR art, selv om de relative mengder av SS og SR arter er minimal i forhold til NS, ved bruk av betingelsene beskrevet i protokollen 3 nedenfor. For å forenkle analysen, vi bare analysere SDS løselig LucDM (inkludert både NS og SS fraksjoner) ved SDS-PAGE og western blot. Viktigere, CHX jage analyse viste at halveringstiden for SDS-oppløselig NLS-LucDM-GFP er mye kortere enn for dens villtype-motstykke (figur 3B), hvilket antyder at LucDM er et spesifikt substrat for det system som gjenkjenner og forringermisfoldede proteiner.
Nedbrytningen av LucDM-GFP fører til en betydelig nedgang i total fluorescens signal. Derfor har vi også utviklet en protokoll for sporing i sanntid av mobilnettet LucDM-GFP bruker mikro fluorescens-basert analysen. Mange high-throughput skjermen (HTS) systemer er utviklet for narkotika eller gener endrer cellulære aggregater og cellulære levedyktighet forårsaket av avvikende proteiner 18-20. Imidlertid er meget få HTSs spesielt utviklet for målretting mot nedbrytning i pattedyrceller. Denne protokollen tjener som et robust system for hurtig og stor-skala-analyse av virkningene av proteinekspresjon, knockdown, og medikamentbehandling på cellulær misfolded proteinnedbrytingen. Ved hjelp av HeLa-celler som eksempel, under vi beskriver protokollene for analyse av disse to misfoldede proteiner. Analysene kan også anvendes på andre cellelinjer, selv om transfeksjon forhold og tidsforløpet kan trenge å bli optimalisert for individuelle cellelinjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av Reagens
- Fremstille cellelyseringsbuffer (50 mM Tris, pH 8,8, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5% NP-40). Supplement 2 mM DTT, 1x komplett protease cocktail, og 250 IU / ml benzonase før bruk.
- Fremstille pellet-buffer (20 mM Tris, pH 8,0, 15 mM MgCl2). Supplement 2 mM DTT, 1x komplett protease cocktail og 250 IE / ml benzonase før bruk.
- Forbered 3x koke buffer (6% SDS, 20 mM Tris, pH 8,0). Supplement 150 mM DTT før bruk.
- Forbered lav-fluorescens DMEM medium for analyser ved hjelp av mikro fluorescens leser. Bland 25 mM glukose, 0,4 mM glysin, 0,4 mM arginin, 0,2 mM cystein, 4,0 mM glutamin, 0,2 mM histidin, 0,8 mM isoleucin, 0,8 mM leucin, 0,8 mM lysin, 0,2 mM metionin, 0,4 mM fenylalanin, 0,4 mM serin, 0,8 mM treonin, tryptofan 0,078 mM, 0,4 mM tyrosin, 0,8 mM valin, 1,8 mM CaCl2, 0,81 mM MgSO4, 5,33 mM KCl, 44,0 mM NaHCO3, 110 mM NaCl, 0,9 mMNaH 2 PO 4. Juster pH-verdien til løsningen ved bruk av HCl eller NaOH til pH 7,4. Steril mediet gjennom filtrering.
MERK: Dette medium inneholder komponenter i standard DMEM-medium med høy glukose med unntagelse av at Fe (NO 3) 3, vitaminer og fenolrødt er utelatt. Fenol rød, riboflavin og pyridoksal i regelmessig DMEM kulturmedium i betydelig grad interfererer med påvisning av fluorescens-signal 21. Kultur medium uten disse komponentene er avgjørende for vellykket levende celle GFP bildebehandling. Mediet er stabil for 12 måneder ved oppbevaring i kjøleskap.
2. Nedbrytning analysen av Atxn1 82Q GFP
- Plate ca. 3 x 10 5 HeLa-celler i 35 mm plater med DMEM-medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), slik at etter O / N dyrking av cellene vokse til en sammenfletting av 40-60% ved tidspunktet for transfeksjon.
MERK: antall plater som trengs er basert på antallet av tidspoeng og behandlinger described nedenfor. - Transfektere HeLa celler med 0,3 mikrogram Atxn1 82Q-GFP / pRK5 plasmid i hver brønn med transfeksjon reagens i henhold til produsentens instruksjoner 9. Lag en mester transfeksjon blanding som inneholder DNA og transfeksjon reagens og delmengde det for hver brønn.
- 4-5 timer etter transfeksjon, undersøke de levende cellene under en invertert fluorescerende mikroskop for GFP uttrykk med eksitasjon bølgelengde 450-490 nm. Returner cellene tilbake til inkubatoren etter bildebehandling.
MERK: Legg merke både diffust GFP signaler og små flekker av GFP signaler i kjernen på dette tidspunktet. - Fjern mediet ved hjelp av vakuum aspirasjon og tilsett 2 ml frisk DMEM inneholdende 50 ug / ml CHX. Behandle celler for 0, 4, 8, 12 og 16 timer med CHX før høsting. For å undersøke proteasomal degradering, omfatter proteasominhibitor MG132 (10 pM) i en plate ble behandlet i 16 timer som en kontroll.
- Høste en plate av celler ved hvert tidspunkt. Fjern mediet ved vakuumaspirasjon end vaskes platene to ganger med 3 ml iskald 1 x fosfatbufret saltvann (PBS). Snap-fryse plate på tørris.
- Etter det siste tidspunkt (16 timer), skrape de frosne celler (fra alle tidspunkter) i 150 mL iskald cellelyseringsbuffer og inkubert på is i 30 min.
- Sentrifuger cellelysatene i en bord- sentrifuge ved 17 000 xg i 15 min ved 4 ° C.
- Overfør supernatanten, som inneholder NP-40-oppløselige (NS) proteiner, til et annet rør ved hjelp av en pipette.
MERK: Bruk supernatanter for måling av proteinkonsentrasjonen ved Bradford assay hvis nødvendig. - Skyll pelletene ved forsiktig tilsetning av ca. 200 pl 1 x PBS til rørene uten å forstyrre pelleten. Fjern PBS nøye av vakuumavsugning eller pipette. Re-suspendere dem i 150 ul iskald cellepellet buffer, etterfulgt av 15-30 min inkubering på is.
MERK: Den resuspenderte pellet fraksjonen inneholder NP-40 uløselige (NI) proteiner. Se figur 1B for en diagram vaskemiddel fraksjonering. - Legg 75 ul 3x kokende buffer i NS fraksjoner og NP-40 uoppløselige (NI) fraksjoner fra resuspenderte pelletene. Varme opp prøvene ved 95 ° C på en varmeblokk i 5 minutter.
MERK: Klumper i NP-40 uløselige fraksjoner blir oppløst etter oppvarming og prøvene vil bli klart. - Legg SDS-gel lasting buffer til en delmengde av kokte NS og NI. Last tilsvarende volum av prøver samlet inn fra alle tidspunkter til SDS-PAGE gel. Volum lastet tilsvarer omtrent 20 pg av NS fra prøven tatt ved tid 0. MERK: NS, samt SDS-oppløselige (SS) protein fra NI fraksjon, kan løses ved hjelp av SDS-gel separering. I kontrast er SDS-resistente (SR) aggregater fra NI brøkdel fast i gel lasting brønner (figur 1B). For å forbedre western blot gjenkjenning, kan doble volumet av NI lastes.
- Oppdage NS og SS Atxn1 82Q-GFP ved western blot hjelp av anti-GFP antistoff og forbedret kjemiluminescens (ECL).
MERK: Atxn1 82Q i SS fraksjonen generelt mindre i forhold til NS brøk når du bruker denne protokollen. Lengre ECL eksponering er nødvendig for optimale signaler. - Undersøk SR Atxn1 82Q fra pelleten brøkdel av filter retardasjon analyser ved hjelp av en dot-blot apparat (figur 1B). Kort, sette opp en dot-blot apparat holder en 0,2 mikrometer celluloseacetat membran. Belastning 80-120 ul av kokt NI inn i hver brønn av dot-blot-apparat.
MERK: Siden bare små mengder av SR aggregater dannes i cellene, for dot blot-analyse, legger et volum av SR-fraksjon som er omtrent 10-15 ganger av volumet av NS-fraksjonen anvendt for Western blot-analyse.- Etter filtrering av prøvene gjennom membranen ved hjelp av vakuum, kan Atxn1 82Q-GFP aggregater fast på membranen påvises ved anti-GFP immunoblotting 9,12,22.
MERK: Se tidligere rapporter 9,12,22 for detaljert beskrivelse av filter retardasjon analysen. Dette trinnet er valgfrittfordi SR Atxn1 82Q er minimal i forhold til SS og NS fraksjoner etter den korte transfeksjon beskrevet i denne protokollen. I tillegg er innholdet av SR Atxn1 82Q hovedsak forblir den samme over CHX chase (figur 2B). Men det er likevel viktig å undersøke om de mengder av SS Atxn1 82Q påvirkes over tid for enhver behandling eller genuttrykk i innledende forsøk. SS proteinarter opphold i SDS-PAGE-gel lastende brønner kan påvises ved western blot. Imidlertid er denne metode mindre følsom og genererer flere variable resultater (figur 1B).
- Etter filtrering av prøvene gjennom membranen ved hjelp av vakuum, kan Atxn1 82Q-GFP aggregater fast på membranen påvises ved anti-GFP immunoblotting 9,12,22.
3. Nedbrytning analyse av NLS-luciferase-GFP Bruke SDS-PAGE og Western Blot
- Plate ca. 3 x 10 5 HeLa-celler i 35 mm plater med DMEM-medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS). Etter at O / N dyrkning, er en sammenfletting av 40-60% oppnådd ved transfeksjon. Antallet plater som trengs er basert på antallet tIME poeng og behandlinger beskrevet nedenfor.
- Transfektere HeLa celler med 1,0 mikrogram NLS-luciferase-GFP / pRK5 plasmid i hver brønn med transfeksjon reagens i henhold til produsentens instruksjoner 9. Lag en mester transfeksjon blanding som inneholder DNA og transfeksjon reagens for delmengde av hver brønn.
- Etter O / N transfeksjon (rundt 15 timer), undersøke de levende cellene under en invertert fluorescerende mikroskop for GFP uttrykk med eksitasjon bølgelengde 450-490 nm. Returner cellene tilbake til inkubatoren etter bildebehandling.
MERK: Diffust atom GFP signal kan observeres i de fleste av cellene (70%). En liten prosent (5%) av cellene har atom aggregater. - Fjern mediet ved hjelp av vakuum aspirasjon og tilsett 2 ml frisk DMEM inneholdende 50 ug / ml CHX. Unn celler for 0, 1,5, 3, 4,5 og 6 timer med CHX før høsting. For å undersøke proteasomal degradering, inkluderer ekstra proteasominhibitor MG132 (10 mm) i en plate behandlet for seks timer som kontroll.
- Høste en plate av celler ved hvert tidspunkt. Fjern mediet ved hjelp av vakuum avsugning og vaskes platene to ganger med 3 ml is-kald fosfat-bufret saltvann (PBS). Snap-fryse plate på tørris.
- Etter det siste tidspunkt (6 timer) er ferdig, celler frosset ved alle tidspunkter skrapes over i 150 mL iskald cellelyseringsbuffer og inkubert på is i 30 min.
- Legg SDS gel-ladningsbuffer til helcellelysater for en endelig konsentrasjon på 2% SDS og 50 mM DTT. Inkuber prøver på en varmeblokk ved 95 ° C i 5 min.
- Analyser NLS-luciferase-GFP ved SDS-PAGE og western blot ved anvendelse av anti-GFP-antistoff. Last tilsvarende volum av prøver samlet inn fra alle tidspunkter til SDS-PAGE gel. Volumet lastet tilsvarer omtrent 20 mikrogram av helcellelysater fra prøven tatt ved tid 0.
4. Sanntids Nedbrytning analyse av NLS-luciferase-GFP med fluoresens -mikroplateleser
- Seed ca. 1 x 10 4HeLa-celler i sort 96-brønners vevkulturplater med gjennomsiktig bunn. Etter at O / N dyrkning, er en sammenfletting av 50-70% oppnådd ved transfeksjon.
MERK: 60 ul medium inneholdende helt suspenderte HeLa-celler blir sådd direkte inn i hver brønn. Ikke legg til ekstra medium eller rock plate frem og tilbake etter såing, ellers celler kan distribueres ujevnt. - Transfektere HeLa celler med 0,05-0,1 mikrogram av NLS-luciferase-GFP / pRK5 plasmid 9 i hver brønn med transfeksjon reagens i henhold til produsentens anvisninger. Lag en mester transfeksjon blanding som inneholder DNA og transfeksjon reagens og delmengde det for hver brønn. Tre brønner med celler som ikke er transfektert med DNA, som tjener som styring for bakgrunnsfluorescens signal for hver behandling tilstand.
MERK: En alternativ måte å redusere transfeksjon variasjon er å transfektere celler før seeding. Imidlertid er en stor andel av celler transfektert med misfolded proteins ikke klarer å feste eller utvise redusert levedyktighet ved hjelp av denne metoden. Det er sannsynlig at noen celler ikke kan stå stress forårsaket av trypsin-spaltning når uttrykker toksiske misfoldede proteiner. Som et resultat blir den totale fluorescente signalet betydelig redusert. - 20-24 timer etter transfeksjon, undersøke de levende cellene under en invertert fluorescerende mikroskop for GFP uttrykk med eksitasjon bølgelengde 450-490 nm.
- Fjern mediet ved hjelp av vakuum aspirasjon. Tilsett ca 200 ul 1 x PBS til hver brønn og deretter aspirer det for å fjerne gjenværende mengde på DMEM-medium.
- Legg 60 mL av lav-fluorescens DMEM-medium med 5% FBS og 50 ug / ml CHX. For å undersøke proteasomal degradering, inneholde ytterligere proteasominhibitor MG132 (10 uM) i ett sett av prøver. Satt triplikat av brønner for hver behandling / tilstand.
MERK: MG132 behandling inngår som kontroller for proteasomal degradering fordi det er viktig å utelukke andre faktorer som kan forårsake dråpe fluorescence signal, inkludert celledød og fluorescens slukke. - Måle fluorescens-signalet av GFP umiddelbart på en fluorescerende plateavleseren etter tilsetning av CHX.
MERK: Programvaren måleinnstillinger er vist i tabell 1. - Avles platen hver time i opptil 8-10 timer. Etter å ha lest, returnere platen tilbake til cellekultur inkubator.
- Eksportere data som regneark. Bruk middelverdi av multi-leser for hver brønn som fluorescensintensitet. Normal verdiene for hvert datapunkt til gjennomsnittsverdiene i Time 0 i de respektive gruppene. Plotte den normaliserte fluorescens intensitet over tid, som vist i figur 4A og 4B, og figur 5, høyre panel.
- Utføre statistisk analyse av nedbrytningshastigheter mellom to forhold ved hjelp av to-veis ANOVA med repeterte målinger 23.
MERK: I denne analysen "fluorescens intensitet" er avhengig variabel, mens "treatmskjellige betingelser "og" tid ", er to faktorer. I stedet for å sammenligne data i de enkelte tidspunkter, to-veis ANOVA med gjentatte målinger analyserer forskjellen mellom de to behandlingsgruppene over hele tidsforløpet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I en stabil tilstand analyse, kan mikroskopisk synlige Atxn1 82Q-GFP nukleære aggregater holdes i 30 - 50% av HeLa-celler 20 timer etter transfeksjon (figur 1A). Western blot-analyse av NS og SS-fraksjoner under anvendelse av anti-GFP-antistoff viser et tydelig bånd av Atxn1 82Q-GFP mellom 100 kDa og 150 kDa markører, svarende til proteinets molekylvekt (figur 1B). Atxn1 82Q-GFP i SR fraksjonen kan påvises enten ved filter retardasjon analyse, eller ved SDS-PAGE og western blot som arter på toppen av stable gel (figur 1B). For halveringstid analyse ved hjelp av protokollen beskrevet ovenfor, starter CHX jage 4-5 timer etter første transfeksjon før noen store atom aggregater dannes. Halveringstiden av Atxn1 82Q-GFP i SS fraksjonen er rundt 5 timer, i motsetning til en liten eller ingen minskning av Atxn1 82Q-GFP i NS fraksjon i løpet av 16 timer (figur 2A). den Degravoll Atxn1 82Q-GFP er delvis hemmet ved å behandle celler med MG132 (figur 2A). Vi viste tidligere at PML stimulerer nedbrytningen av misfolded protein ved å fremme deres SUMOylation. Her bruker vi PML knockdown som et eksempel på endret nedbrytning veien. PML siRNA behandling forlenget halveringstid for Atxn1 82Q-GFP i SS fraksjon (figur 2A). Ingen åpenbare endringer i SR Atxn1 82Q-GFP er påvist i enten kontroll eller PML siRNA-behandlede celler (figur 2B og 2C).
Tyve timer etter transfeksjon, NLS-LucDM-GFP aggregater blir mikroskopisk synlig på 5 - 15% av HeLa-celler, men dette kan variere avhengig av mengdene av DNA som er transfektert (figur 3A). Halveringstiden av SDS oppløselig NLS-LucDM-GFP er 2 - 3 timer (figur 3B og 3C). Fluorescensintensiteten av transfekterte celler avtar også overtid etter CHX behandlingen (figur 4A og 4B). Seks timer etter CHX behandling, når fluorescensintensiteten en stabil scene og stopper nedad (figur 4A og 4B). På det samme tidspunkt, er oppløselig NLS-LucDM-GFP i stor grad degradert (figur 3B og 3C), noe som tyder på at den gjenværende fluorescens er generert fra aggregerte arter som er resistente mot degradering. Konsekvent, aggregert, men ikke sprer seg, forblir GFP i cellene 9 timer etter CHX behandling (Figur 4C). Interessant, transfeksjon ved anvendelse av en større mengde av NLS-LucDM-GFP plasmid genererer flere atom aggregater samt høyere intensitet av gjenværende fluorescens, selv om nedbrytningshastigheten ikke blir påvirket (figur 4A og 4B). Ved hjelp av enten SDS-PAGE etterfulgt av western blot eller fluorescens lesing, er vi i stand til å oppdage hemming av NLS-LucDM-GFP nedbrytning av MG132 behandling eller PML siRNA (Tall 3C, 4A, 4B, og 5).
Figur 1. Påvisning av Atxn1 82Q-GFP av fluorescerende mikroskopi og vaskemiddel fraksjonering. (A) HeLa-celler ble transfektert med Atxn1 82Q-GFP og farget med DAPI. Individuelle og flettede bildene blir vist. Scale bar = 10 mikrometer. (B) Et diagram som viser vaskemiddel fraksjonering av Atxn1-82Q uttrykke celler som beskrevet i protokollen 2. Molekylære vektmarkører vises på venstre side av vestlige blot bilder av Atxn1-Atxn 82Q. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet .
66 / 54266fig2.jpg "/>
. Figur 2. Nedbrytning analysen av Atxn1 82Q-GFP bruke vaskemiddel fraksjone HeLa-celler ble tidligere behandlet med kontroll (-) eller PML siRNA (A og C) eller ubehandlet (B). -Celler ble transfektert med Atxn1 82Q-GFP og behandlet med CHX i fravær eller nærvær av MG132. Cellelysat fraksjoner ble analysert ved SDS-PAGE etterfulgt av western blot (A, for NS og SS fraksjoner) eller filter retardasjon analyse (B og C, for SR fraksjon) ved hjelp av anti-GFP antistoff. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Analyse av NLS-LucDM-GFP nedbrytning av fluorescens microscopy og western blot. (A) HeLa celler transfektert med NLS-LucDM-GFP ble farget med DAPI. Individuelle og flettede bildene blir vist. Scale bar = 25 mikrometer. Arrowhead viser en celle med atom aggregater. (B og C) HeLa-celler ble transfektert med NLS-LucDM-GFP og villtype luciferase-fusjonsprotein NLS-LucWT-GFP (B), eller transfektert med kontroll eller PML siRNA, etterfulgt av transfeksjon med NLS-LucDM-GFP ( C). Celler ble behandlet med CHX og MG132 som angitt. Helcellelysater ble analysert ved western blot ved anvendelse av anti-GFP-antistoff. Bildet er endret fra forrige publisering med tillatelse 9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Fluorescent mikroplatebasert assay for NLS-LucDM-GFP degradering. HeLa-celler sådd ut på 96 brønners plater ble transfektert med 0,05 ug (A) eller 0,1 ug (B og C) NLS-LucDM-GFP og behandlet med CHX i tilstedeværelse eller fravær av MG132. (A og B) fluorescensstyrkene brønner ble målt ved de angitte tidspunkter (Middelverdier ± standardavvik, n = 3). Paneler på venstre viser opprinnelige fluorescens lesing, mens panelene til høyre viser verdiene normalisert til målinger ved tid 0 i de respektive behandlingsgruppene. Forskjellen mellom gruppene behandlet med og uten MG132 ble analysert ved to-veis ANOVA med gjentatte målinger. P-verdier mellom de to behandlingsgruppene er indikert. (C) Brønnene ble undersøkt før og etter 9 timer CHX behandling, eller etter CHX og MG132 behandling, ved fluorescens mikroskop. For å vise både celler med lyse aggregert NLC-LucDM-GFP og de med svak diffust protein bedre, ble gamma-verdi på 1,5 brukes på alle bildene. Scale bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. En redusert nedbrytningshastigheten for NLS-LucDM-GFP i PML knockdown celler. HeLa-celler som tidligere er behandlet med kontroll eller PML siRNA ble sådd på 96 brønners plater. Nedbrytning av NLS-LucDM-GFP ble analysert som beskrevet i figur 4 (to-veis ANOVA, p <0,0001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
54266 / 54266fig6.jpg "/>
Figur 6. Fluorescens av Atxn1 82Q-GFP forblir uendret over CHX jakten. HeLa-celler ble transfektert med Atxn1 82Q-GFP. 24 timer etter transfeksjon, nedbrytning av Atxn1 82Q-GFP ble analysert som beskrevet i Figur 4. Figuren viser den opprinnelige fluorescens lesing. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Fluorescent mikroplatebasert assay for nedbrytning av cytoplasmiske LucDM-GFP. HeLa-celler sådd på 96 brønners plater ble transfektert med 0,1 ug LucDM-GFP behandlet med CHX i nærvær eller fravær av MG132. Resultatene ble analysert som beskrevet i Figur 4 (to-veis ANOVA; p <0,0001).tps: //www.jove.com/files/ftp_upload/54266/54266fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1 .: Måling innstillinger på fluorescens mikroplateleser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mekanismer som regulerer nedbrytningen av misfoldede proteiner er viktig for å opprettholde homeostase av cellulære proteiner, og de sannsynligvis representerer verdifulle drug targets for behandling av neurodegenerative lidelser og andre protein-misfolding sykdommer. Her er analyser som undersøker nedbrytningen av misfoldede proteiner beskrevet, ved hjelp av en sykdomsfremkallende Atxn1 protein (Atxn1 82Q) og en kjernefysisk lokalisert luciferase mutant (NLS-LucDM) som eksempler.
For å undersøke degradering Atxn1 82Q, som har en halveringstid over 18 timer, innførte vi en ny metode ved å kombinere cellefraksjonering med klassisk CHX 9. Denne metoden viste en mye raskere klarering av misfoldede arter av Atxn1 82Q over tid. I tillegg innføring av LucDM gir en modell misfoldede substrat for å studere generelle nedbrytningsmekanismer misfoldede proteiner. For å møte behovet for en HTS-system for detektering av degradering misfolded protein i pattedyrcelles, har vi utviklet en rask degradering analysen for LucDM med fluorescens mikroplateleser. Systemet fungerer som et kraftig verktøy for kjemiske og genetiske skjermer.
Den Atxn1 82Q protein er til stede i NS, SS, og SR fraksjoner av cellelysatene. SR fraksjoner blitt stadig mer utbredt under langvarig kultur etter transfeksjon, noe som tyder på at det er i en form som er vanskelig å bli dyrket eller brytes ned, for eksempel, de amyloidfibriler. Utvikling av giftige misfoldede arter eller aggregater som ikke lett kan brytes ned kan blokkere proteinnedbrytningsbaner, som hindrer analyse av endogen cellulære maskineri styring avvikende proteiner 24, 25,26. For å unngå dannelse av en stor mengde SR, begynner vi CHX jage 4-5 timer etter første transfeksjon. Vi har funnet at dette er kritisk for analyse av cellulære forhold som kan forsinke nedbrytningen av SS fraksjon. I tillegg til transfeksjon tid, er det også viktig ikke å overwhelm celler ved å uttrykke Atxn1 82Q protein på svært høye nivåer. Dersom ingen eller meget langsom nedbryting er observert for alle fraksjonene, bør mindre mengde av Atxn1 82Q plasmid bli brukt for transfeksjon. Ideelt sett bør analysen være ferdig i løpet av 12 timer som apoptotiske celler blir lagt merke utover dette tidspunkt. I figur 2A er mengden av SS Atxn1 82 i kontrollcellene er påfallende forskjellig fra den i PML siRNA-behandlede celler så kort som 8 timer. Forsiktighet må tas hvis en forskjell i den behandlede gruppen er bare observert utover 12 timer, da det kan være forårsaket av andre faktorer som påvirker cellenes levedyktighet i stedet for protein degradering.
Sammenlignet med NS Atxn1 82Q, Atxn1 82Q i SS fraksjon utskilles raskt, noe som indikerer at den representerer en misfoldede art som lett kan nedbrytes av proteasomet (figur 2A). I motsetning til nivåene av SR Atxn1 82Q uendret sammenlignet med samme tid kurset (figur 2B), som bekrefterat det er en un-nedbrytbare arter. Likevel analyse av SR-fraksjon bør være viktig for å analysere mekanismer som direkte fjerner cytoplasmatiske aggregater (f.eks Autophagy) eller påvirke dannelsen av disse aggregater. Merkbart, synes MG132 å være mindre effektive i å forebygge Atxn1 82Q reduksjon i SS fraksjon. Dette kan være forårsaket av høyde i ROS-nivåer ved proteasomhemmingen 27, noe som kan fremme aggregering av Atxn1 82Q.
En stor fordel med LucDM-GFP-analysen er at det kan tilpasses til HTS-analyse ved bruk av fluorescens plateleser. Vi først forsøkt å utvikle et HTS system for Atxn1 82Q. Imidlertid, fordi bare en liten brøkdel av den samlede Atxn1 82Q protein blir degradert over tid, forblir fluorescens av celler som uttrykker GFP-Atxn1 82Q stort sett uendret i løpet av CHX chase (figur 6). Andre misfoldede proteiner med samlet lang halveringstid vil ha lignende problemer med sanntid fluorescent analysen. I motsetning til dette, er en markert reduksjon av den totale NLS-lucDM-GFP-protein observert (figur 3 og 4). Dette trekk, sammen med sin korte halveringstid (2-3 timer), gir denne modellen anstand substrat som lett kan detekteres ved fluorescens-spektroskopi. I tidligere studier, GFPu, GFP protein fusjonert til en konstruktiv degradering signal (CL-1), har vært mye benyttet som reporter for funksjonaliteten til ubiquitin-proteasome system 28,29. Det er også en fremtredende surrogat misfolded protein i celle og dyremodeller 30. Sammenlignet med GFPu, en fordel av degradering analysen som er beskrevet her er at misfolded luciferase er en mye brukt modell anstand substrat. Ved å undersøke luciferase aktivitet, kan man enkelt vurdere de innfødte, denaturert, og refoldede conformations av luciferase in vitro og in vivo. Dermed fungerer systemet som en svært nyttig plattform for å koble proteinbinding og sammenleggbare analyser medcellulær nedbrytning system som bruker det samme substratet 9.
Gjennom sanntid fluorescens måling følgende verdier kan fås: Start fluorescens intensitet, stabil værende fluorescens intensitet, og protein halveringstid. Disse verdier er korrelert med henholdsvis med mengden av samlet protein før chase, mengden av proteiner som er resistente mot degradering, og hastigheten av protein omsetning. Derfor er det mulig å benytte sanntids-fluorescens-analyse for å gjøre en omfattende analyse av de nivåer og dynamikken i forskjellige misfoldede proteinarter. Av og til blir en forholdsvis stor variasjon av utgangs fluorescens blant replikater observert (for eksempel figur 5, venstre panel). Det er sannsynlig å være forårsaket av variasjon i celle seeding eller transfeksjon. Men til tross for forskjellen i utgangs fluorescensintensitet, signalet av alle replikater faller på en svært tilsvarende frekvens. Normalisering av signaler from hver gang peker på intensiteten på tidspunkt 0 kan redusere vel å bra variasjon og mer nøyaktig gjengivelse av nedbrytningshastigheter (Figur 4A, 4B og Figur 5, venstre kontra høyre panel).
I tillegg til kjernefysisk form, vi også analysert cytoplasma LucDM-GFP. Cytoplasmatiske LucDM-GFP har en lignende degradering mønster med unntak ble observert høyere prosentandel av gjenværende fluorescens når den samme eksperimentelle prosedyre ble påført som beskrevet i protokoll 4 (figur 7). Nedbrytningen kunne inhiberes fullstendig MG132, noe som indikerer denne analysen kan brukes til å overvåke cytoplasmatisk protein kvalitetskontroll gjennom proteasomal degradering. For fremtidige studier, ville det være interessant å undersøke om LucDM-GFP kan brukes på andre cellulære avdelinger, for eksempel, mitokondrier eller endoplasmatiske retikulum, da smeltet til spesifikke cellerommet lokaliseringssignaler.
Som nevnt i protokollen for fluorescent-baserte analysen, er det viktig å benytte lav-fluorescerende medium for å redusere bakgrunn og fluorescerende å bruke konsentrat-blanding av DNA og transfeksjon reagens for å redusere brønn-til-brønn transfeksjon variasjon. Gevinsten kontroll kan justeres på noen fluorescerende plate lesere. Det er viktig å innstille forsterkningen til manuell stedet for optimalisert og bruke den samme verdi gjennom hele analysen (tabell 1). Verdien av gevinsten kan justeres for å maksimalisere avlesningen fra den cellulære GFP fluorescens så lenge lese ikke går utover påvisningsgrensen.
På det nåværende tidspunkt, er vi fortsatt avhengig av transfeksjon å uttrykke LucDM. For å redusere variasjon og forenkle analysen for HTS, er et fremtidig mål å etablere en stabil cellelinje med induserbar uttrykk for LucDM. Imidlertid, som mikroplate og kulturmedium har begge bakgrunnsfluorescens, er det avgjørende å ha GFP signal signifikant høyere enn bakgrunnen. UnforVerre de stabile linjer vi etablerte nylig alle har lav uttrykk for LucDM. Således vil utviklingen av en stabil linje med høyere protein-ekspresjon betydelig bedre sileeffektiviteten.
Nedbrytningen testene beskrevet her kan også anvendes for andre misfoldede proteiner. På grunn av den dynamiske funksjon av misfoldede proteiner, disse analysene må være kombinert med andre analyser for å avdekke den detaljerte mekanismene for protein kvalitetskontroller. Disse analysene omfatter måling av steady-state nivåer av aggregater og deres skillevegger i forskjellige cellefraksjoner (figur 1), og analyse av proteiner folding eller aggregering ved hjelp av rensede rekombinante proteiner. Disse analysene vil bidra til å skille direkte eller indirekte effekter av narkotika eller genekspresjon på protein degradering eller aggregering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M8699 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | 45000232 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Boehringer Mannheim | 4693159001 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Living Colors GFP Monoclonal Antibody | Clonetech | 632375 | |
| Anti-Actin mAb Rabbit, IgG | Sigma-Aldrich | A45060-200UL | |
| Amino acids | Sigma-Aldrich | Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium | |
| Olympus IX-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX71/IX81 | |
| 96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom | Sigma-Greiner | 89135-048 | |
| Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO | TECAN | Infinite 200® PRO | |
| Cellulose acetate membrane 0.2 µm | Sterlitech | CA023001 | |
| Prism 5 | GraphPad | Statistical analysis software |
References
- Dobson, C. M.
- Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
- Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H.
- Selkoe, D. J.
- Vousden, K. H., Prives, C. Blinded by the Light: The Growing Complexity of p53. Cell. 137, 413-431 (2009).
- Xu, J., et al. Gain of function of mutant p53 by coaggregation with multiple tumor suppressors. Nat Chem Biol. 7, 285-295 (2011).
- Orr, H. T., Zoghbi, H. Y.
- Guo, L., et al. A cellular system that degrades misfolded proteins and protects against neurodegeneration. Mol Cell. 55, 15-30 (2014).
- Chu, Y., Yang, X. SUMO E3 ligase activity of TRIM proteins. Oncogene. 30, 1108-1116 (2011).
- Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins. EMBO J. 26, 4102-4112 (2007).
- Janer, A., et al. PML clastosomes prevent nuclear accumulation of mutant ataxin-7 and other polyglutamine proteins. J Cell Biol. 174, 65-76 (2006).
- Bauer, P. O., et al. Harnessing chaperone-mediated autophagy for the selective degradation of mutant huntingtin protein. Nat Biotechnol. 28, 256-263 (2010).
- Austin, J. A., et al. Disease causing mutants of TDP-43 nucleic acid binding domains are resistant to aggregation and have increased stability and half-life. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 4309-4314 (2014).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nat Chem Biol. 10, 677-685 (2014).
- Paxinou, E., et al. Induction of alpha-synuclein aggregation by intracellular nitrative insult. J Neurosci. 21, 8053-8061 (2001).
- Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nat Methods. 8, 879-884 (2011).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313, 324-328 (2006).
- Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466, 1069-1075 (2010).
- Fortini, M. E., Bonini, N. M. Modeling human neurodegenerative diseases in Drosophila: on a wing and a prayer. Trends Genet. 16, 161-167 (2000).
- Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. Anti-fading media for live cell GFP imaging. PLoS One. 7, (2012).
- Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
- McDonald, J. H. Handbook of Biological Statistics. 3, 3rd, 173-179 (2014).
- Holmberg, C. I., Staniszewski, K. E., Mensah, K. N., Matouschek, A., Morimoto, R. I. Inefficient degradation of truncated polyglutamine proteins by the proteasome. EMBO J. 23, 4307-4318 (2004).
- Verhoef, L. G., Lindsten, K., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. Aggregate formation inhibits proteasomal degradation of polyglutamine proteins. Human molecular genetics. 11, 2689-2700 (2002).
- Jana, N. R., Zemskov, E. A., Wang, G., Nukina, N. Altered proteasomal function due to the expression of polyglutamine-expanded truncated N-terminal huntingtin induces apoptosis by caspase activation through mitochondrial cytochrome c release. Human molecular genetics. 10, 1049-1059 (2001).
- Fribley, A., Zeng, Q., Wang, C. Y. Proteasome inhibitor PS-341 induces apoptosis through induction of endoplasmic reticulum stress-reactive oxygen species in head and neck squamous cell carcinoma cells. Molecular and cellular biology. 24, 9695-9704 (2004).
- Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
- Chen, Q., et al. Intrasarcoplasmic amyloidosis impairs proteolytic function of proteasomes in cardiomyocytes by compromising substrate uptake. Circulation research. 97, 1018-1026 (2005).
- Link, C. D., et al. Conversion of green fluorescent protein into a toxic, aggregation-prone protein by C-terminal addition of a short peptide. The Journal of biological chemistry. 281, 1808-1816 (2006).
