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Biology

Os ensaios para a degradação de proteínas em células deformadas

Published: August 28, 2016 doi: 10.3791/54266
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Department of Cancer Biology, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 2Department of Systems Pharmacology and Translational Therapeutics, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

Introduction

As proteínas são as macromoléculas mais abundantes nas células, e que desempenham um papel essencial em praticamente todos os processos biológicos. A actividade biológica da maioria das proteínas requer a sua dobragem em, e manter, as estruturas tridimensionais nativas. Proteínas com conformações aberrantes não só perder as suas funções normais, mas também frequentemente formar espécies oligoméricas solúveis ou agregados que prejudicam as funções de outras proteínas e que são tóxicos para as células 1,2. Para contrariar misfolding proteína, as células empregam ambos os chaperones moleculares, que ajudam polipeptídeos desdobradas ou parcialmente dobradas para chegar a sua conformação nativa e vias de degradação, o que elimina proteínas deformadas 3. Dada a complexidade e natureza estocástica do processo de dobramento, proteína misfolding é inevitável, e não pode ser revertida no caso de mutações, erros biossintéticos, e danos pós-traducionais 1. Assim, em última análise, as células dependem de degradatvias de íons para manter a sua qualidade de proteína.

A importância do controlo de qualidade de proteínas celulares (PQC) sistemas é sublinhada pela prevalência de doenças misfolding de proteínas, incluindo cancro, diabetes, e várias doenças neurodegenerativas, tais como doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, doença de Huntington (HD), e ataxias espinocerebelares (SCA) 4,5. Por exemplo, as mutações no gene supressor tumoral p53 é a única lesão genética mais frequentemente em tumores, associada a ~ 50-70% de todos os casos 6. Uma fração substancial das mutações de p53 são Mutações que alteram a conformação da p53, levando à formação de agregados 7. Além disso, proteínas com trechos poliQ expandidas são geneticamente e patologicamente associado com HD e SCA. Estas doenças progressivas e muitas vezes fatais manifesta quando o comprimento do troço poliQ nas proteínas afectados excede um determinado thressegurar, e torna-se cada vez mais grave quanto o comprimento do troço poliQ prolonga 8.

Uma abordagem atraente para o tratamento destas doenças é reforçar terapeuticamente sistemas PQC celulares, especialmente as vias de degradação. No entanto, as vias envolvidas na degradação de proteínas defeituosas, particularmente aqueles em células de mamíferos, permanecem pouco compreendidos. Apesar de ter sido reconhecido que o proteassoma é criticamente importante para a degradação de proteínas deformadas, um problema fundamental permanece indefinido: como proteínas deformadas são especificamente reconhecidos e direccionado para a degradação. Além disso, embora os sistemas de PQC foram identificados em compartimentos celulares, incluindo o citoplasma, retículo endoplasmático, e a mitocôndria, os sistemas de PQC no núcleo permanecem obscuros 2.

Estudos recentes do nosso laboratório identificaram um sistema que reconhece e degrada a uma variedade de proteínas mal enroladas no núcleocélulas de mamíferos 9. Este sistema é constituído por a proteína promielocítica (PML), uma proteína nuclear e um membro da família de proteínas contendo o motivo tripartida (TRIM), e RNF4, um anel-domínio contendo proteína. PML, e várias outras proteínas guarnição, possuem SUMO (pequeno modificador ubiquitina-like) atividade ligase E3, o que facilita a especificidade e eficiência de SUMOilação proteína 10. RNF4 pertence a um pequeno grupo de ubiquitina ligases-alvo SUMO (Stubl), que contêm um ou mais motivos interactuantes de sumo (SIMs), para além do domínio RING que lhes proporciona a actividade de ubiquitina-ligase 11. Descobrimos que PML reconhece especificamente proteínas deformadas através de sites de reconhecimento do substrato discretos que podem discernir características distintas em proteínas deformadas. Após a ligação, as etiquetas PML misfolded proteínas com poli-cadeias de SUMO2 / 3, duas proteínas de mamífero SUMO praticamente idênticos que podem formar poli-cadeias, devido à existência de um local de SUMOilação interna. Sproteínas deformadas UMOylated são depois reconhecidos por RNF4, o que leva a sua degradação e ubiquitinação proteossoma. Demonstramos ainda que o sistema de PML-RNF4 é importante para a protecção contra a neurodegeneração, como deficiência de PML exacerba os defeitos comportamentais e neuropatológicas de um modelo de rato do tipo 1 SCA (SCA1) 9.

Para distinguir a degradação da proteína a partir de outros mecanismos celulares que podem regular os níveis de proteína, as taxas de turnover de proteína foi medida 9. Entre os métodos mais frequentemente utilizados para determinar o volume de negócios proteínas são perseguição de pulso e cicloheximida (CHX) perseguição. Estes dois métodos examinar ao longo do tempo, respectivamente, as proteínas marcadas com radioisótopos de interesse em células-tradução eficiente e proteínas totais preexistentes de interesse em células-tradução inibido. No entanto, um grande desafio para o estudo de proteínas patogénicas e enrolamento incorrecto propensa é que a semi-vida dessas proteínas podem ser extremamente eisng. Por exemplo, Ataxina-1, Ataxina-7, Huntingtina, α-sinucleína, e TDP-43 têm meias-vidas de mais de 12 a 24 horas 9,12-16. As taxas de rotação lenta destas proteínas impede o uso da análise CHX perseguição, porque as células que albergam estas proteínas não podem sobreviver inibição de tradução prolongada, especialmente porque as proteínas mal enroladas podem eles mesmos serem altamente tóxicas para as células. A análise pulse-chase com marcação isotópica também pode ser um desafio para as proteínas que são altamente agregação-prone. A maioria dos ensaios de pulse-chase confiar em imunoprecipitação para separar a proteína de interesse a partir de todas as outras proteínas que também são marcados radioactivamente. Este procedimento normalmente inclui imunoprecipitação e lavagem de procedimentos morosos, durante os quais os agregados SDS-insolúveis podem formar, fazer a análise com eletroforese SDS-PAGE impreciso.

Aqui um protocolo para analisar proteínas deformadas nucleares com uma taxa de rotatividade lenta é descrito 9. A forma patogénica da Ataxina-1 (Atxn1) que contém um trecho de 82 glutaminas (Atxn1 82Q) é usado para este propósito 8. Quando expresso em células, uma proteína fluorescente (GFP) de fusão de verde melhorada Atxn1 82Q formas microscopicamente inclusões visíveis no núcleo (Figura 1A). Análise de pesquisa por pulso revela que a meia-vida de Ataxn1 82Q é mais de 18 horas 9. Atxn1 82Q é composto por espécies com conformações mal dobradas de características diferentes, bem como espécies com conformação nativa. É provável que estas espécies são degradadas a velocidades diferentes e, assim, devem ser analisados ​​separadamente. Os lisados ​​de Atxn1-82Q-GFP expressando células são fraccionados em NP-40-solúvel (solúveis ou NS, provavelmente representando proteínas nativas ou proteínas monoméricas / oligomérico misfolded) e (NI, agregado / misfolded) porções de NP-40 insolúvel. Este último pode ser dividido em SDS-solúvel (SS; prováveis ​​agregados desordenadas) ou SDS-resistente (SR; fibrilas amilóides prováveisFracções) (Figura 1B). fracções NS e SS pode ser analisada por SDS-PAGE seguida por transferência de Western, enquanto que a fracção SR pode ser detectada por ensaios de retardamento do filtro, seguido de imunotransf erência. CHX perseguição é combinada com o método de fraccionamento de detergente, e descobriram que a sua meia-vida de SS Atxn1 82Q é muito mais curto do que o de NS Atxn1 82Q total e Atxn1 82Q (Figura 2A), indicando que a fracção SS pode ser facilmente reconhecido e degradado nas células 9. Assim, este método proporciona uma poderosa ferramenta para estudar a dinâmica das proteínas deformadas e para comparar o seu padrão de degradação.

Também descrevemos um método que é adequado para o rastreio de elevado rendimento para identificar pequenas macromoléculas ou compostos que podem modular a degradação de proteínas mal enroladas. Este método baseia-se um mutante conformacionalmente desestabilizado de luciferase de pirilampo (LucDM) 17, um substrato modelo de chaperona. Temos fusíveld LucDM para um sinal de localização nuclear (NLS) para sondar os sistemas PQC neste compartimento celular, e GFP (NLS-GFP-LucDM) para facilidade de detecção. Formas NLS-LucDM-GFP microscopicamente agregados nucleares visíveis em uma pequena porcentagem de células (Figura 3A). Semelhante a Atxn1 82Q, NLS-LucDM-GFP, mas não o seu tipo selvagem homólogo NLS-LucWT-GFP-se modificado por SUMO2 / 3 e regulamentada pela via PML-RNF4 9. -NLS-GFP LucDM também forma SS e SR espécies, embora as quantidades relativas de SS e SR espécies são mínimas em relação ao NS, utilizando as condições descritas no Protocolo 3 abaixo. Para simplificar o ensaio, só analisar SDS LucDM solúveis (incluindo ambas as fracções NS e SS) através de SDS-PAGE e Western blot. Importante, ensaio de perseguição CHX mostraram que a semi-vida de SDS-solúvel NLS-LucDM-GFP é muito mais curto do que o do seu tipo selvagem correspondente (Figura 3B), sugerindo que LucDM é um substrato específico para o sistema que reconhece e se degradaproteínas deformadas.

A degradação de LucDM-GFP provoca uma queda significativa em geral do sinal de fluorescência. Assim, desenvolvemos também um protocolo para a detecção em tempo real de LucDM-GFP celular utilizando um ensaio baseado em fluorescência de microplacas. Muitos sistemas de tela de alto rendimento (HTS) são desenvolvidos para drogas ou genes modificadores agregados celulares e viabilidade celular causadas por proteínas aberrantes 18-20. No entanto, muito poucas HTSS são especificamente concebidos para direccionar a degradação em células de mamífero. Este protocolo serve como um sistema robusto para a análise de grande escala rápida e de os efeitos da expressão da proteína, knockdown, e tratamento com drogas sobre a degradação da proteína com enrolamento incorrecto celular. Usando células HeLa como exemplo, a seguir descrevem-se os protocolos para a análise das duas proteínas mal enroladas. Os ensaios também podem ser aplicados a outras linhas de células, embora as condições de transfecção e decurso de tempo pode necessitar de ser optimizado para as linhas de células individuais.

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Protocol

1. Preparação do Reagente

  1. Preparar tampão de lise celular (Tris 50 mM, pH 8,8, NaCl 100 mM, MgCl 2 5, 0,5% de NP-40). Suplemento de DTT 2 mM, 1x cocktail de protease completo, e 250 UI / ml benzonase antes da utilização.
  2. Preparar tampão de ressuspensão (Tris 20 mM, pH 8,0, 15 mM MgCl2). Suplemento de DTT 2 mM, 1x cocktail de protease completo e 250 UI / ml benzonase antes da utilização.
  3. Preparar tampão de ebulição 3x (6% de SDS, Tris a 20 mM, pH 8,0). Suplemento DTT 150 mM antes do uso.
  4. Prepare meio DMEM de baixa fluorescência para ensaios utilizando leitor de microplacas de fluorescência. Misturar de glucose 25 mM, glicina 0,4 mM, arginina 0,4 mM, cisteína 0,2 mM, glutamina 4,0 mM, histidina 0,2 mM, isoleucina 0,8 mM, leucina 0,8 mM, lisina 0,8 mM, metionina a 0,2 mM, fenilalanina 0,4 mM, serina 0,4 mM, 0,8 treonina mM, 0,078 mM de triptofano, tirosina 0,4 mM, 0,8 mM de valina, 1,8 mM CaCl 2, 0,81 mM de MgSO4, 5,33 mM de KCl, 44,0 mM de NaHCO3, NaCl 110 mM, 0,9 mMNaH 2 PO 4. Ajustar o pH da solução usando HCl ou NaOH para um pH de 7,4. Esterilizar o meio através de filtração.
    NOTA: Este meio contém os componentes do meio DMEM com elevado teor de glucose padrão, excepto que o Fe (NO 3) 3, vitaminas e Vermelho de Fenol são omitidos. Vermelho de Fenol, riboflavina e piridoxal no meio de cultura DMEM regular, interferir significativamente com a detecção do sinal de fluorescência 21. O meio de cultura sem esses componentes é crucial para a imagem latente GFP células vivas bem sucedido. O meio é estável durante 12 meses quando armazenado refrigerado.

Ensaio 2. A degradação do Atxn1 82Q GFP

  1. Placa de aproximadamente 3 x 10 5 células HeLa em placas de 35 mm com meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), de modo que depois de o / n a cultura de células crescer até uma confluência de 40-60% no tempo de transfecção.
    NOTA: O número de placas é necessário com base no número de pontos de tempo e tratamentos described abaixo.
  2. Transfectar células HeLa com 0,3 ug do plasmídeo Atxn1 82Q-GFP / pRK5 em cada poço utilizando o reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante 9. Faça uma mistura mestre de transfecção contendo DNA e transfecção de reagentes e alíquota lo para cada poço.
  3. 4-5 horas pós transfecção, examinar as células vivas sob um microscópio de fluorescência invertido para a expressão GFP com excitação comprimento de onda 450-490 nm. Retorno células de volta para incubadora depois de imagem.
    NOTA: Observe os sinais GFP difusos e pequenas manchas de sinais de GFP em núcleo neste momento.
  4. Remover o meio por aspiração a vácuo e adicionar 2 ml de DMEM fresco contendo 50 ng / ml CHX. Tratar as células durante 0, 4, 8, 12 e 16 horas com CHX antes da colheita. Para examinar a degradação proteossómica, incluem inibidor de proteassoma MG132 (10 uM) em uma placa tratada durante 16 horas como controlo.
  5. Colher uma placa de células em cada ponto de tempo. Remover o meio pelo vácuo de aspiração umad lavar as placas duas vezes com 3 ml de fosfato de 1x gelada solução salina tamponada (PBS). Snap-congelar a placa em gelo seco.
  6. Após o último ponto de tempo (16 horas), raspar as células congeladas (a partir de todos os pontos de tempo) em 150 ul de tampão de lise das células em gelo e incubou-se em gelo durante 30 min.
  7. Centrifugar os lisados ​​de células em uma centrífuga de bancada a 17000 xg durante 15 min a 4 ° C.
  8. Transferir o sobrenadante, que contém as proteínas NP-40-solúveis (NS), para outro tubo, usando uma pipeta.
    NOTA: Use sobrenadante para medir concentrações de proteína pelo ensaio de Bradford, se necessário.
  9. Lavar os sedimentos suavemente adicionando cerca de 200 ul de 1x PBS para os tubos sem perturbar os sedimentos. Remova cuidadosamente PBS por aspiração a vácuo ou pipeta. Re-suspender-los em 150 de tampão de ressuspensão de células gelada ul, seguido por 15-30 min de incubação em gelo.
    NOTA: A fração de sedimento ressuspenso contém NP-40 proteínas insolúveis (NI). Ver Figura 1B para um diagram de fracionamento detergente.
  10. Adicionar 75 ul de tampão de ebulição 3x em fracções e NS-40 NP fracções insolúveis (NI) foram ressuspensas a partir dos sedimentos. Aquecer as amostras a 95 ° C num bloco de aquecimento durante 5 min.
    NOTA: Tufos nas frações insolúveis NP-40 são dissolvidos após o aquecimento e as amostras se tornará claro.
  11. Adicionar tampão de carregamento de gel de SDS para uma aliquota de NS cozidos e Ni. Carga igual volume de amostras colhidas a partir de todos os pontos de tempo para gel de SDS-PAGE. O volume carregado corresponde a cerca de 20 ug de NS de amostra recolhida ao tempo 0. NOTA: NS, bem como de proteína SDS-solúvel (SS) de NI facção, podem ser resolvidas por SDS gel de separação. Em contraste, resistente SDS (SR) agregados de fração NI estão presos nos poços de carregamento de gel (Figura 1B). Para melhorar a detecção de western blot, o dobro do volume da NI pode ser carregado.
  12. Detectar NS e SS Atxn1 82Q-GFP por Western blot utilizando anticorpo anti-GFP e quimioluminescência aumentada (ECL).
    NOTA: Atxn1 82Q na fração SS é geralmente menor em comparação com a fração NS ao usar este protocolo. Uma exposição mais longa de ECL é necessário para sinais ideais.
  13. Examinar SR Atxn1 82Q a partir da fracção sedimento por ensaios de retardamento de filtro utilizando um aparelho de dot-blot (Figura 1B). Resumidamente, configurar um aparelho de dot-blot segurando uma membrana de acetato de celulose de 0,2 um. Carregar 80-120 ul de NI fervido em cada poço do aparelho de dot-blot.
    NOTA: Como são formados apenas pequenas quantidades de agregados SR em células, para o ensaio de dot blot, carregar um volume da fracção SR que é cerca de 10-15 vezes o volume da fracção do NS utilizado para análise de Western blot.
    1. Após filtração das amostras através da membrana por meio de vácuo, agregados Atxn1 82Q-GFP preso na membrana pode ser detectada por imunotransferência anti-GFP 9,12,22.
      NOTA: Ver relatórios anteriores 9,12,22 para uma descrição detalhada de ensaio retardo filtro. Este passo é opcionalporque SR Atxn1 82Q é mínima em comparação com SS e NS fracções seguintes a curto transfecção descrito neste protocolo. Além disso, os níveis de SR Atxn1 82Q manter-se o mesmo ao longo CHX perseguição (Figura 2B). No entanto, ainda é crucial para examinar se as quantidades de SS Atxn1 82Q são afetados ao longo do tempo para qualquer tratamento medicamentoso ou a expressão do gene em experiências iniciais. espécies de proteínas SS ficar em poços de carregamento de gel de SDS-PAGE podem ser detectadas através de Western blot. No entanto, este método é menos sensível e gera mais resultados variáveis ​​(Figura 1B).

3. Ensaio de Degradação-NLS-GFP da luciferase utilizando SDS-PAGE e Western Blot

  1. Placa de aproximadamente 3 x 10 5 células HeLa em placas de 35 mm com meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS). Depois de O / N a cultura, uma confluência de 40-60% é atingido no tempo de transfecção. O número de pratos necessários baseia-se no número de tOs pontos ime e tratamentos descritos abaixo.
  2. Transfectar células HeLa com 1,0 ug-NLS-GFP de luciferase / pRK5 plasmídeo para cada poço utilizando o reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante 9. Adicione uma mistura principal contendo a transfecção de ADN e o reagente de transfecção para aliquota de cada poço.
  3. Após O transfecção / N (cerca de 15 horas), examine as células vivas sob um microscópio de fluorescência invertido para a expressão GFP com excitação comprimento de onda 450-490 nm. Retorno células de volta para incubadora depois de imagem.
    NOTA: Difusa sinal GFP nuclear pode ser observado na maioria das células (70%). Uma pequena percentagem (5%) de células têm agregados nucleares.
  4. Remover o meio por aspiração a vácuo e adicionar 2 ml de DMEM fresco contendo 50 ng / ml CHX. Tratar células durante 0, 1,5, 3, 4,5 e 6 horas com CHX antes da colheita. Para examinar a degradação proteossómica, incluem inibidor de proteassoma MG132 adicional (10 uM) em uma placa tratada durante 6 horas como controlo.
  5. Colher uma placa de células em cada ponto de tempo. Remover o meio por aspiração e lava-se as placas duas vezes com 3 ml de fosfato gelada solução salina tamponada (PBS). Snap-congelar a placa em gelo seco.
  6. Após o último ponto de tempo (6 h) for concluída, as células congeladas a todos os tempos pontos são raspadas para 150 ul de tampão de lise celular em gelo e incubado em gelo durante 30 min.
  7. Adicionar tampão de SDS-gel de carregamento para os lisados ​​de células inteiras para uma concentração final de 2% de SDS e 50 mM de DTT. Incubar as amostras em um bloco de calor a 95 ° C durante 5 min.
  8. Analisar-NLS-GFP da luciferase por SDS-PAGE e transferência de Western utilizando anticorpo anti-GFP. Carga igual volume de amostras colhidas a partir de todos os pontos de tempo para gel de SDS-PAGE. O volume carregado corresponde a cerca de 20 mg de lisados ​​de células inteiras a partir de amostras coletadas no tempo 0.

4. em tempo real Degradação Ensaio de luciferase NLS-GFP por fluorescência Leitor de Microplacas

  1. Semente de cerca de 1 x 10 4células HeLa em preto placas de 96 poços de cultura de tecidos com fundo transparente. Depois de O / N a cultura, uma confluência de 50-70% é atingido no tempo de transfecção.
    NOTA: 60 ul de meio contendo células HeLa completamente suspensas são semeadas directamente em cada poço. Não adicione médio ou rocha adicional placa frente e para trás após a semeadura, caso contrário, as células podem ser distribuídos de forma desigual.
  2. Transfectar células HeLa com 0,05-0,1 ug de NLS-GFP-luciferase / pRK5 plasmídeo 9 em cada poço utilizando o reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante. Faça uma mistura mestre de transfecção contendo DNA e transfecção de reagentes e alíquota lo para cada poço. Três poços com células não são transfectadas com o ADN, que serve como controlo para o sinal de fundo de fluorescência para cada condição de tratamento.
    NOTA: Um modo alternativo para reduzir a variação de transfecção é para transfectar células antes da semeadura. No entanto, uma grande parte das células transf ectadas com a proteína mal dobradas deixar de anexar ou mostrar a viabilidade reduzida utilizando este método. É provável que algumas células podem não resistir ao stress causado por digestão com tripsina, quando expressando proteínas deformadas tóxicos. Como resultado, o sinal de fluorescência total é significativamente reduzida.
  3. 20-24 hr após a transfecção, examinar as células vivas sob um microscópio de fluorescência invertido para a expressão GFP com excitação comprimento de onda 450-490 nm.
  4. Remover o meio por aspiração a vácuo. Adicionar aproximadamente 200 ul de 1x PBS a cada poço e depois aspirar-lo para remover quantidade residual de meio DMEM.
  5. Adicionar 60 ul de meio DMEM de baixa fluorescência com 5% de FBS e 50 ng / ml CHX. Para examinar a degradação proteossómica, incluem MG132 inibidor do proteassoma adicional (10? M) em um conjunto de amostras. Definir triplicado de poços para cada tratamento / condição.
    NOTA: O tratamento MG132 é incluído como controles para a degradação proteossómica porque é crucial para descartar outros fatores que podem causar queda de fluosinal rescência, incluindo a morte celular e extinção de fluorescência.
  6. Medir o sinal de fluorescência da GFP imediatamente num leitor de placas de fluorescência após a adição de CHX.
    NOTA: As configurações de medição de software são mostrados na Tabela 1.
  7. Leia a placa a cada hora para um máximo de 8-10 h. Após a leitura, volte a placa de volta para incubadora de cultura de células.
  8. Exportar os dados como arquivo de planilha. Use valor médio de várias leituras para cada bem como a intensidade de fluorescência. Normalizar os valores de cada ponto de dados para os valores médios do tempo 0 nos respectivos grupos. Traça-se a intensidade de fluorescência ao longo do tempo normalizado como se mostra na Figura 4A e 4B, e Figura 5, painéis direitos.
  9. Realizar a análise estatística das taxas de degradação entre duas condições usando ANOVA de duas vias com medidas repetidas 23.
    NOTA: Nesta análise, "a intensidade de fluorescência" é a variável dependente, enquanto "treatmcondições ENT "e" tempo "são os dois factores. Em vez de comparar os dados a pontos de tempo individuais, ANOVA de duas vias com medidas repetidas analisa a diferença entre os dois grupos de tratamento ao longo de todo o curso do tempo.

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Representative Results

Numa análise de estado estacionário, agregados nucleares microscopicamente visíveis Atxn1 82Q-GFP pode ser observado em 30-50% das células HeLa de 20 h após a transfecção (Figura 1A). A análise Western blot das fracções NS e SS utilizando anticorpo anti-GFP mostra uma banda distinta de Atxn1 82Q-GFP entre 100 kDa e 150 kDa marcadores, o que corresponde ao peso molecular da proteína (Figura 1B). Atxn1 82Q-GFP na fracção SR pode ser detectada quer por ensaio de retardo de filtro, ou através de SDS-PAGE e western blot quanto espécies no topo do gel de empilhamento (Figura 1B). Para a análise semi-vida utilizando o protocolo descrito acima, CHX perseguição começa 4-5 h após a transfecção inicial antes de quaisquer agregados grandes nucleares são formadas. A meia-vida de Atxn1 82Q-GFP na fracção SS é de cerca de 5 horas, em contraste com uma ligeira ou nenhuma redução de Atxn1 82Q-GFP na fracção NS mais de 16 h (Figura 2A). o degradação de Atxn1 82Q-GFP é parcialmente inibida pelo tratamento das células com MG132 (Figura 2A). Nós já mostrou que PML estimula a degradação de proteínas misfolded, promovendo a sua SUMOilação. Aqui usamos PML knockdown como um exemplo de via de degradação alterada. PML siARN tratamento prolongou a semi-vida de Atxn1 82Q-GFP na fracção SS (Figura 2A). Não ocorreram alterações óbvias na SR Atxn1 82Q-GFP são detectados em qualquer células tratadas com siRNA PML (Figura 2B e 2C) de controle ou.

Vinte horas após a transfecção, os agregados NLS-GFP LucDM-se tornar visível ao microscópio em 5-15% de células HeLa, mas este pode variar dependendo das quantidades de ADN que estão transfectadas (Figura 3A). A meia-vida de SDS solúvel NLS-GFP-LucDM é 2-3 horas (Figura 3B e 3C). A intensidade de fluorescência das células transf ectadas também diminui ao longotempo após tratamento CHX (Figura 4A e 4B). Seis horas após o tratamento CHX, a intensidade de fluorescência atingir um estado estável e pára decrescente (Figura 4A e 4B). Ao mesmo ponto de tempo, solúvel NLS-GFP-LucDM é amplamente degradado (Figura 3B e 3C), sugerindo que a fluorescência remanescente é gerado a partir de espécies agregadas resistentes à degradação. Consistentemente, agregado, mas não difusa, permanece GFP em células de 9 horas após o tratamento CHX (Figura 4C). Curiosamente, a transfecção usando uma quantidade maior do plasmídeo-NLS-GFP LucDM gera agregados mais nucleares, assim como uma maior intensidade de fluorescência remanescente, embora a taxa de degradação não é afectada (Figura 4A e 4B). Utilizando qualquer um dos SDS-PAGE seguido por Western blot ou leitura de fluorescência, que são capazes de detectar a inibição da degradação-NLS-GFP LucDM por tratamento ou MG132 PML siRNA (Figuras 3C, 4A, 4B e 5).

figura 1
Figura 1. Detecção de Atxn1 82Q-GFP por microscopia fluorescente e fraccionamento detergente. (A) As células HeLa foram transfectadas com Atxn1 82Q-GFP e corados com DAPI. imagens individuais e integradas são mostradas. Barra de escala = 10 mm. (B) Um diagrama que mostra o fracionamento de detergente de Atxn1-82Q células que expressam como descrito no protocolo 2. marcadores de peso molecular estão indicados à esquerda de imagens de Western blot de Atxn1-ATXn 82Q. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura .

66 / 54266fig2.jpg "/>
. Figura 2. ensaio de degradação de Atxn1 82Q-GFP utilizando detergente fraccionamento células HeLa foram previamente tratados com controlo (-) ou siARN LMP (A e C) ou não-tratada (B). As células foram transfectadas com Atxn1 82Q-GFP e tratada com CHX na ausência ou na presença de MG132. Frações lisado celular foram analisadas por SDS-PAGE seguido por western blot (A, para as frações NS e SS) ou um ensaio retardo de filtro (B e C, para a fração SR) utilizando anticorpo anti-GFP. Por favor clique aqui para ver uma versão maior esta figura.

Figura 3
Figura 3. Análise de degradação-NLS-GFP LucDM por fluorescência MICRAs células HeLa (A) oscopy e Western Blot. transfectadas com NLS-LucDM-GFP foram coradas com DAPI. imagens individuais e integradas são mostradas. Barra de escala = 25 um. Arrowhead indica uma célula com agregados nucleares. Células (B e C) HeLa foram transfectadas com NLS-LucDM-GFP e a proteína de fusão de luciferase de tipo selvagem NLS-LucWT-GFP (B), ou transf ectadas com o controlo ou LMP siRNA, seguida por transfecção com NLS-LucDM-GFP ( C). As células foram tratadas com CHX e MG132 como indicado. Os lisados ​​celulares totais foram analisados ​​por Western blot utilizando anticorpo anti-GFP. Imagem é modificada a partir da publicação anterior com permissão 9. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Ensaio em microplacas fluorescente por degradação-NLS-GFP LucDM. Células HeLa semeadas em placas de 96 poços foram transfectadas com 0,05 ug (A) ou 0,1 ug (B e C) NLS-GFP-LucDM e tratada com CHX na presença ou ausência de MG132. (A e B) intensidades de fluorescência das cavidades foram medidos a pontos de tempo indicados (valores médios ± desvio padrão, n = 3). Os painéis da esquerda mostram a leitura de fluorescência inicial, enquanto que os painéis à direita mostram os valores normalizados para leituras no tempo 0 nos respectivos grupos de tratamento. A diferença entre os grupos tratados com e sem MG132 foi analisada por ANOVA de duas vias com medidas repetidas. Os valores de p entre os dois grupos de tratamento estão indicadas. (C) Os poços foram examinados antes ou após o tratamento CHX nove horas, ou após CHX e MG132 tratamento, por microscópio de fluorescência. Para mostrar melhor as duas células com brilhante agregada NLC-LucDM-GFP e aqueles com proteína difusa dim, valor gama de 1,5 foi aplicada a todas as imagens. Barra de escala = 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. A velocidade de degradação de NLS-GFP-LucDM reduzida em células de PML knockdown. Células HeLa previamente tratados com controlo ou ARNsi PML foram semeadas em placas de 96 poços. Degradação de NLS-LucDM-GFP foi analisada como descrito na Figura 4 (two-way ANOVA; p <0,0001). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6. A fluorescência de Atxn1 82Q-GFP permanece inalterada ao longo perseguição CHX. Células HeLa foram transfectadas com Atxn1 82Q-GFP. 24 horas após a transfecção, a degradação da Atxn1 82Q-GFP foi analisada como descrito na Figura 4. A figura mostra a leitura de fluorescência originais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7
Figura 7. ensaio baseado em microplacas fluorescente por degradação de células HeLa LucDM-GFP. Citoplasmáticos semeadas em placas de 96 poços foram transfectadas com 0,1 ug LucDM-GFP tratados com CHX na presença ou ausência de MG132. Os resultados foram analisados ​​como descrito na Figura 4 (two-way ANOVA, p <0,0001).tps: //www.jove.com/files/ftp_upload/54266/54266fig7large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

tabela 1
Tabela 1 .: ponto de medição no leitor de fluorescência de microplacas.

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Discussion

Os mecanismos que regulam a degradação de proteínas mal dobradas são essenciais para a manutenção da homeostase de proteínas celulares, e que provavelmente representam alvos de medicamentos valiosos para o tratamento de doenças neurodegenerativas e outras doenças misfolding-proteína. Aqui, os ensaios que examinam a degradação de proteínas mal dobradas são descritos, utilizando uma proteína patogénica Atxn1 (Atxn1 82Q) e um mutante nuclear localizada luciferase (NLS-LucDM) como exemplos.

Para examinar a degradação Atxn1 82Q, que tem uma meia-vida de mais de 18 horas, nós introduzimos um novo método através da combinação de fracionamento celular com CHX clássica 9. Este método revelou uma folga muito mais rápido das espécies mal dobradas de Atxn1 82Q ao longo do tempo. Além disso, a introdução de LucDM fornece um modelo misfolded substrato para estudar os mecanismos gerais de degradação de proteínas mal enroladas. Para satisfazer a necessidade de um sistema de HTS para detectar a degradação da proteína com enrolamento incorrecto em células de mamífeross, foi desenvolvido um ensaio de degradação rápida para LucDM usando leitor de microplacas de fluorescência. O sistema serve como uma ferramenta poderosa para telas químicos e genéticos.

A proteína Atxn1 82Q está presente em NS, SS e SR fracções de lisados ​​de células. As fracções SR tornar-se cada vez mais predominante durante a cultura prolongada após a transfecção, o que sugere que se trata de uma forma que é difícil de ser respeitado ou degradado, por exemplo, as fibrilas de amiloide. A geração de espécies mal dobradas tóxicos ou agregados que não pode ser facilmente degradado pode bloquear as vias de degradação da proteína, impedindo a análise da maquinaria celular endógeno controlar proteínas aberrantes 24, 25,26. Para evitar a formação de uma grande quantidade de SR, começamos CHX perseguição 4-5 hr após transfecção inicial. Verificou-se que esta é crítica para a análise das condições celulares que possam atrasar a degradação da fracção SS. Além do tempo de transfecção, é também crucial para não sobrewhelm células expressando a proteína Atxn1 82Q em níveis muito elevados. Se nenhum ou muito lenta degradação foi observado para todas as fracções, menos quantidade de plasmídeo Atxn1 82Q deve ser utilizado para a transfecção. Idealmente, o ensaio deve ser concluído dentro de 12 horas de células em apoptose são observados para além deste ponto do tempo. Na Figura 2A, a quantidade de SS Atxn1 82 em células de controlo é notavelmente diferente do que em células tratadas com siRNA PML tão curtos quanto 8 h. Cuidado deve ser tomado se uma diferença no grupo tratado apenas é observado para além de 12 h, como ela pode ser causada por outros factores que afectam a viabilidade das células, em vez de degradação de proteínas.

Em comparação com NS Atxn1 82Q, 82Q Atxn1 na fracção SS é rapidamente eliminado, o que indica que representa um espécies mal dobradas que podem ser facilmente degradados pelo proteassoma (Figura 2A). Em contraste, os níveis de SR Atxn1 82Q permanecem inalteradas ao longo do mesmo curso de tempo (Figura 2B), confirmandoque é uma espécie não-degradáveis. Contudo, a análise da fracção RS deve ser importante para analisar os mecanismos que remove os agregados citoplasmáticos directamente (por exemplo, autophagy) ou afectam a formação destes agregados. Visivelmente, MG132 parece ser menos eficaz na prevenção Atxn1 82Q diminuição da fração de SS. Isto pode ser causado por elevação dos níveis de ROS sobre a inibição do proteassoma 27, o que poderia promover a agregação de Atxn1 82Q.

Uma grande vantagem do ensaio LucDM-GFP é que ele pode ser adaptado para análises de HTS usando leitor de placas de fluorescência. Inicialmente tentaram desenvolver um sistema de HTS para Atxn1 82Q. No entanto, porque apenas uma pequena fracção da proteína total Atxn1 82Q se degrada ao longo do tempo, a fluorescência das células expressando GFP-Atxn1 82Q permanece praticamente inalterada ao longo de perseguição CHX (Figura 6). Outras proteínas deformadas com uma meia-vida longa geral teria problemas similares com flúor em tempo realensaio escent. Em contraste, uma diminuição acentuada da proteína global-NLS-GFP é lucDM observadas (Figuras 3 e 4). Esta característica, juntamente com a sua meia-vida curta (2-3 horas), permite que este substrato chaperona modelo a ser prontamente detectado por espectroscopia de fluorescência. Em estudos anteriores, a proteína GFPu, GFP fundida com um sinal de degradação construtiva (CL-1), tem sido amplamente utilizada como um repórter para a funcionalidade do sistema ubiquitina-proteassoma 28,29. É também uma proteína com enrolamento incorrecto substituto proeminente em modelos celulares e animais 30. Em comparação com GFPu, uma vantagem do ensaio de degradação é descrito aqui que a luciferase mal dobrada é um substrato modelo chaperona utilizada extensivamente. Ao examinar a actividade da luciferase, pode-se facilmente avaliar as conformações nativas, desnaturadas, e redobradas da luciferase in vitro e in vivo. Assim, o nosso sistema serve como uma plataforma altamente útil para ligar a proteína de ligação e ensaios de dobragem comsistema de degradação celular utilizando o mesmo substrato 9.

Através da medição de fluorescência em tempo real os valores seguintes podem ser obtidos: A intensidade de fluorescência inicial, permanecendo estável intensidade de fluorescência, e meia-vida da proteína. Estes valores estão correlacionados respectivamente com a quantidade de proteína total antes de perseguição, a quantidade de proteínas resistentes à degradação, e a taxa de retorno da proteína. Portanto, é possível usar o ensaio de fluorescência em tempo real para fazer uma análise abrangente dos níveis e dinâmicas de diferentes espécies de proteínas deformadas. Ocasionalmente, uma relativamente grande variação da fluorescência entre as repetições de partida é observada (por exemplo, Figura 5, painel esquerdo). Isto é susceptível de ser causada por variabilidade na semeadura célula ou transfecção. No entanto, apesar da diferença na intensidade de fluorescência inicial, o sinal de todas as repetições gotas a uma taxa muito semelhante. Normalização dos sinais from cada vez que aponta para a intensidade no tempo 0 pode reduzir a variação poço-a-poço e com mais precisão reflete a taxa de degradação (Figura 4a, 4b e a Figura 5, para a esquerda em relação aos painéis da direita).

Em adição à forma nuclear, citoplasmática também analisados ​​LucDM-GFP. Citoplasmática LucDM-GFP tem um padrão de degradação semelhantes, exceto foi observada maior percentual restante de fluorescência quando o mesmo procedimento experimental foi aplicado como descrito no Protocolo 4 (Figura 7). A degradação podia ser completamente inibida MG132, indicando que este ensaio pode ser utilizado para monitorizar o controlo da qualidade da proteína citoplasmática através da degradação proteossoma. Para estudos futuros, seria interessante para explorar se LucDM-GFP pode ser aplicado a outros compartimentos celulares, por exemplo, mitocôndrias ou retículo endoplasmático, quando fundido com sinais específicos de localização compartimento celular.

Como foi observado no protocolo para o ensaio fluorescente à base, é crucial para usar o meio fluorescente de baixo para reduzir o fundo fluorescente e usar mistura principal de ADN de transfecção e reagente de transfecção para reduzir a variação poço-a-poço. O controlo de ganho pode ser ajustado em alguns leitores de placas fluorescentes. É importante ajustar o ganho para o manual, em vez de optimizado e utilizar o mesmo valor durante todo o ensaio (Tabela 1). O valor do ganho pode ser ajustado para maximizar a leitura da fluorescência de GFP celular, desde que a leitura não excede o limite de detecção.

Na fase actual, ainda estamos contando com transfecção expressar LucDM. Para reduzir a variação e simplificar o ensaio para HTS, uma meta para o futuro é o de estabelecer um linha de células estável com expressão indutível de LucDM. No entanto, como microplaca e meio de cultura ambos têm a fluorescência de fundo, é crucial ter sinal de GFP significativamente mais elevada do que o fundo. UnforInfeliz-, as linhas estáveis ​​que estabelecemos recentemente todos têm baixa expressão de LucDM. Assim, o desenvolvimento de uma linha estável com a expressão de proteína mais elevado irá melhorar significativamente a eficiência de triagem.

Os ensaios de degradação descritos aqui também podem ser aplicados a outras proteínas mal enroladas. Devido à característica dinâmica de proteínas deformadas, estes ensaios têm de ser conjugada com outras análises para descobrir os mecanismos em profundidade dos controles de qualidade da proteína. Estas análises incluem a medição dos níveis de steady state de agregados e suas partições em frações celulares diferentes (Figura 1) e análise de proteínas dobráveis ​​ou agregação utilizando proteínas recombinantes purificadas. Estes ensaios irão ajudar a distinguir os efeitos diretos ou indiretos de droga ou expressão gênica sobre a degradação de proteínas ou agregação.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium Life Technologies 11995-092
Fetal Bovine Serum Life Technologies 10082147
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668019
NP-40 Sigma-Aldrich NP40S-500ML
SDS Sigma-Aldrich L3771
MG132 Sigma-Aldrich M8699
Cycloheximide Sigma-Aldrich C7698
Dithiothreitol (DTT) Fisher Scientific 45000232
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche Boehringer Mannheim 4693159001
Bio-Dot Apparatus  Bio-Rad 1706545
Living Colors GFP Monoclonal Antibody Clonetech 632375
Anti-Actin mAb Rabbit, IgG Sigma-Aldrich A45060-200UL
Amino acids Sigma-Aldrich Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium
Olympus IX-81  Inverted Fluorescence Microscope Olympus IX71/IX81
96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom Sigma-Greiner 89135-048
Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO TECAN Infinite 200® PRO
Cellulose acetate membrane 0.2 µm Sterlitech CA023001
Prism 5 GraphPad Statistical analysis software

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References

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Guo, L., Prall, W., Yang, X. Assays… More

Guo, L., Prall, W., Yang, X. Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells. J. Vis. Exp. (114), e54266, doi:10.3791/54266 (2016).

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