Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Des dosages pour la dégradation des protéines mal repliées dans des cellules

12K vues

⸱

DOI :

10.3791/54266

⸱

28 août 2016

 ,  , 
1Department of Cancer Biology, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 2Department of Systems Pharmacology and Translational Therapeutics, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Ce rapport décrit des protocoles pour mesurer les taux de dégradation des protéines mal repliées par transfert Western ou par des tests basés sur la fluorescence. Les méthodes peuvent être appliquées à l’analyse d’autres protéines mal repliées et au criblage à haut débit.

Résumé

Le mauvais repliement et l’agrégation des protéines sont associés à diverses maladies neurodégénératives. Les mécanismes cellulaires qui reconnaissent et dégradent les protéines mal repliées peuvent servir de cibles thérapeutiques potentielles. Pour distinguer la dégradation des protéines sujettes aux erreurs de repliement d’autres mécanismes qui régulent leurs niveaux, une méthode importante consiste à mesurer la demi-vie des protéines dans les cellules. Cependant, cela peut être difficile car les protéines sujettes au mauvais repliement peuvent exister sous différentes formes, y compris la forme native et les formes mal repliées de caractéristiques distinctes. Nous décrivons ici des tests permettant d’examiner la demi-vie de protéines mal repliées dans des cellules de mammifères en utilisant comme modèles une protéine fortement sujette à l’agrégation, l’Ataxin-1 avec un étirement prolongé de la polyglutamine (polyQ) et un mutant luciférase conformationnellement instable. La chasse au cycloheximide est combinée au fractionnement cellulaire pour examiner le taux de renouvellement des protéines sujettes au mauvais repliement dans diverses fractions cellulaires. Nous décrivons en outre un test basé sur la fluorescence utilisant une fusion améliorée de la protéine de fluorescence verte (EGFP) du mutant luciférase, qui peut être adaptée pour le criblage à haut débit sur un lecteur de microplaques.

Introduction

Les protéines sont les macromolécules les plus abondants dans les cellules, et ils jouent un rôle essentiel dans pratiquement tous les processus biologiques. L'activité biologique de la plupart des protéines nécessite leur pliage dans et à maintenir les structures en trois dimensions d'origine. Les protéines ayant des conformations aberrantes non seulement perdent leurs fonctions normales, mais aussi forment fréquemment des espèces oligomères solubles ou des agrégats qui altèrent les fonctions des autres protéines et sont toxiques pour les cellules 1,2. Pour contrer mauvais repliement des protéines, les cellules utilisent les deux chaperons moléculaires, qui aident les polypeptides dépliés ou partiellement repliés pour atteindre leur conformation native, et les voies de dégradation, ce qui élimine les protéines mal repliées 3. Compte tenu de la complexité et de la nature stochastique du processus de pliage, mauvais repliement des protéines est inévitable, et il ne peut pas être inversée dans le cas des mutations, des erreurs biosynthétiques et dommages post-traductionnelles 1. Par conséquent, les cellules dépendent finalement de dégradatvoies d'ions pour maintenir leur qualité de protéines.

L'importance du contrôle de la qualité des protéines cellulaires (QPC) systèmes est mise en évidence par la prévalence des maladies des protéines repliement, notamment le cancer, le diabète, et de nombreuses maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la sclérose latérale amyotrophique, la maladie de Huntington (HD), et ataxie spinocérébelleuse (SCA) 4,5. Par exemple, des mutations dans le gène p53 suppresseur de tumeur est la seule lésion génétique le plus fréquemment dans les tumeurs, associée à ~ 50-70% de tous les cas 6. Une fraction importante de mutations de p53 sont des mutations faux - sens qui modifient la conformation de p53, conduisant à la formation d'agrégats 7. En outre, les protéines avec des étendues polyQ expansées sont génétiquement et pathologiquement associés à HD et SCA. Ces maladies progressives et souvent fatales manifeste lorsque la longueur du tronçon de polyQ dans les protéines concernées est supérieur à un certain Thresmaintenir, et devient de plus en plus grave que la longueur du tronçon de polyQ prolonge 8.

Une approche intéressante pour le traitement de ces maladies est de renforcer les systèmes cellulaires thérapeutiquement PQC, en particulier les voies de dégradation. Cependant, les voies impliquées dans la dégradation des protéines défectueuses, en particulier dans les cellules de mammifères, restent mal connus. Bien qu'il ait été reconnu que le protéasome est très important pour la dégradation des protéines mal repliées, un enjeu vital reste indéfini: comment les protéines mal repliées sont spécifiquement reconnus et ciblés pour la dégradation. En outre, bien que les systèmes PQC ont été identifiés dans les compartiments cellulaires , y compris le cytoplasme, le réticulum endoplasmique, et la mitochondrie, les systèmes PQC dans le noyau restent peu claires 2.

Des études récentes de notre laboratoire ont identifié un système qui reconnaît et dégrade une variété de protéines mal repliées dans le noyaudes cellules de mammifère 9. Ce système est composé de la protéine promyélocytaire (PML), une protéine nucléaire et un membre de la tripartite famille de protéines contenant le motif (TRIM), et RNF4, un RING-domaine contenant des protéines. PML, et plusieurs autres protéines TRIM, possèdent SUMO (petit modificateur de ubiquitine) activité ligase E3, ce qui facilite la spécificité et l' efficacité de la protéine SUMOylation 10. RNF4 appartient à un petit groupe d'ubiquitine ligases SUMO ciblées (Stübl), qui contiennent un ou plusieurs motifs de sumo interagissant (SIMS) , en plus du domaine RING qui leur offre l'activité ubiquitine ligase 11. Nous avons constaté que la PML reconnaît spécifiquement les protéines mal repliées à travers des sites de reconnaissance de substrat discrètes qui peuvent discerner des caractéristiques distinctes sur les protéines mal repliées. Lors de la liaison, les balises PML mal repliées des protéines avec des poly-chaînes de Sumo2 / 3, deux protéines de mammifères SUMO pratiquement identiques qui peuvent former des poly-chaînes en raison de l'existence d'un site SUMOylation interne. Sprotéines mal repliées UMOylated sont ensuite reconnus par RNF4, ce qui conduit à leur ubiquitination et la dégradation par le protéasome. Nous avons aussi démontré que le système PML-RNF4 est important pour la protection contre la neurodégénérescence, comme une carence en PML aggrave les défauts comportementaux et neuropathologiques d'un modèle de souris de type SCA 1 (SCA1) 9.

Pour distinguer la dégradation des protéines à partir d' autres mécanismes cellulaires qui peuvent réguler les niveaux de protéines, les taux de renouvellement des protéines a été mesurée 9. Parmi les méthodes les plus fréquemment utilisées pour déterminer le renouvellement des protéines sont la chasse d'impulsion et cycloheximide (CHX) chasse. Ces deux méthodes examinent au fil du temps, respectivement, les protéines de radioisotopes marqué d'intérêt dans les cellules de traduction de maîtrise et protéines totales préexistantes d'intérêt dans les cellules de la traduction inhibée. Cependant, un défi majeur pour l'étude des protéines pathogènes et mauvais repliement sujettes est que la demi-vie de ces protéines peut être extrêmement long. Par exemple, Ataxin-1, Ataxin-7, la huntingtine, α-synucléine, et TDP-43 ont tous une demi-vie de plus de 12 à 24 heures 9,12-16. Les taux de rotation lente de ces protéines empêchent l'utilisation de l'analyse de la chasse CHX parce que les cellules hébergeant ces protéines ne peuvent pas survivre traduction inhibition prolongée, en particulier parce que les protéines mal repliées eux-mêmes peuvent être très toxiques pour les cellules. L'analyse pulse-chase avec marquage isotopique peut également être difficile pour des protéines qui sont très sujettes à l'agrégation. La plupart des tests pulse-chase reposent sur immunoprécipitation pour séparer la protéine d'intérêt à partir de toutes les autres protéines qui sont également marqué radioactivement. Cette procédure comprend normalement immunoprécipitation et de lavage des procédures longues, au cours de laquelle les agrégats de SDS-insolubles peuvent se former, ce qui rend l'analyse par électrophorèse SDS-PAGE inexacte.

Voici un protocole pour analyser les protéines mal repliées nucléaires avec un taux de rotation lente est décrit 9. Une forme pathogène de Ataxin-1 (ATXN1) qui contient un tronçon de 82 glutamine (ATXN1 82Q) est utilisé à cet effet 8. Lorsqu'elle est exprimée dans les cellules, une protéine fluorescente verte (GFP) , la fusion améliorée de formes ATXN1 82Q microscopiques inclusions visibles dans le noyau (figure 1A). Analyse de chasse Pulse révèle que la demi-vie de Ataxn1 82Q est plus de 18 h 9. ATXN1 82Q est composé d'espèces ayant des conformations mal repliées des caractéristiques différentes, ainsi que des espèces ayant une conformation native. Il est probable que ces espèces sont dégradés à des vitesses différentes, et doit donc être analysée séparément. Lysats de ATXN1 82Q-GFP exprimant les cellules sont fractionnés en NP-40 soluble (soluble ou NS, représentant probablement des protéines natives ou des protéines monomères / oligomères mal repliées) et (NI, agrégé / mal repliées) portions NP-40 insoluble. Ce dernier peut être divisé en SDS-soluble (SS; probables agrégats désordonnés) ou résistante au SDS (SR; fibrilles amyloïdes probables) Les fractions (figure 1B). NS et SS fractions peuvent être analysées par SDS-PAGE suivie par un transfert de Western, tandis que la fraction SR peut être détectée par des dosages filtre à retard suivie d'un immunotransfert. Poursuite de chlorhexidine est combiné avec le procédé de fractionnement par détergent, et a découvert que la demi-vie de SS ATXN1 82Q est beaucoup plus courte que celle de NS ATXN1 82Q et le total ATXN1 82Q (figure 2A), ce qui indique que la fraction SS peut être facilement reconnu et dégradé 9 dans des cellules. Ainsi, cette méthode fournit un outil puissant pour étudier la dynamique des protéines mal repliées et de comparer leur schéma de dégradation.

Nous décrivons également un procédé qui est approprié pour le criblage à haut débit pour identifier des macromolécules ou des composés qui peuvent moduler la dégradation de protéines mal repliées. Cette méthode est basée sur un mutant conformationnelle déstabilisée de la luciférase de luciole (LucDM) 17, un substrat modèle de chaperon. Nous avons fusibled LucDM à un signal de localisation nucléaire (NLS) pour sonder les systèmes PQC dans ce compartiment cellulaire, et la GFP (NLS-LucDM-GFP) pour la commodité de détection. Formes NLS-LucDM-GFP microscopiquement agrégats nucléaires visibles dans un petit pourcentage de cellules (figure 3A). Semblable à ATXN1 82Q, NLS-LucDM-GFP-mais pas son homologue de type sauvage NLS-LucWT-GFP-est modifiée par Sumo2 / 3 et réglementée par la voie PML-RNF4 9. NLS-LucDM-GFP forme également SS et les espèces SR, bien que les quantités relatives des SS et des espèces SR sont minimes par rapport à NS, en utilisant les conditions décrites dans le protocole 3 ci-dessous. Pour simplifier l'analyse, nous n'analysons SDS LucDM soluble (y compris les SN et les fractions SS) par SDS-PAGE et Western blot. Surtout, CHX essai de chasse a montré que la demi-vie du SDS soluble dans NLS-LucDM-GFP est beaucoup plus courte que celle de son homologue de type sauvage (figure 3B), ce qui suggère que LucDM est un substrat spécifique pour le système qui reconnaît et se dégradeprotéines mal repliées.

La dégradation des LucDM-GFP provoque une baisse significative du signal global de fluorescence. Par conséquent, nous avons également mis au point un protocole pour la détection en temps réel de LucDM-GFP en utilisant un dosage cellulaire basé sur la fluorescence de microplaque. De nombreux systèmes d' écran à haut débit (HTS) sont développés pour des médicaments ou des gènes modificateurs agrégats cellulaires et la viabilité cellulaire provoquées par des protéines aberrantes 18-20. Cependant, très peu HTS sont spécifiquement conçus pour cibler la dégradation dans les cellules de mammifères. Ce protocole sert de système robuste pour l'analyse à l'échelle rapide et à grande des effets de l'expression des protéines, knockdown, et un traitement médicamenteux sur cellulaire dégradation des protéines mal repliées. En utilisant des cellules HeLa à titre d'exemple, nous décrivons ci-dessous les protocoles pour l'analyse de ces deux protéines mal repliées. Les analyses peuvent également être appliqués à d'autres lignées cellulaires, bien que les conditions de transfection et de déroulement dans le temps peuvent avoir besoin d'être optimisé pour des lignées cellulaires individuelles.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

1. Préparation du réactif

  1. Préparer un tampon de lyse cellulaire (50 mM de Tris, pH 8,8, 100 mM de NaCl, 5 mM de MgCl2, 0,5% de NP-40). Supplément 2 mM de DTT, 1x complète cocktail de protéase, et 250 UI / ml benzonase avant utilisation.
  2. Préparer la solution tampon (20 mM de Tris, pH 8,0, 15 mM MgCl2). Supplément 2 mM de DTT, 1x complète cocktail protéase et 250 UI / ml benzonase avant utilisation.
  3. Préparer un tampon d'ébullition 3x (6% de SDS, Tris 20 mM, pH 8,0). Supplément mM de DTT 150 avant utilisation.
  4. Préparer à faible fluorescence du milieu DMEM pour les essais en utilisant un lecteur de fluorescence de microplaques. Mélanger 25 mM de glucose, de la glycine 0,4 mM, 0,4 mM d'arginine, 0,2 mM cystéine, mM de glutamine 4,0, 0,2 mM d'histidine, 0,8 mM d'isoleucine, 0,8 mM de leucine, 0,8 mM de lysine, 0,2 mM de methionine mM phénylalanine 0,4, 0,4 mM de sérine, de 0,8 mM thréonine, le tryptophane , 0,078 mM, 0,4 mM de tyrosine, de 0,8 mM de valine, 1,8 mM de CaCl2, 0,81 mM de MgSO4, 5,33 mM de KCl, 44,0 mM de NaHCO3, NaCl 110 mM, 0,9 mMNaH 2 PO 4. Ajuster le pH de la solution en utilisant du HCl ou du NaOH à un pH de 7,4. Stériliser le milieu par filtration.
    NOTE: Ce milieu contient des composants du milieu DMEM standard avec glucose élevé , sauf que Fe (NO 3) 3, vitamines et Phénol Red sont omis. Phénol Red, riboflavine et pyridoxal en milieu ordinaire de culture DMEM interfère de manière significative avec la détection du signal de fluorescence 21. Le milieu de culture sans ces composants est crucial pour le succès de l'imagerie en direct de la GFP cellulaire. Le milieu est stable pendant 12 mois lorsqu'il est conservé au réfrigérateur.

2. Dosage de la dégradation ATXN1 82Q GFP

  1. Plaque d' environ 3 x 10 5 cellules HeLa dans des plaques de 35 mm avec du milieu DMEM supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS), de sorte que , après la culture des cellules / N O atteignent une confluence de 40 à 60% au moment de la transfection.
    REMARQUE: Le nombre de plaques nécessaires est basée sur le nombre de points de temps et les traitements described ci-dessous.
  2. Cellules HeLa Transfecter avec 0,3 pg de ATXN1 82Q-GFP / pRK5 plasmide dans chaque réactif de transfection et en utilisant selon les instructions du fabricant 9. Faites un mélange maître de transfection contenant de l'ADN et de réactif de transfection et aliquoter pour chaque puits.
  3. 4-5 heures après transfection, examiner les cellules vivantes sous un microscope à fluorescence inversé pour l'expression de la GFP avec une excitation de longueur d'onde 450-490 nm. Retour cellules retour à l'incubateur après l'imagerie.
    REMARQUE: Observer les deux signaux de GFP diffusés et petites mouchetures de signaux de GFP dans le noyau à ce moment.
  4. Retirer le milieu par aspiration et ajouter 2 ml de DMEM frais contenant 50 pg / ml CHX. Traiter les cellules pour 0, 4, 8, 12 et 16 h avec CHX avant la récolte. Pour examiner la dégradation par le protéasome, inclure un inhibiteur du protéasome MG132 (10 uM) dans une plaque traitée pendant 16 heures comme témoin.
  5. Récolter une plaque de cellules à chaque point de temps. Retirer le milieu par aspiration sous vide uneD laver les plaques deux fois avec 3 ml glacée phosphate 1x solution saline tamponnée (PBS). Snap-geler la plaque sur la glace sèche.
  6. Après le dernier point de temps (16 h), racler les cellules congelées (à partir de tous les points de temps) dans 150 pi de tampon de lyse cellulaire glacée et incubé sur la glace pendant 30 min.
  7. Centrifuger les lysats de cellules dans une centrifugeuse de paillasse à 17 000 x g pendant 15 min à 4 ° C.
  8. Transférer le surnageant, qui contient des protéines (NS) NP-40 solubles, dans un autre tube à l'aide d'une pipette.
    REMARQUE: Utilisez surnageants pour mesurer les concentrations de protéines par dosage Bradford si nécessaire.
  9. Rincer les granulés en ajoutant doucement environ 200 ul PBS 1x pour les tubes sans déranger les pastilles. Retirez délicatement PBS par aspiration ou d'une pipette. Re-suspendre dans 150 tampon de culot cellulaire glacée ul, suivi de 15-30 minutes d'incubation sur de la glace.
    NOTE: La fraction de culot remis en suspension contient NP-40 protéines insolubles (NI). Voir la figure 1B pour un diagram de détergent fractionnement.
  10. Ajouter 75 pi de tampon bouillante 3x en fractions NS et NP-40 insolubles (NI) fractions remises en suspension à partir des pastilles. Chauffer les échantillons à 95 ° C sur un bloc chauffant pendant 5 minutes.
    NOTE: Clumps dans les NP-40 fractions insolubles sont dissous après le chauffage et les échantillons apparaîtront.
  11. Ajouter un tampon de charge SDS-gel à une aliquote de NS bouillies et NI. Charger un volume égal d'échantillons collectés à partir de tous les points de temps à un gel de SDS-PAGE. Le volume chargé correspond à environ 20 ug de NS de l'échantillon recueillies au moment 0. REMARQUE: NS, ainsi que le SDS-soluble (SS) protéines de NI faction, peuvent être résolus par SDS gel de séparation. En revanche, résistante au SDS (SR) des agrégats de fraction NI sont coincés dans les puits de gel de chargement (figure 1B). Pour améliorer la détection western blot, double volume de NI peut être chargé.
  12. Détecter NS et SS ATXN1 82Q-GFP par western blot en utilisant un anticorps anti-GFP et chimioluminescence amplifiée (ECL).
    NOTE: ATXN1 82Q dans la fraction SS est généralement moins par rapport à la fraction NS lors de l'utilisation de ce protocole. Une exposition plus longue ECL est nécessaire pour les signaux optimaux.
  13. SR examiner ATXN1 82Q à partir de la fraction de culot par des essais de retard de filtre en utilisant un appareil dot-blot (figure 1B). En bref, mettre en place un appareil dot-blot tenant une membrane d'acétate de 0,2 um de cellulose. Charge 80-120 ul de bouillie NI dans chaque puits de l'appareil dot-blot.
    REMARQUE: Étant donné que seules de petites quantités d'agrégats SR sont formés dans les cellules, pour l'analyse dot blot, charger un volume de la fraction SR qui est d'environ 10 à 15 fois le volume de la fraction NS utilisée pour l'analyse par transfert de Western.
    1. Après avoir filtré les échantillons à travers la membrane par le vide, les agrégats ATXN1 82Q-GFP collées sur la membrane peuvent être détectés par des anticorps anti-GFP immunotransfert 9,12,22.
      NOTE: Voir les rapports précédents 9,12,22 pour une description détaillée du test filtre de retard. Cette étape est facultativeparce que SR ATXN1 82Q est minime par rapport aux SS et NS fractions suivantes court transfection décrites dans ce protocole. En outre, les niveaux de SR ATXN1 82Q restent en grande partie la même sur CHX chase (figure 2B). Cependant, il est encore essentiel d'examiner si les montants des SS ATXN1 82Q sont affectées au fil du temps pour tout traitement médicamenteux ou l'expression des gènes dans des expériences initiales. espèces de protéines SS restent dans les puits de chargement gel SDS-PAGE peut être détectée par western blot. Cependant, cette méthode est moins sensible et génère des résultats variables plus (figure 1B).

3. Dégradation Dosage de NLS-luciférase-GFP utilisant SDS-PAGE et Western Blot

  1. Plaque d' environ 3 x 10 5 cellules HeLa dans des plaques de 35 mm avec du milieu DMEM supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS). Après O / N culture, une confluence de 40-60% est atteint au moment de la transfection. Le nombre de plaques nécessaires est basé sur le nombre de tles points ime et les traitements décrits ci-dessous.
  2. Cellules HeLa Transfecter avec 1,0 pg NLS-luciférase-GFP / pRK5 plasmide dans chaque réactif de transfection et en utilisant selon les instructions du fabricant 9. Faites un mélange maître de transfection contenant de l'ADN et un réactif de transfection pour aliquote de chaque puits.
  3. Après O / N transfection (environ 15 h), examiner les cellules vivantes sous un microscope à fluorescence inversé pour l'expression de la GFP avec une excitation de longueur d'onde 450-490 nm. Retour cellules retour à l'incubateur après l'imagerie.
    REMARQUE: Diffuse signal GFP nucléaire peut être observée dans la majorité des cellules (70%). Un faible pourcentage (5%) des cellules ont des agrégats nucléaires.
  4. Retirer le milieu par aspiration et ajouter 2 ml de DMEM frais contenant 50 pg / ml CHX. Traiter les cellules pour 0, 1,5, 3, 4,5 et 6 h avec CHX avant la récolte. Pour examiner la dégradation par le protéasome, inclure supplémentaire MG132 inhibiteur de protéasome (10 uM) dans une plaque traitée pendant 6 heures comme témoin.
  5. Récolter une plaque de cellules à chaque point de temps. Retirez le milieu par aspiration et laver les plaques deux fois avec 3 ml glacée tampon phosphate salin (PBS). Snap-geler la plaque sur la glace sèche.
  6. Après le dernier point (6 h) de temps est terminé, les cellules congelées à tous les temps points sont grattées dans 150 pi de tampon de lyse cellulaire glacée et incubés sur la glace pendant 30 min.
  7. Ajouter un tampon de gel de chargement SDS à lysats de cellules entières pour une concentration finale de 2% SDS et 50 mM de DTT. Incuber les échantillons sur un bloc chauffant à 95 ° C pendant 5 min.
  8. Analyser NLS-GFP-luciférase par SDS-PAGE et Western blot en utilisant un anticorps anti-GFP. Charger un volume égal d'échantillons collectés à partir de tous les points de temps à un gel de SDS-PAGE. Le volume chargé correspond à environ 20 pg de lysats de cellules entières à partir de l'échantillon collectées au temps 0.

4. temps réel Dégradation Dosage de NLS-luciférase-GFP Utilisation Fluorescence Lecteur de microplaques

  1. Semences d' environ 1 x 10 4dans les cellules de 96 puits noires des plaques de culture tissulaire à fond transparent HeLa. Après O / N culture, une confluence de 50-70% est atteint au moment de la transfection.
    REMARQUE: 60 pl de milieu contenant des cellules HeLa complètement en suspension sont ensemencés directement dans chaque puits. Ne pas ajouter du milieu ou de la roche supplémentaire plaque avant et en arrière après le semis, sinon les cellules peuvent être distribués de manière inégale.
  2. Cellules HeLa Transfecter avec 0,05-0,1 pg de NLS-luciférase-GFP / pRK5 plasmide 9 dans chaque réactif de transfection et en utilisant selon les instructions du fabricant. Faites un mélange maître de transfection contenant de l'ADN et de réactif de transfection et aliquoter pour chaque puits. Trois puits avec des cellules ne sont pas transfectées avec de l'ADN, qui sert de contrôle pour le signal de fluorescence de fond pour chaque condition de traitement.
    NOTE: Une autre façon de réduire la variation de transfection est de transfecter des cellules avant de semer. Cependant, une grande partie des cellules transfectées avec la protéine mal repliées ne parviennent pas à attacher ou montrer la viabilité réduite en utilisant cette méthode. Il est probable que certaines cellules ne peuvent pas supporter le stress causé par digestion par la trypsine en exprimant des protéines mal repliées toxiques. Par conséquent, le signal fluorescent global est considérablement réduit.
  3. 20-24 heures après transfection, examiner les cellules vivantes sous un microscope à fluorescence inversé pour l'expression de la GFP avec une excitation de longueur d'onde 450-490 nm.
  4. Éliminer le milieu par aspiration. Ajouter environ 200 ul 1x PBS à chaque puits, puis aspirer pour enlever quantité résiduelle de milieu DMEM.
  5. Ajouter 60 ul de faible fluorescence du milieu DMEM avec 5% de FBS et 50 ug / ml CHX. Pour examiner la dégradation par le protéasome, inclure supplémentaire MG132 inhibiteur de protéasome (10 uM) dans un ensemble d'échantillons. Set triplée de puits pour chaque traitement / condition.
    NOTE: Le traitement de MG132 est inclus en tant que témoins de la dégradation par le protéasome, car il est crucial pour écarter d'autres facteurs qui peuvent causer goutte de fluosignal rescence, y compris la mort cellulaire et l'extinction de fluorescence.
  6. Mesurer le signal de fluorescence de la GFP immédiatement sur un lecteur de plaque fluorescente après l'ajout CHX.
    REMARQUE: Les paramètres de mesure du logiciel sont présentés dans le tableau 1.
  7. Lire la plaque à chaque heure pour un maximum de 8-10 h. Après la lecture, retourner la plaque arrière à la culture cellulaire incubateur.
  8. Exporter les données sous forme de fichier tableur. Utiliser la valeur moyenne de plusieurs lectures pour chaque ainsi que l'intensité de la fluorescence. Normaliser les valeurs de chaque point de données pour les valeurs moyennes de temps 0 dans les groupes respectifs. Tracer l'intensité de fluorescence normalisé dans le temps , comme illustré sur la figure 4A et 4B et la figure 5, les panneaux de droite.
  9. Effectuer une analyse statistique des taux de dégradation entre les deux conditions à l' aide de deux voies ANOVA avec des mesures répétées 23.
    NOTE: Dans cette analyse, "l'intensité de fluorescence" est la variable dépendante alors que "traitemconditions ent »et« temps »sont les deux facteurs. Au lieu de comparer les données à des points de temps individuels, à deux voies ANOVA avec des mesures répétées analyse la différence entre les deux groupes de traitement au cours du temps ensemble.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Dans une analyse d'état stable, les agrégats nucléaires ATXN1 82Q-GFP visibles au microscope peuvent être observées dans 30 - 50% des cellules HeLa 20 heures après la transfection (figure 1A). Analyse par Western blot et SS NS fractions en utilisant un anticorps anti-GFP montre une bande distincte de ATXN1 82Q-GFP entre 100 kDa et 150 kDa marqueurs, ce qui correspond à la masse moléculaire de la protéine (figure 1B). ATXN1 82Q-GFP dans la fraction SR...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Les mécanismes qui régulent la dégradation des protéines mal repliées sont essentiels pour le maintien de l'homéostasie des protéines cellulaires, et ils représentent probablement des cibles de médicaments utiles pour le traitement de maladies neurodégénératives et d'autres maladies en protéines repliement. Ici, les dosages qui examinent la dégradation de protéines mal repliées sont décrits, en utilisant une protéine pathogène ATXN1 (ATXN1 82Q) et un mutant nucléaire localisée de la luciférase (SLN LucDM) à titr...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Nous remercions S. Raychaudhuri pour avoir fourni le plasmide mutant luciférase déstabilisé, ainsi que A. Glavis-bloom et N. Charan pour l’assistance technique. Ce travail a été soutenu, en partie, par des subventions des NIH (CA088868, GM060911 et CA182675).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Dulbecco’s Modified Eagle MediumLife Technologies11995-092
Fetal Bovine SerumLife Technologies10082147
Lipofectamine 2000Life Technologies11668019
NP-40Sigma-AldrichNP40S-500ML
SDSSigma-AldrichL3771
MG132Sigma-AldrichM8699
CycloheximideSigma-AldrichC7698
Dithiothreitol (DTT)Fisher Scientific45000232
Inhibiteur complet de la protéase ComprimésRoche Boehringer Mannheim4693159001
Bio-Dot Apparatus  ;Bio-Rad1706545
Living Colors GFP Anticorps monoclonalClonetech632375
Anti-actine mAb Rabbit, IgGSigma-AldrichA45060-200UL
Acides aminésSigma-AldrichLes acides aminés sont utilisés pour la fabrication de milieux de culture à faible fluorescence
Olympus IX-81  ; Microscope à fluorescence inverséeOlympusIX71/IX81
96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear BottomSigma-Greiner89135-048
Lecteur de plaque inférieure à fluorescence Infinite 200® ; PROTECANInfinite 200® ;
Membrane d’acétate de cellulose 0.2 & micro ; mSterlitechCA023001
Prism 5GraphPadLogiciel d’analyse statistique
PRO

Références

  1. Dobson, C. M. Protein folding and misfolding. Nature. 426, 884-890 (2003).
  2. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
  3. Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
  4. Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic proteins in neurodegenerative disease. Science. 296, 1991-1995 (2002).
  5. Selkoe, D. J. Folding proteins in fatal ways. Nature. 426, 900-904 (2003).
  6. Vousden, K. H., Prives, C. Blinded by the Light: The Growing Complexity of p53. Cell. 137, 413-431 (2009).
  7. Xu, J., et al. Gain of function of mutant p53 by coaggregation with multiple tumor suppressors. Nat Chem Biol. 7, 285-295 (2011).
  8. Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. Trinucleotide repeat disorders. Annu Rev Neurosci. 30, 575-621 (2007).
  9. Guo, L., et al. A cellular system that degrades misfolded proteins and protects against neurodegeneration. Mol Cell. 55, 15-30 (2014).
  10. Chu, Y., Yang, X. SUMO E3 ligase activity of TRIM proteins. Oncogene. 30, 1108-1116 (2011).
  11. Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins. EMBO J. 26, 4102-4112 (2007).
  12. Janer, A., et al. PML clastosomes prevent nuclear accumulation of mutant ataxin-7 and other polyglutamine proteins. J Cell Biol. 174, 65-76 (2006).
  13. Bauer, P. O., et al. Harnessing chaperone-mediated autophagy for the selective degradation of mutant huntingtin protein. Nat Biotechnol. 28, 256-263 (2010).
  14. Austin, J. A., et al. Disease causing mutants of TDP-43 nucleic acid binding domains are resistant to aggregation and have increased stability and half-life. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 4309-4314 (2014).
  15. Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nat Chem Biol. 10, 677-685 (2014).
  16. Paxinou, E., et al. Induction of alpha-synuclein aggregation by intracellular nitrative insult. J Neurosci. 21, 8053-8061 (2001).
  17. Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nat Methods. 8, 879-884 (2011).
  18. Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313, 324-328 (2006).
  19. Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466, 1069-1075 (2010).
  20. Fortini, M. E., Bonini, N. M. Modeling human neurodegenerative diseases in Drosophila: on a wing and a prayer. Trends Genet. 16, 161-167 (2000).
  21. Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. Anti-fading media for live cell GFP imaging. PLoS One. 7, (2012).
  22. Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
  23. McDonald, J. H. Handbook of Biological Statistics. 3, 3rd, 173-179 (2014).
  24. Holmberg, C. I., Staniszewski, K. E., Mensah, K. N., Matouschek, A., Morimoto, R. I. Inefficient degradation of truncated polyglutamine proteins by the proteasome. EMBO J. 23, 4307-4318 (2004).
  25. Verhoef, L. G., Lindsten, K., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. Aggregate formation inhibits proteasomal degradation of polyglutamine proteins. Human molecular genetics. 11, 2689-2700 (2002).
  26. Jana, N. R., Zemskov, E. A., Wang, G., Nukina, N. Altered proteasomal function due to the expression of polyglutamine-expanded truncated N-terminal huntingtin induces apoptosis by caspase activation through mitochondrial cytochrome c release. Human molecular genetics. 10, 1049-1059 (2001).
  27. Fribley, A., Zeng, Q., Wang, C. Y. Proteasome inhibitor PS-341 induces apoptosis through induction of endoplasmic reticulum stress-reactive oxygen species in head and neck squamous cell carcinoma cells. Molecular and cellular biology. 24, 9695-9704 (2004).
  28. Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
  29. Chen, Q., et al. Intrasarcoplasmic amyloidosis impairs proteolytic function of proteasomes in cardiomyocytes by compromising substrate uptake. Circulation research. 97, 1018-1026 (2005).
  30. Link, C. D., et al. Conversion of green fluorescent protein into a toxic, aggregation-prone protein by C-terminal addition of a short peptide. The Journal of biological chemistry. 281, 1808-1816 (2006).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Explorer plus d’articles

Dégradation des protéines mal repliéeschase à la cycloheximidefractionnement cellulaireanalyse par Western blotessai basé sur la fluorescenceinhibition du protéasomedemi-vie des protéinesprotéines sujettes à l'agrégationessai de rétention sur filtrecriblage à haut débit
Des dosages pour la dégradation des protéines mal repliées dans des cellules
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.