Introduction
Les protéines sont les macromolécules les plus abondants dans les cellules, et ils jouent un rôle essentiel dans pratiquement tous les processus biologiques. L'activité biologique de la plupart des protéines nécessite leur pliage dans et à maintenir les structures en trois dimensions d'origine. Les protéines ayant des conformations aberrantes non seulement perdent leurs fonctions normales, mais aussi forment fréquemment des espèces oligomères solubles ou des agrégats qui altèrent les fonctions des autres protéines et sont toxiques pour les cellules 1,2. Pour contrer mauvais repliement des protéines, les cellules utilisent les deux chaperons moléculaires, qui aident les polypeptides dépliés ou partiellement repliés pour atteindre leur conformation native, et les voies de dégradation, ce qui élimine les protéines mal repliées 3. Compte tenu de la complexité et de la nature stochastique du processus de pliage, mauvais repliement des protéines est inévitable, et il ne peut pas être inversée dans le cas des mutations, des erreurs biosynthétiques et dommages post-traductionnelles 1. Par conséquent, les cellules dépendent finalement de dégradatvoies d'ions pour maintenir leur qualité de protéines.
L'importance du contrôle de la qualité des protéines cellulaires (QPC) systèmes est mise en évidence par la prévalence des maladies des protéines repliement, notamment le cancer, le diabète, et de nombreuses maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la sclérose latérale amyotrophique, la maladie de Huntington (HD), et ataxie spinocérébelleuse (SCA) 4,5. Par exemple, des mutations dans le gène p53 suppresseur de tumeur est la seule lésion génétique le plus fréquemment dans les tumeurs, associée à ~ 50-70% de tous les cas 6. Une fraction importante de mutations de p53 sont des mutations faux - sens qui modifient la conformation de p53, conduisant à la formation d'agrégats 7. En outre, les protéines avec des étendues polyQ expansées sont génétiquement et pathologiquement associés à HD et SCA. Ces maladies progressives et souvent fatales manifeste lorsque la longueur du tronçon de polyQ dans les protéines concernées est supérieur à un certain Thresmaintenir, et devient de plus en plus grave que la longueur du tronçon de polyQ prolonge 8.
Une approche intéressante pour le traitement de ces maladies est de renforcer les systèmes cellulaires thérapeutiquement PQC, en particulier les voies de dégradation. Cependant, les voies impliquées dans la dégradation des protéines défectueuses, en particulier dans les cellules de mammifères, restent mal connus. Bien qu'il ait été reconnu que le protéasome est très important pour la dégradation des protéines mal repliées, un enjeu vital reste indéfini: comment les protéines mal repliées sont spécifiquement reconnus et ciblés pour la dégradation. En outre, bien que les systèmes PQC ont été identifiés dans les compartiments cellulaires , y compris le cytoplasme, le réticulum endoplasmique, et la mitochondrie, les systèmes PQC dans le noyau restent peu claires 2.
Des études récentes de notre laboratoire ont identifié un système qui reconnaît et dégrade une variété de protéines mal repliées dans le noyaudes cellules de mammifère 9. Ce système est composé de la protéine promyélocytaire (PML), une protéine nucléaire et un membre de la tripartite famille de protéines contenant le motif (TRIM), et RNF4, un RING-domaine contenant des protéines. PML, et plusieurs autres protéines TRIM, possèdent SUMO (petit modificateur de ubiquitine) activité ligase E3, ce qui facilite la spécificité et l' efficacité de la protéine SUMOylation 10. RNF4 appartient à un petit groupe d'ubiquitine ligases SUMO ciblées (Stübl), qui contiennent un ou plusieurs motifs de sumo interagissant (SIMS) , en plus du domaine RING qui leur offre l'activité ubiquitine ligase 11. Nous avons constaté que la PML reconnaît spécifiquement les protéines mal repliées à travers des sites de reconnaissance de substrat discrètes qui peuvent discerner des caractéristiques distinctes sur les protéines mal repliées. Lors de la liaison, les balises PML mal repliées des protéines avec des poly-chaînes de Sumo2 / 3, deux protéines de mammifères SUMO pratiquement identiques qui peuvent former des poly-chaînes en raison de l'existence d'un site SUMOylation interne. Sprotéines mal repliées UMOylated sont ensuite reconnus par RNF4, ce qui conduit à leur ubiquitination et la dégradation par le protéasome. Nous avons aussi démontré que le système PML-RNF4 est important pour la protection contre la neurodégénérescence, comme une carence en PML aggrave les défauts comportementaux et neuropathologiques d'un modèle de souris de type SCA 1 (SCA1) 9.
Pour distinguer la dégradation des protéines à partir d' autres mécanismes cellulaires qui peuvent réguler les niveaux de protéines, les taux de renouvellement des protéines a été mesurée 9. Parmi les méthodes les plus fréquemment utilisées pour déterminer le renouvellement des protéines sont la chasse d'impulsion et cycloheximide (CHX) chasse. Ces deux méthodes examinent au fil du temps, respectivement, les protéines de radioisotopes marqué d'intérêt dans les cellules de traduction de maîtrise et protéines totales préexistantes d'intérêt dans les cellules de la traduction inhibée. Cependant, un défi majeur pour l'étude des protéines pathogènes et mauvais repliement sujettes est que la demi-vie de ces protéines peut être extrêmement long. Par exemple, Ataxin-1, Ataxin-7, la huntingtine, α-synucléine, et TDP-43 ont tous une demi-vie de plus de 12 à 24 heures 9,12-16. Les taux de rotation lente de ces protéines empêchent l'utilisation de l'analyse de la chasse CHX parce que les cellules hébergeant ces protéines ne peuvent pas survivre traduction inhibition prolongée, en particulier parce que les protéines mal repliées eux-mêmes peuvent être très toxiques pour les cellules. L'analyse pulse-chase avec marquage isotopique peut également être difficile pour des protéines qui sont très sujettes à l'agrégation. La plupart des tests pulse-chase reposent sur immunoprécipitation pour séparer la protéine d'intérêt à partir de toutes les autres protéines qui sont également marqué radioactivement. Cette procédure comprend normalement immunoprécipitation et de lavage des procédures longues, au cours de laquelle les agrégats de SDS-insolubles peuvent se former, ce qui rend l'analyse par électrophorèse SDS-PAGE inexacte.
Voici un protocole pour analyser les protéines mal repliées nucléaires avec un taux de rotation lente est décrit 9. Une forme pathogène de Ataxin-1 (ATXN1) qui contient un tronçon de 82 glutamine (ATXN1 82Q) est utilisé à cet effet 8. Lorsqu'elle est exprimée dans les cellules, une protéine fluorescente verte (GFP) , la fusion améliorée de formes ATXN1 82Q microscopiques inclusions visibles dans le noyau (figure 1A). Analyse de chasse Pulse révèle que la demi-vie de Ataxn1 82Q est plus de 18 h 9. ATXN1 82Q est composé d'espèces ayant des conformations mal repliées des caractéristiques différentes, ainsi que des espèces ayant une conformation native. Il est probable que ces espèces sont dégradés à des vitesses différentes, et doit donc être analysée séparément. Lysats de ATXN1 82Q-GFP exprimant les cellules sont fractionnés en NP-40 soluble (soluble ou NS, représentant probablement des protéines natives ou des protéines monomères / oligomères mal repliées) et (NI, agrégé / mal repliées) portions NP-40 insoluble. Ce dernier peut être divisé en SDS-soluble (SS; probables agrégats désordonnés) ou résistante au SDS (SR; fibrilles amyloïdes probables) Les fractions (figure 1B). NS et SS fractions peuvent être analysées par SDS-PAGE suivie par un transfert de Western, tandis que la fraction SR peut être détectée par des dosages filtre à retard suivie d'un immunotransfert. Poursuite de chlorhexidine est combiné avec le procédé de fractionnement par détergent, et a découvert que la demi-vie de SS ATXN1 82Q est beaucoup plus courte que celle de NS ATXN1 82Q et le total ATXN1 82Q (figure 2A), ce qui indique que la fraction SS peut être facilement reconnu et dégradé 9 dans des cellules. Ainsi, cette méthode fournit un outil puissant pour étudier la dynamique des protéines mal repliées et de comparer leur schéma de dégradation.
Nous décrivons également un procédé qui est approprié pour le criblage à haut débit pour identifier des macromolécules ou des composés qui peuvent moduler la dégradation de protéines mal repliées. Cette méthode est basée sur un mutant conformationnelle déstabilisée de la luciférase de luciole (LucDM) 17, un substrat modèle de chaperon. Nous avons fusibled LucDM à un signal de localisation nucléaire (NLS) pour sonder les systèmes PQC dans ce compartiment cellulaire, et la GFP (NLS-LucDM-GFP) pour la commodité de détection. Formes NLS-LucDM-GFP microscopiquement agrégats nucléaires visibles dans un petit pourcentage de cellules (figure 3A). Semblable à ATXN1 82Q, NLS-LucDM-GFP-mais pas son homologue de type sauvage NLS-LucWT-GFP-est modifiée par Sumo2 / 3 et réglementée par la voie PML-RNF4 9. NLS-LucDM-GFP forme également SS et les espèces SR, bien que les quantités relatives des SS et des espèces SR sont minimes par rapport à NS, en utilisant les conditions décrites dans le protocole 3 ci-dessous. Pour simplifier l'analyse, nous n'analysons SDS LucDM soluble (y compris les SN et les fractions SS) par SDS-PAGE et Western blot. Surtout, CHX essai de chasse a montré que la demi-vie du SDS soluble dans NLS-LucDM-GFP est beaucoup plus courte que celle de son homologue de type sauvage (figure 3B), ce qui suggère que LucDM est un substrat spécifique pour le système qui reconnaît et se dégradeprotéines mal repliées.
La dégradation des LucDM-GFP provoque une baisse significative du signal global de fluorescence. Par conséquent, nous avons également mis au point un protocole pour la détection en temps réel de LucDM-GFP en utilisant un dosage cellulaire basé sur la fluorescence de microplaque. De nombreux systèmes d' écran à haut débit (HTS) sont développés pour des médicaments ou des gènes modificateurs agrégats cellulaires et la viabilité cellulaire provoquées par des protéines aberrantes 18-20. Cependant, très peu HTS sont spécifiquement conçus pour cibler la dégradation dans les cellules de mammifères. Ce protocole sert de système robuste pour l'analyse à l'échelle rapide et à grande des effets de l'expression des protéines, knockdown, et un traitement médicamenteux sur cellulaire dégradation des protéines mal repliées. En utilisant des cellules HeLa à titre d'exemple, nous décrivons ci-dessous les protocoles pour l'analyse de ces deux protéines mal repliées. Les analyses peuvent également être appliqués à d'autres lignées cellulaires, bien que les conditions de transfection et de déroulement dans le temps peuvent avoir besoin d'être optimisé pour des lignées cellulaires individuelles.
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Protocol
1. Préparation du réactif
- Préparer un tampon de lyse cellulaire (50 mM de Tris, pH 8,8, 100 mM de NaCl, 5 mM de MgCl2, 0,5% de NP-40). Supplément 2 mM de DTT, 1x complète cocktail de protéase, et 250 UI / ml benzonase avant utilisation.
- Préparer la solution tampon (20 mM de Tris, pH 8,0, 15 mM MgCl2). Supplément 2 mM de DTT, 1x complète cocktail protéase et 250 UI / ml benzonase avant utilisation.
- Préparer un tampon d'ébullition 3x (6% de SDS, Tris 20 mM, pH 8,0). Supplément mM de DTT 150 avant utilisation.
- Préparer à faible fluorescence du milieu DMEM pour les essais en utilisant un lecteur de fluorescence de microplaques. Mélanger 25 mM de glucose, de la glycine 0,4 mM, 0,4 mM d'arginine, 0,2 mM cystéine, mM de glutamine 4,0, 0,2 mM d'histidine, 0,8 mM d'isoleucine, 0,8 mM de leucine, 0,8 mM de lysine, 0,2 mM de methionine mM phénylalanine 0,4, 0,4 mM de sérine, de 0,8 mM thréonine, le tryptophane , 0,078 mM, 0,4 mM de tyrosine, de 0,8 mM de valine, 1,8 mM de CaCl2, 0,81 mM de MgSO4, 5,33 mM de KCl, 44,0 mM de NaHCO3, NaCl 110 mM, 0,9 mMNaH 2 PO 4. Ajuster le pH de la solution en utilisant du HCl ou du NaOH à un pH de 7,4. Stériliser le milieu par filtration.
NOTE: Ce milieu contient des composants du milieu DMEM standard avec glucose élevé , sauf que Fe (NO 3) 3, vitamines et Phénol Red sont omis. Phénol Red, riboflavine et pyridoxal en milieu ordinaire de culture DMEM interfère de manière significative avec la détection du signal de fluorescence 21. Le milieu de culture sans ces composants est crucial pour le succès de l'imagerie en direct de la GFP cellulaire. Le milieu est stable pendant 12 mois lorsqu'il est conservé au réfrigérateur.
2. Dosage de la dégradation ATXN1 82Q GFP
- Plaque d' environ 3 x 10 5 cellules HeLa dans des plaques de 35 mm avec du milieu DMEM supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS), de sorte que , après la culture des cellules / N O atteignent une confluence de 40 à 60% au moment de la transfection.
REMARQUE: Le nombre de plaques nécessaires est basée sur le nombre de points de temps et les traitements described ci-dessous. - Cellules HeLa Transfecter avec 0,3 pg de ATXN1 82Q-GFP / pRK5 plasmide dans chaque réactif de transfection et en utilisant selon les instructions du fabricant 9. Faites un mélange maître de transfection contenant de l'ADN et de réactif de transfection et aliquoter pour chaque puits.
- 4-5 heures après transfection, examiner les cellules vivantes sous un microscope à fluorescence inversé pour l'expression de la GFP avec une excitation de longueur d'onde 450-490 nm. Retour cellules retour à l'incubateur après l'imagerie.
REMARQUE: Observer les deux signaux de GFP diffusés et petites mouchetures de signaux de GFP dans le noyau à ce moment. - Retirer le milieu par aspiration et ajouter 2 ml de DMEM frais contenant 50 pg / ml CHX. Traiter les cellules pour 0, 4, 8, 12 et 16 h avec CHX avant la récolte. Pour examiner la dégradation par le protéasome, inclure un inhibiteur du protéasome MG132 (10 uM) dans une plaque traitée pendant 16 heures comme témoin.
- Récolter une plaque de cellules à chaque point de temps. Retirer le milieu par aspiration sous vide uneD laver les plaques deux fois avec 3 ml glacée phosphate 1x solution saline tamponnée (PBS). Snap-geler la plaque sur la glace sèche.
- Après le dernier point de temps (16 h), racler les cellules congelées (à partir de tous les points de temps) dans 150 pi de tampon de lyse cellulaire glacée et incubé sur la glace pendant 30 min.
- Centrifuger les lysats de cellules dans une centrifugeuse de paillasse à 17 000 x g pendant 15 min à 4 ° C.
- Transférer le surnageant, qui contient des protéines (NS) NP-40 solubles, dans un autre tube à l'aide d'une pipette.
REMARQUE: Utilisez surnageants pour mesurer les concentrations de protéines par dosage Bradford si nécessaire. - Rincer les granulés en ajoutant doucement environ 200 ul PBS 1x pour les tubes sans déranger les pastilles. Retirez délicatement PBS par aspiration ou d'une pipette. Re-suspendre dans 150 tampon de culot cellulaire glacée ul, suivi de 15-30 minutes d'incubation sur de la glace.
NOTE: La fraction de culot remis en suspension contient NP-40 protéines insolubles (NI). Voir la figure 1B pour un diagram de détergent fractionnement. - Ajouter 75 pi de tampon bouillante 3x en fractions NS et NP-40 insolubles (NI) fractions remises en suspension à partir des pastilles. Chauffer les échantillons à 95 ° C sur un bloc chauffant pendant 5 minutes.
NOTE: Clumps dans les NP-40 fractions insolubles sont dissous après le chauffage et les échantillons apparaîtront. - Ajouter un tampon de charge SDS-gel à une aliquote de NS bouillies et NI. Charger un volume égal d'échantillons collectés à partir de tous les points de temps à un gel de SDS-PAGE. Le volume chargé correspond à environ 20 ug de NS de l'échantillon recueillies au moment 0. REMARQUE: NS, ainsi que le SDS-soluble (SS) protéines de NI faction, peuvent être résolus par SDS gel de séparation. En revanche, résistante au SDS (SR) des agrégats de fraction NI sont coincés dans les puits de gel de chargement (figure 1B). Pour améliorer la détection western blot, double volume de NI peut être chargé.
- Détecter NS et SS ATXN1 82Q-GFP par western blot en utilisant un anticorps anti-GFP et chimioluminescence amplifiée (ECL).
NOTE: ATXN1 82Q dans la fraction SS est généralement moins par rapport à la fraction NS lors de l'utilisation de ce protocole. Une exposition plus longue ECL est nécessaire pour les signaux optimaux. - SR examiner ATXN1 82Q à partir de la fraction de culot par des essais de retard de filtre en utilisant un appareil dot-blot (figure 1B). En bref, mettre en place un appareil dot-blot tenant une membrane d'acétate de 0,2 um de cellulose. Charge 80-120 ul de bouillie NI dans chaque puits de l'appareil dot-blot.
REMARQUE: Étant donné que seules de petites quantités d'agrégats SR sont formés dans les cellules, pour l'analyse dot blot, charger un volume de la fraction SR qui est d'environ 10 à 15 fois le volume de la fraction NS utilisée pour l'analyse par transfert de Western.- Après avoir filtré les échantillons à travers la membrane par le vide, les agrégats ATXN1 82Q-GFP collées sur la membrane peuvent être détectés par des anticorps anti-GFP immunotransfert 9,12,22.
NOTE: Voir les rapports précédents 9,12,22 pour une description détaillée du test filtre de retard. Cette étape est facultativeparce que SR ATXN1 82Q est minime par rapport aux SS et NS fractions suivantes court transfection décrites dans ce protocole. En outre, les niveaux de SR ATXN1 82Q restent en grande partie la même sur CHX chase (figure 2B). Cependant, il est encore essentiel d'examiner si les montants des SS ATXN1 82Q sont affectées au fil du temps pour tout traitement médicamenteux ou l'expression des gènes dans des expériences initiales. espèces de protéines SS restent dans les puits de chargement gel SDS-PAGE peut être détectée par western blot. Cependant, cette méthode est moins sensible et génère des résultats variables plus (figure 1B).
- Après avoir filtré les échantillons à travers la membrane par le vide, les agrégats ATXN1 82Q-GFP collées sur la membrane peuvent être détectés par des anticorps anti-GFP immunotransfert 9,12,22.
3. Dégradation Dosage de NLS-luciférase-GFP utilisant SDS-PAGE et Western Blot
- Plaque d' environ 3 x 10 5 cellules HeLa dans des plaques de 35 mm avec du milieu DMEM supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS). Après O / N culture, une confluence de 40-60% est atteint au moment de la transfection. Le nombre de plaques nécessaires est basé sur le nombre de tles points ime et les traitements décrits ci-dessous.
- Cellules HeLa Transfecter avec 1,0 pg NLS-luciférase-GFP / pRK5 plasmide dans chaque réactif de transfection et en utilisant selon les instructions du fabricant 9. Faites un mélange maître de transfection contenant de l'ADN et un réactif de transfection pour aliquote de chaque puits.
- Après O / N transfection (environ 15 h), examiner les cellules vivantes sous un microscope à fluorescence inversé pour l'expression de la GFP avec une excitation de longueur d'onde 450-490 nm. Retour cellules retour à l'incubateur après l'imagerie.
REMARQUE: Diffuse signal GFP nucléaire peut être observée dans la majorité des cellules (70%). Un faible pourcentage (5%) des cellules ont des agrégats nucléaires. - Retirer le milieu par aspiration et ajouter 2 ml de DMEM frais contenant 50 pg / ml CHX. Traiter les cellules pour 0, 1,5, 3, 4,5 et 6 h avec CHX avant la récolte. Pour examiner la dégradation par le protéasome, inclure supplémentaire MG132 inhibiteur de protéasome (10 uM) dans une plaque traitée pendant 6 heures comme témoin.
- Récolter une plaque de cellules à chaque point de temps. Retirez le milieu par aspiration et laver les plaques deux fois avec 3 ml glacée tampon phosphate salin (PBS). Snap-geler la plaque sur la glace sèche.
- Après le dernier point (6 h) de temps est terminé, les cellules congelées à tous les temps points sont grattées dans 150 pi de tampon de lyse cellulaire glacée et incubés sur la glace pendant 30 min.
- Ajouter un tampon de gel de chargement SDS à lysats de cellules entières pour une concentration finale de 2% SDS et 50 mM de DTT. Incuber les échantillons sur un bloc chauffant à 95 ° C pendant 5 min.
- Analyser NLS-GFP-luciférase par SDS-PAGE et Western blot en utilisant un anticorps anti-GFP. Charger un volume égal d'échantillons collectés à partir de tous les points de temps à un gel de SDS-PAGE. Le volume chargé correspond à environ 20 pg de lysats de cellules entières à partir de l'échantillon collectées au temps 0.
4. temps réel Dégradation Dosage de NLS-luciférase-GFP Utilisation Fluorescence Lecteur de microplaques
- Semences d' environ 1 x 10 4dans les cellules de 96 puits noires des plaques de culture tissulaire à fond transparent HeLa. Après O / N culture, une confluence de 50-70% est atteint au moment de la transfection.
REMARQUE: 60 pl de milieu contenant des cellules HeLa complètement en suspension sont ensemencés directement dans chaque puits. Ne pas ajouter du milieu ou de la roche supplémentaire plaque avant et en arrière après le semis, sinon les cellules peuvent être distribués de manière inégale. - Cellules HeLa Transfecter avec 0,05-0,1 pg de NLS-luciférase-GFP / pRK5 plasmide 9 dans chaque réactif de transfection et en utilisant selon les instructions du fabricant. Faites un mélange maître de transfection contenant de l'ADN et de réactif de transfection et aliquoter pour chaque puits. Trois puits avec des cellules ne sont pas transfectées avec de l'ADN, qui sert de contrôle pour le signal de fluorescence de fond pour chaque condition de traitement.
NOTE: Une autre façon de réduire la variation de transfection est de transfecter des cellules avant de semer. Cependant, une grande partie des cellules transfectées avec la protéine mal repliées ne parviennent pas à attacher ou montrer la viabilité réduite en utilisant cette méthode. Il est probable que certaines cellules ne peuvent pas supporter le stress causé par digestion par la trypsine en exprimant des protéines mal repliées toxiques. Par conséquent, le signal fluorescent global est considérablement réduit. - 20-24 heures après transfection, examiner les cellules vivantes sous un microscope à fluorescence inversé pour l'expression de la GFP avec une excitation de longueur d'onde 450-490 nm.
- Éliminer le milieu par aspiration. Ajouter environ 200 ul 1x PBS à chaque puits, puis aspirer pour enlever quantité résiduelle de milieu DMEM.
- Ajouter 60 ul de faible fluorescence du milieu DMEM avec 5% de FBS et 50 ug / ml CHX. Pour examiner la dégradation par le protéasome, inclure supplémentaire MG132 inhibiteur de protéasome (10 uM) dans un ensemble d'échantillons. Set triplée de puits pour chaque traitement / condition.
NOTE: Le traitement de MG132 est inclus en tant que témoins de la dégradation par le protéasome, car il est crucial pour écarter d'autres facteurs qui peuvent causer goutte de fluosignal rescence, y compris la mort cellulaire et l'extinction de fluorescence. - Mesurer le signal de fluorescence de la GFP immédiatement sur un lecteur de plaque fluorescente après l'ajout CHX.
REMARQUE: Les paramètres de mesure du logiciel sont présentés dans le tableau 1. - Lire la plaque à chaque heure pour un maximum de 8-10 h. Après la lecture, retourner la plaque arrière à la culture cellulaire incubateur.
- Exporter les données sous forme de fichier tableur. Utiliser la valeur moyenne de plusieurs lectures pour chaque ainsi que l'intensité de la fluorescence. Normaliser les valeurs de chaque point de données pour les valeurs moyennes de temps 0 dans les groupes respectifs. Tracer l'intensité de fluorescence normalisé dans le temps , comme illustré sur la figure 4A et 4B et la figure 5, les panneaux de droite.
- Effectuer une analyse statistique des taux de dégradation entre les deux conditions à l' aide de deux voies ANOVA avec des mesures répétées 23.
NOTE: Dans cette analyse, "l'intensité de fluorescence" est la variable dépendante alors que "traitemconditions ent »et« temps »sont les deux facteurs. Au lieu de comparer les données à des points de temps individuels, à deux voies ANOVA avec des mesures répétées analyse la différence entre les deux groupes de traitement au cours du temps ensemble.
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Representative Results
Dans une analyse d'état stable, les agrégats nucléaires ATXN1 82Q-GFP visibles au microscope peuvent être observées dans 30 - 50% des cellules HeLa 20 heures après la transfection (figure 1A). Analyse par Western blot et SS NS fractions en utilisant un anticorps anti-GFP montre une bande distincte de ATXN1 82Q-GFP entre 100 kDa et 150 kDa marqueurs, ce qui correspond à la masse moléculaire de la protéine (figure 1B). ATXN1 82Q-GFP dans la fraction SR peut être détecté soit par un retard dosage du filtre ou par SDS-PAGE et Western Blot comme les espèces dans la partie supérieure du gel d'empilement (figure 1B). Pour l'analyse demi-vie en utilisant le protocole décrit ci-dessus, CHX chase commence 4-5 heures après la transfection initiale avant que les grands agrégats nucléaires sont formés. La demi-vie de ATXN1 82Q-GFP dans la fraction SS est d' environ 5 heures, par opposition à une légère ou aucune diminution de ATXN1 82Q-GFP dans la fraction au- dessus de NS 16 h (figure 2A). Le degradation de ATXN1 82Q-GFP est partiellement inhibée par le traitement des cellules avec MG132 (figure 2A). Nous avons montré précédemment que PML stimule la dégradation des protéines mal repliées en favorisant leur SUMOylation. Ici, nous utilisons la PML effet de choc, par exemple, de la voie de dégradation altérée. PML ARNsi traitement prolongé la demi-vie de ATXN1 82Q-GFP dans la fraction de solides solubles (figure 2A). Aucun des changements évidents dans SR ATXN1 82Q-GFP sont détectées dans le contrôle ou les cellules PML siRNA-traitées (figure 2B et 2C).
Vingt heures après la transfection, les agrégats NLS-GFP LucDM deviennent visibles au microscope 5 - 15% des cellules HeLa, mais cela peut varier en fonction des quantités d'ADN qui sont transfectées (figure 3A). La demi-vie de SDS soluble dans NLS-GFP est LucDM 2 - 3 h (figure 3B et 3C). L'intensité de fluorescence des cellules transfectées diminue également au coursle temps lors du traitement CHX (Figure 4A et 4B). Six heures après le traitement CHX, l'intensité de fluorescence atteint un stade stable et cesse de diminuer (Figure 4A et 4B). Au même point du temps, soluble dans NLS-GFP LucDM est largement dégradé (figure 3B et 3C), ce qui suggère que la fluorescence résiduelle est générée à partir d' espèces agrégées résistants à la dégradation. Constamment, agrégée, mais non diffusée, la GFP reste dans les cellules 9 h après le traitement de CHX (figure 4C). Fait intéressant, la transfection en utilisant une plus grande quantité de NLS-LucDM-GFP plasmide génère des agrégats plus nucléaires, ainsi que l' intensité plus élevée de rester fluorescence, bien que le taux de dégradation est pas affectée (figure 4A et 4B). En utilisant soit SDS-PAGE suivie par western blot ou de la fluorescence de lecture, nous sommes en mesure de détecter l'inhibition de la dégradation NLS-LucDM-GFP par traitement MG132 ou PML ARNsi (figures 3C, 4A, 4B et 5).
Figure 1. Détection de ATXN1 82Q-GFP par microscopie par fluorescence et un détergent fractionnement. (A) Des cellules HeLa ont été transfectées avec ATXN1 82Q-GFP et colorées avec du DAPI. Les images individuelles et fusionnées sont affichées. Barre d'échelle = 10 pm. (B) Un diagramme montrant le fractionnement de détergent de Atxn1-82Q cellules exprimant comme décrit dans le protocole 2. Les marqueurs de poids moléculaire sont indiqués sur la gauche d'images western blot de ATXN1-ATXn 82Q. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure .
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. Figure 2. Dégradation du dosage ATXN1 82Q-GFP en utilisant un détergent fractionnement des cellules HeLa ont été précédemment traités avec le contrôle (-) ou PML siRNA (A et C) ou non-traitée (B). Les cellules ont été transfectées avec ATXN1 82Q-GFP et traitées avec CHX en l'absence ou en présence de MG132. Fractions de cellules de lysat ont été analysées par SDS-PAGE suivie par western blot (A, pour NS et SS fractions) ou un retard dosage du filtre (B et C, pour la fraction SR) en utilisant un anticorps anti-GFP. S'il vous plaît , cliquez ici pour afficher une version plus grande cette figure.
Figure 3. Analyse de la dégradation NLS-LucDM-GFP par fluorescence microscopy et Western blot. (A) des cellules HeLa transfectées avec NLS-LucDM-GFP ont été colorées avec du DAPI. Les images individuelles et fusionnées sont affichées. Barre d'échelle = 25 pm. Arrowhead indique une cellule avec des agrégats nucléaires. Cellules (B et C) HeLa ont été transfectées avec NLS-LucDM-GFP et la protéine sauvage luciférase de fusion NLS-LucWT-GFP (B), ou transfectées avec contrôle ou PML siRNA, suivie par transfection avec NLS-LucDM-GFP ( C). Les cellules ont été traitées avec MG132 CHX et comme il est indiqué. Des lysats de cellules entières ont été analysés par buvardage de Western en utilisant un anticorps anti-GFP. L' image est modifiée à partir de la publication précédente avec la permission 9. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4 fluorescent dosage sur microplaques pour la dégradation LucDM NLS-GFP. Des cellules HeLa ensemencées sur des plaques à 96 puits ont été transfectées avec 0,05 pg (A) ou 0,1 ug (B et C) NLS-GFP LucDM et traité avec de la chlorhexidine la présence ou l'absence de MG132. (A et B) , les intensités de fluorescence des puits ont été mesurées aux points temporels indiqués (valeurs moyennes ± écarts - types, n = 3). Des panneaux sur la gauche montrent la lecture de fluorescence d'origine, tandis que les panneaux de droite montrent les valeurs normalisées pour des lectures à temps 0 dans les groupes de traitement respectifs. La différence entre les groupes traités avec et sans MG132 ont été analysées par ANOVA à deux voies avec des mesures répétées. Les valeurs de P entre les deux groupes de traitement sont indiqués. (C) Les puits ont été examinés avant ou après le traitement de CHX 9 h, ou après le traitement CHX et MG132, par microscope à fluorescence. Pour mieux montrer les deux cellules avec brillant agrégé NLC-LucDM-GFP et ceux avec la protéine diffuse faible, la valeur gamma de 1,5 a été appliqué à toutes les images. Barre d' échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Un taux réduit de NLS-LucDM-GFP dégradation dans les cellules PML knockdown. Cellules HeLa préalablement traités avec le contrôle ou PML siRNA ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits. Dégradation des NLS-LucDM-GFP a été analysée comme décrit dans la figure 4 (ANOVA à deux voies; p <0,0001). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 6. Fluorescence de ATXN1 82Q-GFP reste inchangé sur la chasse de CHX. Des cellules HeLa ont été transfectées avec ATXN1 82Q-GFP. 24 heures après la transfection, la dégradation des ATXN1 82Q-GFP a été analysée comme décrit dans la figure 4. La figure montre la lecture de fluorescence originale. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7 fluorescent dosage sur microplaques pour la dégradation de LucDM-GFP. Cytoplasmiques des cellules HeLa ensemencées sur des plaques à 96 puits ont été transfectées avec 0,1 pg LucDM-GFP traité avec CHX en présence ou en l' absence de MG132. Les résultats ont été analysés comme décrit dans la figure 4 (deux ANOVA, p <0,0001).tp: //www.jove.com/files/ftp_upload/54266/54266fig7large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Tableau 1 .: paramètres de mesure sur le lecteur de microplaques à fluorescence.
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Discussion
Les mécanismes qui régulent la dégradation des protéines mal repliées sont essentiels pour le maintien de l'homéostasie des protéines cellulaires, et ils représentent probablement des cibles de médicaments utiles pour le traitement de maladies neurodégénératives et d'autres maladies en protéines repliement. Ici, les dosages qui examinent la dégradation de protéines mal repliées sont décrits, en utilisant une protéine pathogène ATXN1 (ATXN1 82Q) et un mutant nucléaire localisée de la luciférase (SLN LucDM) à titre d'exemples.
Pour examiner la dégradation ATXN1 82Q, qui a une demi-vie de plus de 18 heures, nous avons introduit une nouvelle méthode en combinant le fractionnement cellulaire avec CHX classique 9. Cette méthode a révélé un jeu beaucoup plus rapide des espèces mal repliées des ATXN1 82Q au fil du temps. En outre, l'introduction de LucDM fournit un substrat modèle mal repliées pour étudier les mécanismes de dégradation générale de protéines mal repliées. Pour répondre à la nécessité d'un système destiné à détecter HTS dégradation des protéines mal repliées dans une cellule de mammifères, nous avons développé un test de dégradation rapide pour LucDM par fluorescence lecteur de microplaques. Le système sert comme un outil puissant pour les écrans chimiques et génétiques.
La protéine ATXN1 82Q est présent dans NS, SS, et les fractions SR de lysats cellulaires. Les fractions SR deviennent de plus en plus répandue pendant la culture prolongée après la transfection, ce qui suggère qu'il est sous une forme qui est difficile à être vénéré ou dégradé, par exemple, les fibrilles amyloïdes. La génération d'espèces toxiques ou mal repliées des agrégats qui ne peuvent pas être facilement dégradé peut bloquer les voies de dégradation des protéines, ce qui empêche l'analyse de la machinerie cellulaire endogène contrôlant les protéines aberrantes 24, 25,26. Pour éviter la formation d'une grande quantité de SR, nous commençons la chasse de CHX 4-5 h après la transfection initiale. Nous avons constaté que cela est essentiel pour l'analyse des conditions cellulaires qui peuvent retarder la dégradation de la fraction SS. En plus du temps de la transfection, il est également crucial de ne pas tropwhelm cellules en exprimant la protéine ATXN1 82Q à des niveaux très élevés. Si non ou très lente dégradation est observée pour toutes les fractions, moins de quantité de ATXN1 82Q plasmide doit être utilisé pour la transfection. Idéalement, le test doit être terminé dans les 12 heures que les cellules apoptotiques sont remarqués au-delà de ce point de temps. Dans la figure 2A, la quantité de SS ATXN1 82 dans les cellules témoins est très différente de celle dans les cellules PML siRNA traitées aussi courtes que 8 heures. Attention doit être prise si une différence dans le groupe traité est observée seulement au-delà de 12 heures, comme elle peut être causée par d'autres facteurs qui influent sur la viabilité des cellules plutôt que la dégradation des protéines.
NS par rapport à ATXN1 82Q, 82Q ATXN1 dans la fraction SS est rapidement éliminé, ce qui indique qu'il représente une espèce mal repliées qui peuvent être facilement dégradées par le protéasome (figure 2A). En revanche, les niveaux de SR ATXN1 82Q restent inchangées par rapport au même cours du temps (figure 2B), confirmantqu'il est une espèce non-dégradables. Cependant, l' analyse de la fraction SR doit être important pour les mécanismes qui élimine directement les agrégats cytoplasmiques (par exemple, autophagie) à analyser ou d' affecter la formation de ces agrégats. Sensiblement, MG132 semble être moins efficace dans la prévention de la diminution de la fraction ATXN1 82Q SS. Cela peut être causé par l' élévation des niveaux de ROS sur l' inhibition du protéasome 27, ce qui pourrait favoriser l'agrégation des ATXN1 82Q.
Un grand avantage du dosage LucDM-GFP est qu'il peut être adapté à l'analyse de HTS en utilisant un lecteur de plaques à fluorescence. Nous avons d'abord essayé de développer un système de HTS pour ATXN1 82Q. Cependant, parce que seule une petite fraction de la protéine globale ATXN1 82Q se dégrade au fil du temps, la fluorescence des cellules exprimant la GFP-ATXN1 82Q reste largement inchangée au cours de la chasse de CHX (Figure 6). D'autres protéines mal repliées avec une longue demi-vie d'ensemble aurait des problèmes similaires avec Fluor en temps réeldosage Escent. En revanche, une diminution marquée de la protéine globale NLS-lucDM-GFP est observée (figures 3 et 4). Cette caractéristique, en même temps que sa demi-vie courte (2-3 heures), permet à ce substrat chaperon modèle pour être facilement détectée par spectroscopie de fluorescence. Dans des études précédentes, la protéine GFPu, GFP fusionnée à un signal de dégradation constructive (CL-1), a été largement utilisé en tant que journaliste pour la fonctionnalité du système ubiquitine-protéasome 28,29. Il est également une protéine mal repliée porteuse de premier plan dans les modèles cellulaires et animaux 30. Par rapport à GFPu, un avantage de l'analyse de la dégradation décrite ici est que la luciférase mal repliée est un substrat modèle de chaperon largement utilisé. En examinant l' activité de la luciférase, on peut facilement évaluer les conformations natives, dénaturés et repliés de la luciférase in vitro et in vivo. Ainsi, notre système sert de plate-forme très utile pour connecter la liaison de protéines et de pliage des essais avecSystème de dégradation cellulaire en utilisant le même substrat 9.
Grâce à la mesure en temps réel la fluorescence les valeurs suivantes peuvent être obtenues: L'intensité de fluorescence à partir, stable restant intensité de fluorescence, et la demi-vie de la protéine. Ces valeurs sont corrélées respectivement avec la quantité de protéine totale avant la chasse, la quantité de protéines résistantes à la dégradation, et le taux de renouvellement des protéines. Par conséquent, il est possible d'utiliser dosage par fluorescence en temps réel pour faire une analyse complète des niveaux et la dynamique des différentes espèces de protéines mal repliées. De temps en temps, une variation relativement importante de la fluorescence de départ parmi les répétitions est observée (par exemple, la figure 5, panneau de gauche). Ceci est susceptible d'être provoquée par la variabilité de l'ensemencement des cellules ou la transfection. Cependant, malgré la différence de l'intensité de fluorescence de départ, le signal de toutes les répétitions diminue à un rythme très similaire. Normalisation des signaux from à chaque fois des points à l'intensité au moment 0 peut réduire la variation du puits à puits et reflète plus fidèlement les taux de dégradation (figure 4A, 4B et la figure 5, à gauche par rapport à panneaux de droite).
En plus de la forme nucléaire, nous avons également analysé cytoplasmique LucDM-GFP. Cytoplasmiques LucDM-GFP présente un schéma de dégradation similaire , si ce pourcentage plus élevé de la fluorescence restante a été observée lorsque la même procédure expérimentale a été appliquée comme décrit dans le protocole n ° 4 (figure 7). La dégradation peut être complètement inhibée MG132, indiquant que ce test peut être utilisé pour surveiller cytoplasmique contrôle de la qualité des protéines par dégradation par le protéasome. Pour les études ultérieures, il serait intéressant d'étudier si LucDM-GFP peut être appliquée à d' autres compartiments cellulaires, par exemple, les mitochondries ou le reticulum endoplasmique, lorsqu'ils sont fusionnés à des signaux spécifiques de localisation du compartiment cellulaire.
Comme indiqué dans le protocole de dosage fluorescent à base, il est crucial d'utiliser à moyen faible fluorescent pour réduire fond fluorescent et d'utiliser mélange maître de l'ADN et transfection réactif pour réduire les variations de transfection-puits à puits. Le contrôle de gain peut être réglé sur certains lecteurs de plaques fluorescentes. Il est important de régler le gain en mode manuel au lieu d'optimiser et d' utiliser la même valeur dans l'ensemble du test (tableau 1). La valeur du gain peut être ajustée pour optimiser la lecture de la fluorescence de la GFP cellulaire aussi longtemps que la lecture ne va pas au-delà de la limite de détection.
Au stade actuel, nous sommes toujours comptons sur transfection pour exprimer LucDM. Pour réduire la variation et de simplifier l'analyse pour HTS, un objectif futur est d'établir une lignée cellulaire stable avec l'expression inductible de LucDM. Cependant, comme microplaque et milieu de culture ont tous deux la fluorescence de fond, il est crucial d'avoir le signal de GFP significativement plus élevé que de fond. UNFORreusement, les lignées stables que nous avons établis récemment ont tous une faible expression de LucDM. Ainsi, le développement d'une ligne stable avec une plus grande expression de la protéine permettra d'améliorer considérablement l'efficacité de dépistage.
Les essais de dégradation décrits ici peuvent également être appliqués à d'autres protéines mal repliées. En raison de la fonction dynamique des protéines mal repliées, ces essais doivent être couplée à d'autres analyses pour découvrir les mécanismes de contrôle de la qualité des protéines en profondeur. Ces analyses comprennent la mesure des niveaux d'état stationnaire d'agrégats et de leurs partitions dans les différentes fractions de cellules (figure 1) et l' analyse des protéines de pliage ou l' agrégation en utilisant des protéines recombinantes purifiées. Ces essais permettront de distinguer les effets directs ou indirects de la drogue ou de l'expression génique sur la dégradation des protéines ou de l'agrégation.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M8699 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | 45000232 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Boehringer Mannheim | 4693159001 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Living Colors GFP Monoclonal Antibody | Clonetech | 632375 | |
| Anti-Actin mAb Rabbit, IgG | Sigma-Aldrich | A45060-200UL | |
| Amino acids | Sigma-Aldrich | Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium | |
| Olympus IX-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX71/IX81 | |
| 96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom | Sigma-Greiner | 89135-048 | |
| Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO | TECAN | Infinite 200® PRO | |
| Cellulose acetate membrane 0.2 µm | Sterlitech | CA023001 | |
| Prism 5 | GraphPad | Statistical analysis software |
References
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