Introduction
Under mitos, är kromosomer replik genomet organiseras på cell ekvatorn för att säkerställa jämn fördelning av systerkromatider över nybildade dottercellerna. Kromosom positionering och segregation förmedlas genom deras fastsättning spindel mikrotubuli som härrör från två motsatta centrosom. Förutom att säkerställa trogen kromosom distribution, orientering den mitotiska spindeln dikterar också celldelningsplanet 1. Samordnad orientering celldelning är viktigt under många utvecklingsstadier och för vävnadshomeostas 2. Specifikt kan regleras mitotiska spindeln positionering resultera i den asymmetriska fördelningen av cellulära innehåll eller ens producera dotterceller av olika storlekar 2. Mitotiska spolen montering och orientering börjar i profas och iscensatt av ett komplext samspel mellan samverkande och motverkande kraft-generatorer 3,4. De genererade krafterna består av Both drag och tryckkrafter. Dessa krafter härstammar både från spindel kontakter med cell cortex liksom inifrån spindeln, och kan genereras av mikrotubuli dynamik samt genom molekylära motorer och tvärbindare (Figur 1).
Tryckkrafterna kan genereras när mikrotubuli växa mot stela strukturer såsom cell cortex. Beroende på den totala motståndskraft som genereras i systemet, kan detta resultera i omplacering av den mitotiska spindeln (låga krafter) eller utlösa mikrotubuli buckling eller katastrof (stora krafter) 5-8. Mängden kraft som kan genereras genom att trycka beror på mikrotubuli längd, eftersom längden är en stark determinant av mikrotubulus-buckling 9. Dessutom kan mikrotubuli som härrör från en centrosom trycka mot den andra centrosom, en mekanism som har föreslagits för att driva centrosom separation i tidig profas 3,10.
i adsättning att driva krafter som genereras genom att odla mikrotubuli, slutar mikrotubulus bringa cellen cortex kan också förmedla dragkrafter 11. Studier från flera laboratorier har visat att den kontrollerade aktiviteten av kortikala kraftgeneratorer krävs för den asymmetriska placeringen av mitotiska spolar in vivo 1. Väsentligt för dessa dragkrafter är cortex-lokaliserad cytoplasma dynein (nedan kallat dynein), ett minus-ände riktad mikrotubuli motorprotein 8,12,13. Till exempel, i knoppande jäst, laterala interaktioner av kortikal dynein med mikrotubuli gitter resulterar i motorberoende mikrotubuli glider längs cortex 14. Emellertid kan kortikala dragkrafter även genereras genom förmågan hos dynein att bilda end-on bilagor till depolymerisera mikrotubuli 8. Den energi som genereras av mikrotubuli krympning kan leda till krafter som är i allmänhet en storleksordning högre (~ 50 PN (referens 15 16)). End-on fastsättning av kortikal dynein att depolymerisera mikrotubuli främjar spindelpositioneringen i knoppande jäst 17 och C. elegans 13. Om både motorberoende glidning och mikrotubuli depolymeriseringsprodukter drivs kortikala dragkrafter kan samarbeta eller är ömsesidigt uteslutande in vivo är för närvarande okänd.
Förutom mikrotubuli tryckkrafter och dynein medierad kortikala dragkrafter är centrosom positionering styrs inifrån den mitotiska spindeln av ett stort antal andra proteiner. Kinesin-5 motorer, till exempel, existerar som tetramerer som kan tvärbinda antiparallella interpolar mikrotubuli, vilket resulterar i genereringen av yttre glidkrafter 18-20. Medlemmar av kinesin-5 motor familj krävs för centrosom separation och bipolär spindelenheten i alla eukaryoter studerade med undantag för C. elegans (översikt i referens 21).
Vidare är diffunderbara tvärbindare av Ase1 / PRC1 familjen också kända för att lokalisera till överlappande mikrotubuli regioner av interpolar mikrotubuli in vivo och in vitro 22-27. De krafter som alstras Ase1 driven expansion av den överlappande mikrotubuli-regionen är tillräckligt stor för att uppväga kinesin-14 förmedlade glid krafter in vitro 28,29. I celler, är Ase1 / PRC1 krävs för stabil bildning av överlappande mikrotubuli regioner i spindel mellanzon 25-27,30, vilket tyder på att de krafter som alstras diffunderbara tvärbindare kan bidra avsevärt till spindel organisation. Slutligen styrkor från den mitotiska kromatin och kinetokorer påverkar mitotiska spindelenhet och positionering via olika vägar 3. Eftersom dessa komponenter är inte en del av beredning analyser som beskrivs här, kommer de inte att diskuteras i detalj.
jove_content "> Olika teorier finns om hur de olika molekylära komponenter och krafter som beskrivs ovan samarbeta spindelenhet och positionering, men vi är fortfarande långt ifrån en kvantitativ förståelse. Förutom försök i levande celler, experiment in vitro med renade komponenter ger en kraftfull väg för att nå detta mål. här presenterar vi en visuell guide till en anpassad och utökad version av den nyligen publicerade metoder (Roth et al. 31), i vilken grund spindlar rekonstitueras i vatten-i-olja emulsionsdroppar, som börjar med en minimalt antal komponenter. Använda mikroflödesteknik, är sfäriska droppar genereras med storlekar som är jämförbara med mitotiska celler. inom dessa droppar, kan renade centrosom och tubulin kombineras för att studera mikrotubuli aster dynamik, styrke och aster-aster interaktioner. Genom införa kortikala (såsom dynein) och inter-polära (t.ex. kinesin-5 / Ase1) kraftgeneratorer, virekonstruera allt mer komplexa spindelliknande strukturer som börjar likna in vivo situationen.Protocol
1. Beredning mikrofluidik Chips
OBS: För bottom-up studie av spindelenhet, är sfäriska vatten-i-olja emulsionsdroppar som används. Dessa är vattenhaltiga mikrodroppar separeras från den omgivande oljefasen genom ett monoskikt av fosfolipider och tensid. Dessa emulsionsdroppar produceras inom mikroflödes polydimetylsiloxan (PDMS) marker. Förändringar i kanalgeometrier och flödeshastigheter kan användas för att avstämma droppstorlek. I mikroflödes utformning beskrivs här, är dropparna alstras med en diameter av ca 15 ^ m för att efterlikna den geometriska inneslutning av en däggdjurs mitotisk cell.
- Fotomask Design och Mold Fabrication
- Utforma en fotomask som innehåller tre inloppskanalerna 31. Inloppskanalen 1 ansluter till vattenfasen, som innehåller de droppinnehållet (se avsnitt 3 "Beredning grundläggande mikrotubuli astrar"). Inloppskanalen 2 ansluts till oljefasen (se avsnitt 2.1 "Lipid / olja-alfase beredning "). Använd inloppskanalen 3 för att späda emulsionsdroppar med ytterligare lipid / oljefasen före observation (tillval) (Figur 2a-b).
OBS: Samtliga inloppskanalerna följs av ett dammfilter (en labyrint av 2 um kanaler) för att fånga damm, PDMS partiklar och (protein-) aggregat och att hindra dem från att blockera mikroflödessystem kanaler (figur 2d). Kanaler är 75 um breda och lipid / oljefasen och vattenfasen träffas på en 12,5 um bred korsning där emulsionsdroppar bildas (figur 2c). - Beställa och få tryckta fotomasker på ett filmsubstrat, med en negativ polaritet (fotomasken blir mörkt med genomskinliga utformade strukturer).
- Utforma en fotomask som innehåller tre inloppskanalerna 31. Inloppskanalen 1 ansluter till vattenfasen, som innehåller de droppinnehållet (se avsnitt 3 "Beredning grundläggande mikrotubuli astrar"). Inloppskanalen 2 ansluts till oljefasen (se avsnitt 2.1 "Lipid / olja-alfase beredning "). Använd inloppskanalen 3 för att späda emulsionsdroppar med ytterligare lipid / oljefasen före observation (tillval) (Figur 2a-b).
- mögel Fabrication
- Fabricera formar från spin-beläggning SU-8 3025 fotoresist på en 4 tums kiselskiva med hjälp av en spinnbeläggnings (500 rpm, 10 sekunder, följt av 1800 rpm, 45 sek) i en renrumsmiljö.
- Exponera SU-8 belagdkiselskiva genom fotomasken. Utveckla wafers enligt tillverkarens instruktioner för att skapa kanaler för ~ 40 pm tjocklek.
- Att göra en mikroflödessystem chip
- Blanda 10 delar PDMS pre-polymer med en del härdare (totalt ~ 40 gr) i en båtliknande kärl med hjälp av en plastspatel. Place PDMS innehållande båtliknande kärl i en vakuumkammare för ~ 30 min. för att ta bort luftbubblor. Linda aluminiumfolie runt formen för att bilda en kopp med ~ 1 cm upprättstående kanter.
- Häll PDMS (~ 75% av den totala volymen) i formen, lämna i en vakuumkammare för en annan ~ 30 min. (För att avlägsna luftbubblor) och härda i en timme vid 100 ° C i en ugn.
- Spin-coat de återstående PDMS på glasskivor (5 sek vid 200 rpm följt av 30 sekunder vid 4000 varv per minut) följt av härdning under en timme vid 100 ° C. Ta bort damm från glasskivor med tryckluft / N2 -flow är inte nödvändigt förrengöring.
OBS: De PDMS belagd objektglas kan användas både för mikrofonrofluidic chip och flödescellproduktion (se även 2,2). - remsor försiktigt PDMS bort från formen med ett rakblad och slå hål (0,5 mm för inlopp, 0,75 mm för utlopp) .Corona behandla mikroflödes chip och en PDMS-belagda objektglas med hjälp av en laboratoriecorona yta treater under några sekunder .
- Placera mikroflödeschip på glasobjektglas (kanaler nedåt) och baka flisen o / n vid 100 ° C (figur 3a). Lagra mikroflödessystem marker för flera månader i en dammfri miljö.
2. Mikroflödesinställning
OBS: Vatten-i-olja-emulsionsdroppar genereras med användning av en mikrofluidik setup och mikroflödessystem chips beskrivna ovan. Sammansättningen av lipid / oljefasen kan varieras beroende på de experimentella kraven. Olje solubiliseras lipider kommer att bilda ett monoskikt vid vatten-olja-gränssnittet med sina polära huvudgrupperna mot vattnet inuti. I syfte till målproteiner(T.ex. dynein) i droppen gräns, låga mängder av biotinyl-fosfatidyletanolamin (biotinyl-PE) lipider kan tillsättas. Detta gör att rekryteringen av biotinylerat dynein (se avsnitt 4.1 "dynein inriktning till droppen cortex") via streptavidin-medierad multimerise. Dropparna är stabiliserade genom tillsats av ett ytaktivt medel och lagras i PDMS-belagda flödesceller.
- Lipid / oljefasen Förberedelse
- Blanda kloroform-upplöstes 1,2-dioleoyl- sn- glycero-3-fosfo-L-serin (DOPS) och biotinyl-PE-lipiderna i en 4: 1-molförhållande i ett glasrör med användning av glaspipetter (utför skölj pipetter med kloroform innan användning). Förbereda totalt ~ 250 | j, g lipider, vilket resulterar i en lipidkoncentration av ~ 0,5 mg / ml.
- Noggrant torka lipidblandningen med N 2 -flow och därefter i en vakuumkammare för ~ 1 timme. Lös de torkade lipider i mineralolja och 2,5% tensid till 0,5 mg / ml (se ~ 500 l).
- Placera provet lipid / olja i enultraljudbad och sonikeras under 30 min. vid 40 kHz till helt upplösa lipider.
- Flow-cell Framställning
- Spin-päls PDMS (se även avsnitt 1.3) på täckglas (5 sekunder vid 200 varv per minut, följt av 30 sekunder vid 4000 varv per minut) och objektglas (5 sek vid 100 rpm följt av 30 sek 1500 rpm) för att deponera homogent skikt av PDMS.
OBS: För optimal bildkvalitet, se till att använda täckglas med en tjocklek som matchar mikroskop målet. I det här fallet: 1,5 (~ 0,17 mm). - Bota PDMS-belagda täckglas och objektglas under 1 timme vid 100 ° C i en ugn. Gör flödes celler genom att noga avstånd (~ 2 mm) tunna skivor av laboratorieförseglingsfilmen (~ 3 mm i bredd) på PDMS-belagda glas diabilder. Vid förvaring i en dammfri miljö, kan kanaler som inte har använts användas vid andra tillfällen.
- Täck flödes cellerna med PDMS-belagda täckglas och tätning genom smältning laboratorieförseglingsfilmen ~ 1 min. vid 100 ° C, tryckförsiktigt (figur 3c). Stäng laboratorieförseglingsfilmen -glass-gränser med valap (Figur 3c). Store flödes celler för flera månader i en dammfri miljö.
- Spin-päls PDMS (se även avsnitt 1.3) på täckglas (5 sekunder vid 200 varv per minut, följt av 30 sekunder vid 4000 varv per minut) och objektglas (5 sek vid 100 rpm följt av 30 sek 1500 rpm) för att deponera homogent skikt av PDMS.
- PDMS Cup Framställning
- För långsiktig avbildning, göra en PDMS kopp, genom att stansa ett hål 4 mm diameter i en del av PDMS (~ 3 mm tjock)
- Corona-behandla PDMS skiva och en PDMS belagt täckglas och placera dem ovanpå varandra. Baka PDMS cup o / n (vid 100 ° C) (figur 5a).
- Emulsionsdroppbildning
- Övervaka droppbildning på en inverterad ljus-fält mikroskop. Anslut tryckstyrenheten till mikroflödeschip med användning av PEEK-rör (diameter: 510 ^ m (yttre) och 125 | j, m (inre)) (figur 3a). Fyll mikroflödessystem chips helt med lipid / oljefasen från inloppet 2.
- Införa MRB80-baserade vattenfasen (se avsnitt 3 "Beredning grundläggande mikrotubuli astrar4;) från inloppet 1. Kontrolldroppstorleken genom förändrade lipid / olje-fas och vatten-fas tryck för att skapa droppar av ~ 15 | im i diameter (figur 3b).
OBS: Genom att använda denna inställning, använd ~ 800 mbar för lipid / oljefasen och ~ 200 mbar för vattenfasen för att skapa droppar av önskad storlek. - Efter att ha fått önskad droppstorlek och önskad mängd (~ 10 l per prov), samla droppar från utloppskanalen och belastning i flödescellen (fyll flödescellen helt).
- Stänga ändarna av flödescellen noggrant med användning valap (ofullständigt slutna flödesceller kan resultera i omfattande förflyttning av dropparna, vilket gör det svårt att avbilda dem). Dessutom förhindrar bildandet av luftbubblor, vilket resulterar i dropprörelse.
- Skölj PEEK rör i stor utsträckning med isopropanol före och efter användning för att förhindra provkorskontaminering och igensättning.
3. rekonstitution Grundläggande mikrotubulus Asters
OBS: Dropp innehållet kan varieras beroende på de experimentella kraven. Alla buffertar är MRB80 baserade (80 mM PIPES, 1 mM EGTA, 4 mM MgCl2 (pH 6,8)), och samtliga prover bereds på is. I allmänhet, droppar innehåller alltid centrosom, komponenter som krävs för mikrotubuli polymerisering, en syrefångare systemet och blockerande medel (se avsnitt 3.1). Mikrotubuli kraft-generatorer och nödvändiga kofaktorer och inriktnings-faktorer kan inkluderas om så önskas (se avsnitt 4.1 och 4.2).
- Allmän inställning för aster bildning i emulsionsdroppar (Figur 3d)
- Förbered glukosoxidas (20 mg / ml glukosoxidas i 200 mM DTT och 10 mg / ml katalas) blandning i förväg och förvara i små portioner vid -80 ° C.
- Förbered en "blockerande mix" som innehåller κ-kasein, bovinserumalbumin (BSA), Tween-20 och fluorescerande dextran (som en neutral markör) (se tabell 1) i förväg och lagra i små aliquots vid -80 ° C. Förhindra upprepade frysnings-upptiningscykler. Se till att alla komponenter är nygjord.
- Rena centrosom från humana lymfoblastiska KE37 cellinjer som beskrivs av et al. Moudjou 32 och förvara vid -150 ° C i små portioner.
- Tina centrosom vid rumstemperatur och inkubera vid 37 ° C under ~ 20 min. före användning för att säkerställa korrekt mikrotubuli kärn.
OBS: Detta främjar mikrotubuli kärn under experimentet. - Under tiden, förbereda "assay mix", innehållande tubulin (fluorescerande och "mörka"), guanosin trifosfat (GTP), en syrefångare system (glukos, glukos-oxidas, katalas och 1,4-ditiotreitol (DTT)), molekylkraftgeneratorer (t.ex. mikrotubuli motorer / tvärbindare), adenosintrifosfat (ATP) och ett ATP-regenererande system (fosfoenolpyruvat (PEP), pyruvatkinas (PK) och laktatdehydrogenas (LDH)) på is (se tabell 2).
- Pre-kylaairfuge rötor på is. Centrifugera ner provet i den kylda airfuge rotorn (30 psi under 3 min) .Add förvärmda centrosom (optimera mängden centrosom att sträva efter små droppar innehållande 1-2 centrosom).
- Använda den kombinerade blandningen för att framställa emulsionsdroppar med användning av de metoder som beskrivs i avsnitt 2.3.
| Komponent | förrådskoncentration | Slutlig koncentration (i analys) | Volym | Kommentar |
| Dextran-647 nm | 75 ^ M | 3,75 uM (0,6 ^ M) | 5 pl | |
| κ-kasein | 20 mg / ml | 12,5 mg / ml (2 mg / ml) | 62,5 | il | |
| Tween-20 | 5% | 0,375% (0,06%) 7,5 | il | ||
| BSA | 200 mg / ml | 12 mg / ml (1,9 mg / ml) | 6 | il | |
| MRB80 | 19 | il | |||
| 100 pl slutlig | Butik i 2 | il alikvoter |
Tabell 1: Beståndsdelar i 'Blockering Mix' Beståndsdelar i blockeringsblandning, som krävs för att rekonstituera spindelliknande strukturer i vatten-i-olja-emulsionsdroppar.. För beskrivning, se huvudtexten avsnitt 3 "Beredning grundläggande mikrotubuli astrar". För mer information om material, se "Material tabell.
| Komponent | lager concentration | slutlig koncentration | Volym | Kommentar |
| blockerande mix | 1,6 | il | |||
| tubulin | 500 | iM | 30 ^ M | 0,6 | il | |
| Tubulin-488/561 | 50 ^ M | 3 ^ M | 0,6 | il | |
| GTP | 50 mM | 5 mM | 1,0 | il | |
| Dynein-TMR | 178 nM | 30 nM | 1,7 | il | |
| streptavidin | 5 mg / ml | 200 nM | 0,4 | il | För kortikal dynein endast |
| Kinesin-5 | 1,6 mM | 80 nM | 0,5 ^ | |
| ATP | 25 mM | 1 mM | 0,4 | il | För motorer endast |
| PEP | 0,5 M | 25,6 mM | 0,5 ^ | För motorer endast |
| PK / LDH | 800 U / 1100 U | 23 U / 32 U | 0,3 | il | För motorer endast |
| Ase1-GFP | 400 nM | 80 nM | 2,0 | il | |
| Glukos | 2,5 M | 50 mM | 0,3 | il | Sista steget |
| Glukos-oxidas | 50x | 1.0x | 0,3 | il | Sista steget |
| MRB80 | x | |||
| 9 | il slutlig |
Tabell 2: beståndsdelar av "Assay Mix". Material tabell.
4. Introduktion spindelenhet-faktorer
OBS: I de analyser som beskrivs här, ett grönt fluorescerande protein (GFP)-märkt stympad version av S. cerevisiae dynein användes som artificiellt dimeriseras med hjälp av en amino-terminal glutation S-transferas (GST) -taggen 33. Detta protein renas genom en affinitetsmarkör som innehåller två kopior av protein A IgG-bindande domän. Varianten som används här är märkt med en tetrametylrodamin (TMR) etikett på den karboxiterminala och den N-terminala SNAP-taggen används för att biotinylera de renade proteinerna. För konstruera detaljer, se Roth et al 31. för renings detaljer, se Reck-Peterson et al. 33. GFP-biotin-dynein-TMR kan riktas till dropp cortex genom bildandet av biotin-streptavidin-komplex som länkar dynein att biotinyl-PE lipider (figur 3e).
- Dynein Targeting till Droplet Cortex
- Inkluderar GFP-biotin-dynein-TMR in i "assay mix" (se tabell 2) vid en slutlig dropp-koncentration av 30 nM. Inkluderar streptavidin till "assay mix" (se tabell 2) vid en slutlig dropp-koncentration av 200 nM.
OBS: dynein beror på ATP-hydrolys för stegvis rörelse på mikrotubuli. Därför inkluderar ATP och ett ATP-regenererande system (innehållande PEP och PK / LDH) i 'assay mix "(se tabell 2).
OBS: Rekombinant fullängds S. pombe GFP-Cut7 (kinesin-5) tillhandahölls vänligen av Diez lab (Centrum för Molekylär bioteknik, Technische Universität Dresden, Dresden, Tyskland), se. Rekombinant full lä ngd histidin-taggade S. pombe GFP-Ase1 tillhandahölls vänligen av Jansons lab (Wageningen University, Wageningen, Nederländerna) och sattes till "analys mix" vid koncentrationer på 80 nM.
- Inkluderar GFP-biotin-dynein-TMR in i "assay mix" (se tabell 2) vid en slutlig dropp-koncentration av 30 nM. Inkluderar streptavidin till "assay mix" (se tabell 2) vid en slutlig dropp-koncentration av 200 nM.
5. Imaging
OBS: Under experimentet kan mikrotubulus tillväxt regleras genom att ändra temperaturen. Vid valet av de avbildningsbetingelser, kompromisser måste göras mellan högkvalitativ avbildning och möjligheten att övervaka spindelenhet under långa tidsperioder. Att jämföra kinetiken hos spindelbildning under olika förhållanden, kan droppar med olika innehåll blandas och avbildas i samma flödeskanalen.
- Basic Imaging Inställningar
- Bild i en temperaturkontrollerad miljö med hjälp av en sluten kammare. Visualisera individuella mikrotubuli efter ~ 30 minuter vid 26 ° C. Medan avbildning, främja mikrotubuli-tillväxt genom att öka temperaturen upp till ca 30 ° C.
ANMÄRKNING: Snst ä llningar nedan är specifika för vår mikroskop setup och kan variera med olika system och olika operativsystem. Alla de analyser som beskrivs här avbildas på en motoriserad inverterat system med en roterande skiva konfokala huvud och manövreras med bildbehandlingsprogram såsom Andor iQ 3,1. Skaffa alla bilder med en 100X olja immersionsobjektiv och EMCCD kamera. - Ställ excitation lasrar 488, 561 och 641 nm till ungefär ~ 10% intensitet. Gå till "förvärv" panel, klicka på "AOTF fliken och skjut laser intensiteter till 10%. Klicka på "register" för att lagra inställningarna.
- Z -projections, ta travar med 1 pm intervaller (~ 20 bilder / dropp). Gå till huvud "kamera" panel, klicka på "redigera z 'och ange" Z steg "till 1,0. Klicka på" nästa "för att lagra inställningarna.
- Ställ maximal linjär EM-vinst genom att klicka på fliken "kameran" i "förvärv" panelen och skjut EM förstärkningsfältet 300. Set exponeringgånger till 200 msek i samma flik. Klicka på "register" för att lagra inställningarna.
- Bild i en temperaturkontrollerad miljö med hjälp av en sluten kammare. Visualisera individuella mikrotubuli efter ~ 30 minuter vid 26 ° C. Medan avbildning, främja mikrotubuli-tillväxt genom att öka temperaturen upp till ca 30 ° C.
- Live Imaging
- För levande avbildning, med hjälp av kontrollerna programvara gör z -projections varje 2 min. under varaktigheten av 1-2 h genom att minska exponeringstider till ~ 100 msek. (som beskrivs i 5.1.4) och öka z -intervals till 2 pm (som beskrivs i 5.1.3). Ställ in tidsserien i huvud "kamera" panel, klicka på "repeat t" och inställd på två minuter. intervall för en total tid av 120 min.
- För levande analyser, använd en PDMS kopp istället för en vanlig flödescell för att säkerställa att dropparna är så orörlig som möjligt.
- Kombinerad Imaging av 2 Villkor
- Producera droppar med användning av mikrofluidik och lagra på toppen av en PDMS belagd glasskiva på is. Detta förhindrar mikrotubulus kärnbildning tills den andra uppsättningen av små droppar har bildats. Före framställning av den andra uppsättningen av droppar, skölj PEEK rör och mikroflödes chip medMRB80 och helt fylla mikroflödes chip med lipid / oljefasen.
- Generera små droppar med och utan fluorescerande dextran (eller med användning av dextran med olika våglängds fluoroforer) för att diskriminera mellan små droppar med olika färger. Efter att producera den andra omgången av droppar, blanda försiktigt dropparna genom att pipettera och ladda in en enda flödescell / PDMS-cup.
- Bildanalys.
- Analysera bilder med Fiji (öppen källkod tillgänglig på nätet) 34.
- För levande analyser konvertera staplar i hyperstacks använda "image" - "hyperstacks" - "stack till Hypers". Ställ in rätt antal z-skivor och tidsramar.
- För att göra z-prognoser, välj "bild" - "stackar" - "z-projektet. Välj "max intensitet" projektion.
- För 3D-rekonstruktioner, först gå till "image" - "egenskaper" och ange rätt pixel med pixel höjden, voxel djup och frAME intervall. Klicka på "OK". Välj "image" - "stackar" - "3D-projektets, kontrollera" Interpolera "rutan och klicka på" OK ".
Representative Results
De metoder som presenteras i de föregående avsnitten medge rekonstitution av spindelliknande strukturer med ökande komplexitet med hjälp av den geometriska inneslutning av vatten-i-olja-emulsionsdroppar. Detta avsnitt beskriver representativa resultat som kvalitativt visar förmågan hos dessa analyser.
Under mitos, när den bipolära spindeln är monterad, celler runda upp för att bilda sfärer med en diameter på cirka 15 ^ m, uppmätt för humana celler. Denna egenskap mitotiska cellform ger en geometrisk gräns som både begränsar och styr spindelstorlek och orientering 35,36. Mikroflödesteknik, ge en nivå av geometrisk inneslutning som exakt liknar den situation som rådde i levande celler och därför tillåter bottom-up rekonstruktion av mitotiska spolar in vitro.
(figur 4a, vänstra panelen). Efter ca 20 till 30 min, de första mikrotubuli blir synliga och centrosom diffusion blir begränsas så mikrotubuli växa mot cortex i alla riktningar. Asters med mikrotubuli av mellanliggande längd (ungefär 50% av den dropp diameter) kan (steriskt) repellerar varje annan, med mikrotubuli driver mot varandra, de andra centrosom och cortex. Detta resulterar i en typisk "bipolär" spindelliknande arrangemang med de två centrosom motsatta varandra (figur 4a, mellersta panel). När mikrotubuli blir längre än ~ 50% av droppen-diameter, få de centrosom skjuts vidare till motsatta gränser droppen, med mikrotubuli växer längs dropp cortex (figur 4a, högra panelen). Det är viktigt att notera att mikrotubuli tillväxttakten i dessa analyser är mycket känsliga för både temperatur och tubulin-koncentrationer. Dessa parametrar kommer därför starkt påverka den tid då kärn först observeras och när steady state aster positioner uppnås.
I celler, kortikala dragkrafter som alstras genom bildandet av bärande bilagor mellan mikrotubuli plus-ändar och cortex associerade dynein. I djurceller, denna förening beror på Gαi / LGN / NuMA komplex, som är riktad till plasmamembranet via N-terminal myristoylering av Gαi en. I dessa beredning analyser, är kravet på Gαi / LGN / NuMA komplex kringgås genom direkt koppling dynein till biotinylerade lipider genombildandet av biotin-streptavidin-biotin-komplex. Dessa obligationer är relativt stabila (Kd ~ 10 -14 M) 37 och bildar snabbt (vanligen inom 10 minuter efter emulsionsdroppbildning, innan mikrotubuli kärn blir uppenbar) (Figur 4b). I närvaro av kortikal dynein, centrosom bibehåller typiskt ett mer centralt läge, medan i frånvaro av dynein är centrosom skjuts till motsatta sidor av dropp cortex (figur 4c). Vi Anledningen till detta är resultatet av två effekter, som förhindrar och motverkar mikrotubuli tryckkrafter. (1) dynein främjar direkt mikrotubuli katastrofer och därmed begränsa mikrotubuli längd och förhindra överdriven mikrotubuli buckling, och (2) kortikala dragkrafter leder till nettocentre krafter på enskilda astrar 8, som motverkar aster-aster repulsionskrafter.
Den diffunderbara tvärbindare Ase1 inducerar forces som tenderar att öka den överlappande regionen av antiparallella mikrotubuli 29. I överensstämmelse med detta, i närvaro av Ase1 (och frånvaro av dynein) centrosom påträffas nära varandra med Ase1 lokaliserande att buntas interpolar mikrotubuli (figur 4d). Medlemmar av kinesin-5 familj kör centrosom separation genom tryckkrafter inifrån spindeln (se inledningen). I närvaro av Cut7 (S. pombe kinesin-5 ortolog), är centrosom skjuts till motsatta sidor av emulsionsdropparna, även i närvaro av Ase1 (figur 4e). Genom att kombinera kortikala och inter polära kraftgeneratorer, kan graden av komplexitet ökas ytterligare i dessa experiment, så småningom leder till en omfattande förståelse av bipolär mitotiska spindelenhet. En detaljerad kvantitativ beskrivning av dessa resultat kommer att finnas tillgängliga i framtiden (Roth et al., Manuskript under utarbetande).
(Figur 5c). Detta underlättar studiet av både steady-state beteende och spindelmonterings kinetik. Genom att kombinera droppar med olika innehåll i samma prov, är det till exempel möjligt att direkt jämföra centrosom positionering och spindelmonterings kinetik i droppar med och utan kortikala kraftgeneratorer (Figur 5b).
Figur 1: krafter som verkar på den mitotiska spolen Flera kraftalstrande molekyler verkar på mikrotubuli av den mitotiska spolen att främja spindelbildning och positionering.. Mikrotubuli som växer in i cellen cortex generera en tryckkraft på centrosom. Kortikal dynein (lila) fångar depolymerisera mikrotubulus och genererar en dragkraft på de centrosom. Inom spindeln kinesin-5 / Cut7 motorproteiner ger en utåtriktad glid kraft den anti-parallella mikrotubuli, medan tvärbindare av PRC1 / Ase1 familj generera en motstående utåt glidande kraft. Klicka god här för att se en större version av denna siffra .
Figur 2:. Mikroflödes kisel (A) Konstruktion av fyra tum fotomasker innehållande 4 mikroflödes marker. (B) detaljerad representation av ett enda chip. Chips innehåller en utloppskanal och tre inloppskanaler följda av ett dammfilter. Inloppskanalen 1 innehåller den vattenfasen, kan kanal 2 lipid / oljefasen och kanal 3 användas för att späda ut de bildade dropparna med ytterligare lipid / oljefasen. (C) Detaljerad bilden av korsningen där lipid / oljefasen (kommer från toppen och botten) möter med den vattenfasen (kommer från vänster). Vid korsningen, kommer droppar bildas och strömmar mot utloppskanalen till höger. (D) Detaljerad representation av en dammfilter med 2 pm kanaler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Metodik för vatten-i-olja-emulsionen droppbildningen (A) mikroflödessystem chip och mikrofluidik slangar på ett ljusfältsmikroskop. Både vatten- och lipid / olje-fas rören är anslutna till de spåninlopp 1 och 2 respektive. (B) Begränsning på mikrofluidik chip där vatten- och lipid / oljefaser möts. Genom att ändra trycken, kan dropparna storlek styras. (C) Konstruktion av PDMS-belagda flödesceller. Efter att ha laddat dropparna in i flödescellen, är de öppna ändarna stängda med ytterligare valap. (D) Schematisk bild av droppbildning. Droppar används för att kapsla in centrosom, tubulin och ytterligare komponenter som krävs för mitotiskt spindelbildning. (E) Schematisk bild av kortikal-dynein inriktning. Biotinylerad (Bio) dynein riktas till biotinylerade lipider genom streptavidin (Strp). 
Figur 4:. Representativa resultat av spindel Reconstitutions med ökande komplexitet (A) maximal intensitet projektioner av droppar som innehåller två centrosom som visar exempel på korta, mellanliggande och långa mikrotubuli. Centrosom och mikrotubuli visualiseras genom tillsättning av 10% HiLyte-488 märkt tubulin. Skalstrecken = 10 | im. (B) Lokalisering av GFP-biotin-dynein-TMR i frånvaro (- vänster) och närvaro (+, höger) streptavidin (Strp). (C) mikrotubuli aster positionering i frånvaro (-, vänster) eller närvaro (+, höger) av kortikalt GFP-biotin-dynein-TMR. (D) mikrotubuli aster (vänster panel, green) positionering i närvaro av Ase1 (mitten panel, röd). (E) mikrotubuli aster (vänster panel, grön) positionering i närvaro av Ase1 och Cut7 (kinesin-5) (mitten panel, röd). Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 5: Imaging Aster Positioning Dynamics in vitro (A) Konstruktion av en PDMS cup som tillåter dropp avbildning upp till flera timmar.. (B) Generation, lagring och avbildning av droppar (överförs) innehållande olika innehåll, som illustreras av frånvaro (vänster) integration (till höger) av fluorescerande dextran (Alexa 647). (C) enda plan bilder av en 60 min tidsförlopp (2 minuters intervall) som tagits från ett z-stack (2 pm avstånd) av annonsroplet innehåller en enda centrosom. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
De metoder som beskrivs här före senaste ansträngningar för att återupprätta grundläggande mitotiska spindlar i vatten-i-olja emulsionsdroppar. Studera spindelenhet inom geometriska gränser ger många fördelar. Viktiga återkopplingsmekanismer föreligger mellan mikrotubuli av den mitotiska spindeln och de geometriska begränsningar som de är monterade. Mikrotubuli kan generera tryckkrafter när de växer i geometriska gränser, vilket kan resultera i mitotiska spindelförskjutning. Dessutom kan växa till en fysisk barriär inducera mikrotubuli katastrofer. Dessutom kan spindelenhet inom ett begränsat geometri leda till en gradvis utarmning av individuella komponenter, såsom tubulin, som i sin tur direkt påverkar mikrotubuli tillväxthastigheten 36. Dessa är alla viktiga faktorer för spindelenhet, som kan studeras med användning av de analyser som beskrivs här.
De beskrivna analyser är mycket känsliga för liten koncentration differeNCES av droppen komponenter. Detta är fallet för tubulin, där små skillnader koncentrations kan resultera i antingen alltför långsam eller alltför snabb mikrotubuli tillväxt. I detta fall, mikrotubuli tillväxthastigheter kan ofta fortfarande korrigeras genom att justera temperaturen under det första ~ 30 min av försöket. Mitotiska spolen montering och positionering är också mycket känslig för variationer i koncentrationen av (kortikal) kraftgeneratorer. Detta kommer sannolikt att bero på koncentration, renhet och aktiviteten hos de renade komponenterna och måste titreras noggrant för varje nyligen renade proteinet.
Dessutom har vissa kompromisser måste göras i avbildnings inställningar, beroende på analysens natur. Initialt höga halter av lösliga fluorescerande tubulindimerer gör det svårt att avbilda enskilda mikrotubuli. Som mikrotubuli växer längre och löslig tubulin långsamt utarmat, gradvis blir signal-till-brusförhållandet högre och medger avbildning av individual mikrotubuli. I motsats till inställningar med öppna system, förhindrar den geometriska förlossning utbyte av fluorescerande molekyler och syre renhållare systemkomponenter inom en bulkreservoar, vilket resulterar i betydande blekning. Speciellt för övervakning av spindel montering och positionering över tid, krävs det att bilden med låga Ijusintensiteter, även i närvaro av en potent syrefångare system.
Dessa metoder gör det möjligt för bottom-up beredning av förenklade spindelliknande strukturer in vitro. Förutom de komponenter införda här, har många andra faktorer beskrivits påverka bipolär spindelbildning, positionering, orientering, formning, etc. 3. Detta system kan utökas ytterligare för att studera enskilda och kombinerade effekterna av ytterligare kraft generatorer. Viktiga bidrag till spindel formation som för närvarande är frånvarande från detta system är de mitotiska kromosomer. Mitotisk kromatin har visat sigdirekt spindelbildning genom (1) chromokinesins som kan generera så kallade polära ejektionskrafter "3, (2) bildandet av en RanGTP gradient av kromatin-bundna RanGEF RCC1 38, (3) kinetokorer som kan interagera med (depolymerisera ) mikrotubuli 39 och (4) kromatinet självt, vilket kan fungera som en mekanisk fjäder i-mellan motsatta mikrotubuli 40.
Slutligen ger det beskrivna systemet för närvarande begränsad i tid och rum kontroll över verksamheten och lokalisering av införda kraftgeneratorer. I celler, många spindelmonterings faktorer lokalisera specifika avdelningar eller är verksamma inom en begränsad tid fönster. Ett slående exempel är aktiviteten hos dynein, som specifikt är berikad på den bakre sidan av den C. elegans en-cells stadiet embryo att främja asymmetrisk spindelpositionering och celldelning. I detta system, vi undersöker för närvarande möjligheten att imitera sådan temporal och asymmetriska aktivitet med hjälp av metoder lånade från opto-genteknik. Dessutom, såsom är fallet för C. elegans embryo och celler med en styv cellvägg, gör många celler inte runda upp i mitos. Formen på den geometriska inneslutning kommer att ha en avgörande inverkan på de krafter som verkar på spindeln 41. Det kommer därför att vara viktigt att man bereder spindelenhet och placering i icke-sfäriska droppar samt potentiellt använda mer komplexa mikroflödessystem som tillåter formning och lagring av emulsionsdropparna 42,43. Slutligen, i vävnader, cell-cell och cell-substrat signalering och fastsättning tillhandahålla externa signaler som kan översättas till riktade spindelorientering, som ofta observeras i epitelceller och stamceller. Alla dessa specialiserade aspekter har inte beaktats i denna studie och kan ge framtida utmaningar för att bygga mot mer in vivo -liknande reconstitutions av mitotiska spindeln assembly och positionering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Preparation of microfluidic chips | |||
| Photomask (Photomask on film substrate) | Selba S.A. Switzerland | ||
| SU-8 3025 | MicroChem | ||
| Silicon wafer (4 inch silicon wafer p/Boron <1-0-0>10-20 Ω-cm, 500-550 μm, SSP, with 2 flats) | WRS Materials | 4P0SSP-005 | |
| Spin coater | Polos | SPIN150I | |
| PDMS pre-polymer RVT615 A+B | Lubribond | 9481 | |
| Corona treater | Electro-technic products | BD-20ACV | |
| 2. Microfluidic setup | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine) | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
| Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl)) | Avanti Polar Lipids | 870285 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498 | |
| Glass pipets | |||
| Glass tubes | |||
| Vacuum pump | Laboport | KNF | |
| Vacuum chamber | Kartell | Polypropylene Vacuum Desiccator | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Surfactant (Span80) | Sigma-Aldrich | 85548 | |
| Sonicator | Branson | M2800H | |
| Coverslips | 24 mm x 60 mm, thickness 1.5 | ||
| Glass-slides | 26 mm x 76 mm | ||
| Puncher | Harris Uni-Core | 135840/135841/135843 | |
| Laboratory sealing film | Parafilm | ||
| Valap (Vaseline, lanolin, paraffin wax melted at equal concentrations) | Home made | ||
| Brightfield Microscope | Leica | PMIRB | Any inverted brightfield would suffice |
| Pressure controler | Fluigent | MFCS-FLEX-4C-1000 | |
| PEEK Tubing | Cluzeau Info. Labo, France | ||
| Microfluidics vials (Tubes Micrew 0.5 ml and 1 ml) | VWR, The Netherlands | ||
| 3. Reconstituting spindle formation and positioning | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran-647 nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10,000 MW, Anionic, Fixable) | Life Technologies | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | ||
| BSA - Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | ||
| Glucose (D-(+)-Glucose) | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Glucose-oxidase (Glucose oxidase from Aspergillus niger) | Sigma-Aldrich | G6125 | |
| DTT (DL-dithioltheitol) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| Catalase (Catalase form bovine liver) | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| Tubulin (Tubulin from bovine brain) | Cytoskeleton Inc. | ||
| Tubulin-488/561 (HiLyte-488/Rhodamine-labeled tubulin from porcine brain) | Cytoskeleton Inc. | ||
| GTP (Guanosine-'5-triphosphate, sodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | 51120 | |
| κ-casein (κ-casein from bovine serum milk) | Sigma-Aldrich | C0406 | |
| Airfuge (Air-driven ultracentrifuge) | Beckman-Coulter | CLS | |
| 4. Introducing spindle-assembly factors | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neutravidin | Sigma-Aldrich | A2666 | |
| ATP (Adenosine-'5-triphosphate, disodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monosodium salt hydrate ≥97% (enzymatic)) | Sigma-Aldrich | P0564 | |
| PK/LDH -(Pyruvate kinase/lactic dehydrogenase enzymes from rabbit muscle) | Sigma-Aldrich | P0294 |
References
- Kotak, S., Gonczy, P. Mechanisms of spindle positioning: cortical force generators in the limelight. Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 741-748 (2013).
- Williams, S. E., Fuchs, E.
- Tanenbaum, M. E., Medema, R. H. Mechanisms of centrosome separation and bipolar spindle assembly. Dev Cell. 19, 797-806 (2010).
- Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. Mitotic force generators and chromosome segregation. Cell Mol Life Sci. 67 (13), 2231-2250 (2010).
- Faivre-Moskalenko, C., Dogterom, M. Dynamics of microtubule asters in microfabricated chambers: the role of catastrophes. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (26), 16788-16793 (2002).
- Janson, M. E., de Dood, M. E., Dogterom, M. Dynamic instability of microtubules is regulated by force. J Cell Biol. 161 (6), 1029-1034 (2003).
- Laan, L., Husson, J., Munteanu, E. L., Kerssemakers, J. W., Dogterom, M. Force-generation and dynamic instability of microtubule bundles. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8920-8925 (2008).
- Laan, L., et al. Cortical dynein controls microtubule dynamics to generate pulling forces that position microtubule asters. Cell. 148 (3), 502-514 (2012).
- Dogterom, M., Yurke, B. Measurement of the force-velocity relation for growing microtubules. Science. 278 (5339), 856-860 (1997).
- Cytrynbaum, E. N., Scholey, J. M., Mogilner, A. A force balance model of early spindle pole separation in Drosophila embryos. Biophys J. 84 (2 Pt 1), 757-769 (2003).
- Kozlowski, C., Srayko, M., Nedelec, F. Cortical microtubule contacts position the spindle in C. elegans embryos. Cell. 129 (3), 499-510 (2007).
- Carminati, J. L., Stearns, T. Microtubules orient the mitotic spindle in yeast through dynein-dependent interactions with the cell cortex. J Cell Biol. 138 (3), 629-641 (1997).
- Nguyen-Ngoc, T., Afshar, K., Gonczy, P. Coupling of cortical dynein and G alpha proteins mediates spindle positioning in Caenorhabditis elegans. Nat Cell Biol. 9 (11), 1294-1302 (2007).
- Moore, J. K., Cooper, J. A. Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex. Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).
- Grishchuk, E. L., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R. Force production by disassembling microtubules. Nature. 438 (7066), 384-388 (2005).
- Toba, S., Watanabe, T. M., Yamaguchi-Okimoto, L., Toyoshima, Y. Y., Higuchi, H. Overlapping hand-over-hand mechanism of single molecular motility of cytoplasmic dynein. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (15), 5741-5745 (2006).
- Ten Hoopen, R., et al. Mechanism for astral microtubule capture by cortical Bud6p priming spindle polarity in S. cerevisiae. Curr Biol. 22 (12), 1075-1083 (2012).
- Kapitein, L. C., et al. The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks. Nature. 435 (7038), 114-118 (2005).
- van den Wildenberg, S. M., et al. The homotetrameric kinesin-5 KLP61F preferentially crosslinks microtubules into antiparallel orientations. Curr Biol. 18 (23), 1860-1864 (2008).
- Kapitein, L. C., et al. Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5. J Cell Biol. 182 (3), 421-428 (2008).
- Ferenz, N. P., Gable, A., Wadsworth, P.
- Schuyler, S. C., Liu, J. Y., Pellman, D. The molecular function of Ase1p: evidence for a MAP-dependent midzone-specific spindle matrix. Microtubule-associated proteins. J Cell Biol. 160 (4), 517-528 (2003).
- Loiodice, I., et al. Ase1p organizes antiparallel microtubule arrays during interphase and mitosis in fission yeast. Mol Biol Cell. 16 (4), 1756-1768 (2005).
- Kapitein, L. C., et al. Microtubule-driven multimerization recruits ase1p onto overlapping microtubules. Curr Biol. 18 (21), 1713-1717 (2008).
- Janson, M. E., et al. Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast. Cell. 128 (2), 357-368 (2007).
- Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
- Mollinari, C., et al. PRC1 is a microtubule binding and bundling protein essential to maintain the mitotic spindle midzone. J Cell Biol. 157 (7), 1175-1186 (2002).
- Braun, M., et al. Adaptive braking by Ase1 prevents overlapping microtubules from sliding completely apart. Nat Cell Biol. 13 (10), 1259-1264 (2011).
- Lansky, Z., et al. Diffusible crosslinkers generate directed forces in microtubule networks. Cell. 160 (6), 1159-1168 (2015).
- Yamashita, A., Sato, M., Fujita, A., Yamamoto, M., Toda, T. The roles of fission yeast ase1 in mitotic cell division, meiotic nuclear oscillation, and cytokinesis checkpoint signaling. Mol Biol Cell. 16 (3), 1378-1395 (2005).
- Roth, S., Laan, L., Dogterom, M.
- Moudjou, M., Bornens, M. Method of centrosome isolation from cultured animal cells. Cell Biology: A laboratory handbook. Celis, J. E. 2, 111-119 (1998).
- Reck-Peterson, S. L., et al. Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior. Cell. 126 (2), 335-348 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Lancaster, O. M., et al. Mitotic rounding alters cell geometry to ensure efficient bipolar spindle formation. Dev Cell. 25 (3), 270-283 (2013).
- Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis. Science. 342 (6160), 856-860 (2013).
- Green, N. M.
- Moore, W., Zhang, C., Clarke, P. R. Targeting of RCC1 to chromosomes is required for proper mitotic spindle assembly in human cells. Curr Biol. 12 (16), 1442-1447 (2002).
- Akiyoshi, B., et al. Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments. Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).
- Lawrimore, J., et al. DNA loops generate intracentromere tension in mitosis. J Cell Biol. 210 (4), 553-564 (2015).
- Minc, N., Burgess, D., Chang, F. Influence of cell geometry on division-plane positioning. Cell. 144 (3), 414-426 (2011).
- Taberner, N., et al. In vitro systems for the study of microtubule-based cell polarity in fission yeast. Methods Cell Biol. 128, 1-22 (2015).
- Boukellal, H., Selimovic, S., Jia, Y., Cristobal, G., Fraden, S. Simple robust storage of drops and fluids in a microfluidic device. Lab Chip. 9 (2), 331-338 (2009).
