Introduction
Under mitose, er kromosomerne fra den replikerede genom organiseret på cellens ækvator at sikre lige fordeling af søsterchromatider over nydannede datterceller. Kromosom positionering og adskillelse er medieret af deres tilknytning til spindel mikrotubuli oprindelse fra to modsatrettede centrosomer. Ud over at sikre trofast kromosom fordeling, orienteringen af den mitotiske spindel dikterer også celledeling plane 1. Koordineret orientering af celledeling er afgørende i mange faser af udvikling og for vævshomeostase 2. Specifikt kan reguleres mitosespindelen positionering resultere i den asymmetriske fordeling af cellulære indhold eller selv producere datterceller af forskellig størrelse 2. Mitosespindelen montage og orientering starter i profase og orkestreret af et komplekst samspil mellem samarbejde og antagonisering kraft-generatorer 3,4. De genererede kræfter består af bOTH trække og skubbe kræfter. Disse kræfter stammer både fra spindel kontakter med cellen cortex såvel som inde fra spindlen, og kan dannes ved mikrotubulusdynamik samt ved molekylære motorer og tværbindere (figur 1).
Skubbekræfter kan genereres når mikrotubuli vokse mod stive strukturer såsom cellen cortex. Afhængigt af den totale modstand kraft genereres i systemet, kan dette resultere i repositionering af den mitotiske spindel (lave kræfter) eller udløse mikrotubulus foldning eller katastrofe (høje kræfter) 5-8. Mængden af kraft, der kan frembringes ved at skubbe afhænger mikrotubulus længde, idet længden er en stærk determinant for mikrotubulus-buckling 9. Desuden kan mikrotubuli, der stammer fra en centrosom skubbe mod den anden centrosom, en mekanisme, der er blevet foreslået at drive centrosom adskillelse i begyndelsen profase 3,10.
I annoncenbetingelse for at skubbe kræfter, der genereres ved voksende mikrotubuli, ender mikrotubuli kontakt mellem cellen cortex kan også mægle trække kræfter 11. Undersøgelser fra flere laboratorier har vist, at den kontrollerede aktivitet af kortikale kraft generatorer er påkrævet til den asymmetriske placering af mitotiske spindler in vivo 1. Afgørende for disse trækkræfter er cortex-lokaliserede cytoplasmatisk dynein (herefter benævnt »dynein«), et minus-ende rettet mikrotubuli motor protein 8,12,13. For eksempel i knopskydende gær, laterale interaktioner af cortical dynein med mikrotubulus gitter resulterer i motor-afhængig mikrotubulus glider langs cortex 14. Imidlertid kan corticale trækkræfter også frembringes ved evnen af dynein til dannelse fra enden vedhæftede filer til depolymerisering mikrotubuli 8. Den energi, der genereres af mikrotubuli svind kan føre til kræfter, der er generelt en størrelsesorden højere (~ 50 PN (referere 15 16)). End-on fastgørelse af kortikale dynein til depolymerisering mikrotubuli fremmer spindel positionering i spirende gær 17 og C. elegans 13. Hvorvidt både motor-afhængige glidende og mikrotubulusdepolymerisation drevet kortikale trækkræfter kan samarbejde eller udelukker gensidigt hinanden in vivo i øjeblikket ukendt.
Foruden mikrotubuli skubbekræfter og dynein-medieret kortikale trækkræfter, er centrosom positionering kontrolleres indefra mitosespindelen af talrige andre proteiner. Kinesin-5 motorer, for eksempel eksistere som tetramerer, der kan tværbinde antiparallelle interpolar mikrotubuli, hvilket resulterer i dannelsen af passiv glidende kræfter 18-20. Medlemmer af kinesin-5 motor familien er nødvendige for centrosom separation og bipolar spindel samling i alle eukaryoter undersøgte, med undtagelse af C. elegans (revideret i henvisning 21).
Endvidere er diffunderbare tværbindere af Ase1 / PRC1 familie også kendt for at lokalisere til overlappende mikrotubulus regioner af interpolar mikrotubuli in vivo og in vitro 22-27. De kræfter, der genereres af Ase1-drevet udvidelse af det overlappende mikrotubulus-region er store nok til at opveje kinesin-14 medierede glidende kræfter in vitro 28,29. I celler, der Ase1 / PRC1 kræves for stabil dannelse af overlappende mikrotubuli regioner i spindlen Mellemzone 25-27,30, hvilket antyder, at de kræfter, der genereres af diffunderbare tværbindere betydeligt kan bidrage til spindel organisation. Endelig styrker fra den mitotiske kromatin og kinetochores indflydelse mitosespindelen samling og positionering gennem forskellige veje 3. Da disse komponenter er ikke en del af rekonstituering assays beskrevet her, vil de ikke blive diskuteret i detaljer.
jove_content "> Der findes forskellige teorier om, hvordan de forskellige molekylære komponenter og kræfter er beskrevet ovenfor samarbejder spindel samling og positionering, men vi er stadig langt fra en kvantitativ forståelse. Ud over eksperimenter i levende celler, in vitro-forsøg med oprensede komponenter giver en kraftfuld rute til at hjælpe nå dette mål. Her præsenterer vi en visuel guide til en tilpasset og udvidet version af de nyligt offentliggjorte metoder (Roth et al. 31), hvor grundlæggende spindler rekonstitueres i vand-i-olie emulsion dråber, startende med en minimalt antal komponenter. Ved hjælp af mikrofluide teknikker, er sfæriske dråber genereret med størrelser, der er sammenlignelige med mitotiske celler. Inden for disse dråber, kan oprensede centrosomer og tubulin kombineres for at studere mikrotubuli aster dynamik, tvinger generation og aster-aster interaktioner. Ved indføre kortikale (såsom dynein) og inter-polære (såsom kinesin-5 / Ase1) kraft-generatorer, virekonstituere stadig mere komplekse spindel-lignende strukturer, der begynder at ligne in vivo situationen.Protocol
1. Udarbejdelse af Microfluidics Chips
BEMÆRK: bottom-up undersøgelse af spindel samling, er sfæriske vand-i-olie emulsion dråber brugt. Disse er vandige mikrodråber adskilt fra den omgivende olie-fase ved et monolag af phospholipider og overfladeaktivt middel. Disse emulsions--smådråber er produceret inden mikrofluid polydimethylsiloxan (PDMS) chip. Ændringer i kanal geometrier og strømningshastigheder kan bruges til at tune dråbestørrelse. I mikrofluid design beskrives her, er dråber genereres med en diameter på ca. 15 um til efterligne den geometriske indespærring af en mammal mitotisk celle.
- Fotomaske Design og Mold Fabrication
- Design en fotomaske indeholdende tre indløbskanaler 31. Indløbskanal 1 forbinder til vandfasen, som indeholder dråben indhold (se afsnit 3 "Tilberedning grundlæggende mikrotubulus asters"). Inlet kanal 2 forbinder til olie-fase (se afsnit 2.1 "Lipid / olie-phase forberedelse "). Brug indløb kanal 3 at fortynde emulsion-dråber med ekstra lipid / olie-fase, før observation (valgfrit) (figur 2a-b).
BEMÆRK: Alle indløbs- kanaler følges af en støv-filter (en labyrint af 2 um kanaler) til fælde støv, PDMS-partikler og (protein-) aggregater og at forhindre dem i at blokere de mikrofluide kanaler (figur 2d). Kanaler er 75 um brede og lipid / olie-fase og vand-fase mødes på en 12,5 um bred vejkryds, hvor emulsion-dråber vil danne (Figur 2c). - Bestil og få trykt fotomasker på en film substrat, med en negativ polaritet (fotomasken bliver mørkt med gennemsigtige designede strukturer).
- Design en fotomaske indeholdende tre indløbskanaler 31. Indløbskanal 1 forbinder til vandfasen, som indeholder dråben indhold (se afsnit 3 "Tilberedning grundlæggende mikrotubulus asters"). Inlet kanal 2 forbinder til olie-fase (se afsnit 2.1 "Lipid / olie-phase forberedelse "). Brug indløb kanal 3 at fortynde emulsion-dråber med ekstra lipid / olie-fase, før observation (valgfrit) (figur 2a-b).
- Mold Fabrication
- Fabrikere forme ved spin-coating SU-8 3025 fotoresist på en 4 tommer siliciumskive ved anvendelse af en spin-coater (500 rpm, 10 sek, efterfulgt af 1.800 rpm, 45 sekunder) i et rent-rum miljø.
- Udsætte SU-8 coatedesiliciumskive gennem fotomasken. Udvikle vafler ifølge producentens anvisninger for at skabe kanaler for ~ 40 um tykkelse.
- Realiseringen af et Mikrofluid chip
- Bland 10 dele PDMS præpolymer med 1 del hærder (total ~ 40 gr) i en båd-lignende fartøj ved anvendelse af en plast spatel. Placer PDMS indeholdende båd-lignende fartøj i et vakuumkammer for ~ 30 min. for at fjerne luftbobler. Wrap aluminiumfolie omkring støbeformen for at danne en kop med ~ 1 cm opretstående kanter.
- Hæld PDMS (~ 75% af den samlede mængde) i formen, efterlade i et vakuumkammer for en anden ~ 30 min. (For at fjerne luftbobler) og hærde i 1 time ved 100 ° C i en ovn.
- Spin-coate resterende PDMS på objektglas (5 sekunder ved 200 rpm, efterfulgt af 30 sekunder ved 4.000 rpm) efterfulgt af hærdning i 1 time ved 100 ° C. Fjern støv fra objektglas med komprimeret luft / N2 -Flow, forudgående rensning er ikke nødvendig.
BEMÆRK: De PDMS-overtrukne objektglas kan bruges både til microfluidic chip og flow-celle produktion (se også 2.2). - Forsigtigt fratage PDMS ud af formen ved hjælp af et barberblad og punch huller (0,5 mm for indløb, 0,75 mm for udløb) .Corona-behandle mikrofluid chip og en PDMS-overtrukne objektglas under anvendelse af en laboratorie corona overflade treater i et par sekunder .
- Placer mikrofluid chip på objektglasset (kanaler vender nedad) og bages chips o / n ved 100 ° C (figur 3a). Opbevar mikrofluide chips i flere måneder i et støvfrit miljø.
2. Mikrofluid Setup
BEMÆRK: Vand-i-olie emulsion dråber genereres ved anvendelse af en mikrofluidik opsætning og de mikrofluide chips beskrevet ovenfor. Sammensætningen af lipid / olie-fase kan varieres afhængigt af de eksperimentelle betingelser. Olie-solubiliseret lipider vil danne et monolag ved vand-olie-grænseflade med deres polære hoved-grupper mod vandet inde. For at målrette proteiner(F.eks dynein) til dråben grænse, lave mængder af biotinyl-phosphatidylethanolamin (biotinyl-PE) kan tilføjes lipider. Dette giver mulighed for rekruttering af biotinyleret dynein (se afsnit 4.1 "dynein målretning til dråben cortex") via streptavidin-medieret multimerisering. Dråber stabiliseres ved tilsætning af et overfladeaktivt middel og lagret i PDMS-overtrukne flow-celler.
- Lipid / olie-fase Fremstilling
- Bland chloroform opløst 1,2-dioleoyl- sn glycero-3-phospho-L-serin (DOPS) og biotinyl-PE lipiderne i et 4: 1 molforhold i et glasrør under anvendelse af glas pipetter (udstrakt skylles pipetter med chloroform før brug). Forbered alt ~ 250 ug lipider, hvilket resulterer i en lipidkoncentration på ~ 0,5 mg / ml.
- Tørre omhyggeligt lipidblandingen med N2 -Flow og efterfølgende i et vakuumkammer for ~ 1 time. Opløs de tørrede lipider i mineralolie og 2,5% overfladeaktivt middel til 0,5 mg / ml (gøre ~ 500 pi).
- Placer lipid / olie prøve i enultralydsbad og soniker i 30 min. ved 40 kHz til fuldstændig opløsning lipiderne.
- Flow-celle Fremstilling
- Spin-coat PDMS (se også afsnit 1.3) på dækglas (5 sek ved 200 rpm, efterfulgt af 30 sek ved 4000 rpm) og objektglas (5 sek ved 100 rpm efterfulgt af 30 sek 1500 rpm) for at deponere det homogene lag PDMS.
BEMÆRK: For optimal billedkvalitet, skal du sørge for at bruge dækglas med en tykkelse, der matcher mikroskop mål. I dette tilfælde: 1.5 (~ 0,17 mm). - Hærde PDMS-overtrukne dækglas og objektglas i 1 time ved 100 ° C i en ovn. Lav flow-celler ved tæt afstand (~ 2 mm) tynde skiver af laboratorie forsegling film (~ 3 mm i bredden) på de PDMS-coatede glas-slides. Ved opbevaring i et støvfrit miljø, kan kanaler, der ikke er blevet anvendt bruges på andre tidspunkter.
- Dæk flow-celler med en PDMS-overtrukne dækglas og forsegling ved smeltning af laboratoriet forseglingsfilm ~ 1 min. ved 100 ° C, trykforsigtigt (figur 3c). Luk laboratorium forsegling film -Glas-grænser med Valap (figur 3c). Store flow-celler til flere måneder i et støvfrit miljø.
- Spin-coat PDMS (se også afsnit 1.3) på dækglas (5 sek ved 200 rpm, efterfulgt af 30 sek ved 4000 rpm) og objektglas (5 sek ved 100 rpm efterfulgt af 30 sek 1500 rpm) for at deponere det homogene lag PDMS.
- PDMS Cup Forberedelse
- Til langvarig billeddannelse, lave en PDMS kop, ved at presse et hul med en diameter på 4 mm i en skive af PDMS (~ 3 mm tyk)
- Corona-behandling af PDMS skive og en PDMS-overtrukne dækglas og placere dem oven på hinanden. Bage PDMS cup o / n (ved 100 ° C) (figur 5a).
- Emulsion-dråbedannelse
- Overvåg dråbedannelse på en omvendt lys-felt mikroskop. Slut trykregulatoren til mikrofluid chip bruger PEEK-rør (diameter: 510 um (ydre) og 125 um (indre)) (figur 3a). Fyld mikrofluide chips helt med lipid / olie-fase fra indløb 2.
- Indføre MRB80-baserede vand-fase (se afsnit 3 "Tilberedning grundlæggende mikrotubuli asters4;) fra indløbet 1. Kontrol dråbe-størrelse ved skiftende belastninger lipid / olie-fase og vand-fase til at skabe dråber af ~ 15 um i diameter (figur 3b).
BEMÆRK: Brug af denne opsætning, brug ~ 800 mbar for lipid / olie-fase og ~ 200 mbar til vand-fase for at skabe dråber af den ønskede størrelse. - Efter opnåelse af den ønskede dråbe-størrelse og nødvendige mængde (~ 10 pi per prøve), indsamle dråber fra udløbskanal og belastning i flow-celle (fylde flow-cellen helt).
- Luk enderne af flow-cellen omhyggeligt under anvendelse Valap (ufuldstændigt lukkede flow-celler kan resultere i omfattende bevægelse af dråberne, hvilket gør det vanskeligt at afbilde dem). Derudover forhindre dannelsen af luftbobler, som resulterer i små dråber bevægelse.
- Skyl PEEK rør grundigt med isopropanol før og efter brug for at forhindre prøve krydskontaminering og tilstopning.
3. rekonstituere Grundlæggende mikrotubuli Asters
BEMÆRK: dråbedistribution indholdet kan varieres afhængigt af de eksperimentelle betingelser. Alle buffere er MRB80-baserede (80 mM PIPES, 1 mM EGTA, 4 mM MgCl2 (pH 6,8)), og alle prøver fremstilles på is. Generelt dråber altid indeholde centrosomer, komponenter, der kræves for mikrotubulus polymerisation, en oxygen scavenger systemet og blokerende middel (se afsnit 3.1). Mikrotubuli force-generatorer og krævede cofaktorer og målretning-faktorer kan inkluderes, hvis det ønskes (se afsnit 4.1 og 4.2).
- Generel opsætning for aster dannelse i emulsionssmådråber (figur 3d)
- Forbered glucoseoxidase (20 mg / ml glucoseoxidase i 200 mM DTT og 10 mg / ml katalase) blanding i forvejen og opbevares i små alikvoter ved -80 ° C.
- Forbered en "blokerende mix 'indeholder κ-kasein, bovint serumalbumin (BSA), Tween-20 og fluorescerende dextran (som neutral markør) (se tabel 1) i forvejen og opbevares i små aliquots ved -80 ° C. Forhindre gentagne fryse-tø-cykler. Sikre alle komponenter er frisklavet.
- Rens centrosomer fra humane lymfoblastiske KE37 cellelinier som beskrevet af Moudjou et al. 32 og opbevares ved -150 ° C i små portioner.
- Optø centrosomer ved stuetemperatur og inkuberes ved 37 ° C i ~ 20 min. før brug for at sikre korrekt mikrotubuli kimdannelse.
BEMÆRK: Dette fremmer mikrotubuli kernedannelse under eksperimentet. - I mellemtiden, forberede 'assay mix, indeholdende tubulin (fluorescerende og "mørk"), guanosintriphosphat (GTP), en oxygen scavenger-system (glucose, glucose-oxidase, katalase og 1,4-dithiothreitol (DTT)), molekylær kraft generatorer (f.eks mikrotubulus motorer / tværbindere), adenosintriphosphat (ATP) og et ATP-regenererende system (phosphoenolpyruvat (PEP), pyruvatkinase (PK) og lactatdehydrogenase (LDH)) på is (se tabel 2).
- Pre-køleairfuge rotor på is. Spin ned prøven i den afkølede airfuge rotor (30 psi i 3 min) .Add forvarmede centrosomer (optimere mængden af centrosomer at tilstræbe dråber indeholdende 1-2 centrosomer).
- Brug kombinationen mix at producere emulsionssmådråber anvendelse af fremgangsmåderne beskrevet i afsnit 2.3.
| Komponent | stamkoncentration | Slutkoncentration (i assay) | Bind | Kommentar |
| Dextran-647 nm | 75 uM | 3,75 uM (0,6 uM) | 5 pi | |
| κ-kasein | 20 mg / ml | 12,5 mg / ml (2 mg / ml) | 62,5 pi | |
| Tween-20 | 5% | 0,375% (0,06%) 7,5 pi | ||
| BSA | 200 mg / ml | 12 mg / ml (1,9 mg / ml) | 6 pi | |
| MRB80 | 19 pi | |||
| 100 pi endelig | Opbevares i 2 pi alikvoter |
Tabel 1: Bestanddele af 'Blokering Mix' Bestanddele af blokere mix, der er nødvendige for rekonstituering af spindel-lignende strukturer i vand-i-olie emulsion dråber.. For beskrivelse se hovedteksten afsnit 3 "Tilberedning grundlæggende mikrotubuli asters". For nærmere oplysninger om materialer, se "Materialer tabel.
| Komponent | Stock concentration | slutkoncentration | Bind | Kommentar |
| Blokering mix | 1.6 pi | |||
| tubulin | 500 uM | 30 uM | 0,6 pi | |
| Tubulin-488/561 | 50 uM | 3 uM | 0,6 pi | |
| GTP | 50 mM | 5 mM | 1,0 pi | |
| Dynein-TMR | 178 nM | 30 nM | 1,7 pi | |
| Streptavidin | 5 mg / ml | 200 nM | 0,4 pi | For kortikale dynein kun |
| Kinesin-5 | 1,6 mM | 80 nM | 0,5 pi | |
| ATP | 25 mM | 1 mM | 0,4 pi | Ved motorer kun |
| PEP | 0,5 M | 25,6 mM | 0,5 pi | Ved motorer kun |
| PK / LDH | 800 U / 1.100 U | 23 U / 32 U | 0,3 pi | Ved motorer kun |
| Ase1-GFP | 400 nM | 80 nM | 2,0 pi | |
| Glucose | 2,5 M | 50 mM | 0,3 pi | sidste trin |
| Glucose-oxidase | 50x | 1,0x | 0,3 pi | sidste trin |
| MRB80 | x | |||
| 9 pi endelige |
Tabel 2: Bestanddele af 'Assay Mix ". Materialer tabel.
4. Introduktion Spindel Assembly-faktorer
BEMÆRK: I analyserne beskrevet her, et grønt fluorescerende protein (GFP) -mærket afkortet version af S. cerevisiae dynein blev anvendt som er kunstigt dimeriseres ved hjælp af en aminoterminal Glutathione S-transferase (GST) -tagget 33. Dette protein oprenses gennem et affinitetsmærke, som indeholder to kopier af protein A IgG-bindende domæne. Varianten bruges her er mærket med en tetramethylrhodamin (TMR) etiket på den carboxyterminale og den N-terminale SNAP-tag bruges til at biotinylere de oprensede proteiner. For konstruere detaljer se Roth et al 31.; for rensning oplysninger, se Reck-Peterson et al. 33. GFP-biotin-dynein-TMR kan målrettes til dråben-cortex gennem dannelsen af biotin-streptavidin-komplekser, der linker dynein at biotinyl-PE lipider (figur 3e).
- Dynein Målretning til Droplet Cortex
- Omfatte GFP-biotin-dynein-TMR i »assay mix« (se tabel 2) i en endelig dråbe-koncentration på 30 nM. Indbefatter streptavidin i »assay mix« (se tabel 2) i en endelig dråbe-koncentration på 200 nM.
BEMÆRK: dynein afhænger ATP-hydrolyse for trinvis bevægelse på mikrotubuli. Derfor omfatter ATP og et ATP regenererende system (indeholdende PEP og PK / LDH) i »assay mix« (se tabel 2).
BEMÆRK: Rekombinant fuldlængde S. pombe GFP-Cut7 (kinesin-5) er venligst leveret af Diez lab (Center for Molekylær Bioengineering, Technische Universität Dresden, Dresden, Tyskland), se. Rekombinant fuld length histidin-mærket S. pombe GFP-Ase1 blev venligst stillet til rådighed fra Jansons lab (Wageningen University, Wageningen, Holland) og sat til den "assay mix 'ved koncentrationer på 80 nM.
- Omfatte GFP-biotin-dynein-TMR i »assay mix« (se tabel 2) i en endelig dråbe-koncentration på 30 nM. Indbefatter streptavidin i »assay mix« (se tabel 2) i en endelig dråbe-koncentration på 200 nM.
5. Imaging
BEMÆRK: Under eksperimentet kan mikrotubulus vækst styres ved at ændre temperaturen. Ved valget af de billeddiagnostiske betingelser, afvejninger skal foretages mellem høj-kvalitet og evnen til at overvåge spindel samling i lange tidsperioder. Sammenligning af kinetikken af spindeldannelse under forskellige betingelser, kan små dråber med forskelligt indhold blandes og afbildes i samme strømningskanal.
- Grundlæggende Imaging Indstillinger
- Billedet i et temperaturstyret miljø under anvendelse af et lukket rum. Visualisere individuelle mikrotubuli efter ~ 30 min ved 26 ° C. Mens billeddannelse, fremme mikrotubulus-vækst ved at hæve temperaturen op til ~ 30 ° C.
BEMÆRK: sNDSTILLINGER nedenfor er specifikke for vores mikroskop setup og kan variere med forskellige systemer og andet operativsystem software. Alle de beskrevne analyser her, er afbildet på et motoriseret omvendt system med en roterende skive konfokal hoved og drives under anvendelse imaging software som Andor iQ 3.1. Få alle billeder med et 100X fordybelse olie objektiv og EMCCD kamera. - Set excitations- lasere 488, 561 og 641 nm til ca. ~ 10% intensitet. Gå til 'køb' panel, skal du klikke på "AOTF 'fanen og slide laser intensiteter til 10%. Klik på 'rekord' for at gemme indstillingerne.
- For z -projections, tage stakke med 1 um intervaller (~ 20 billeder / dråbe). Gå til vigtigste "kamera 'panel, skal du klikke på' Rediger z 'og sæt' Z skridt" til 1,0. Klik på 'næste' for at gemme indstillingerne.
- Angiv maksimal lineær EM-gevinst ved at klikke på fanen 'kamera' i 'erhvervelse' panel og skub EM gevinst bar til 300. Set eksponeringgange til 200 ms i samme fane. Klik på 'rekord' for at gemme indstillingerne.
- Billedet i et temperaturstyret miljø under anvendelse af et lukket rum. Visualisere individuelle mikrotubuli efter ~ 30 min ved 26 ° C. Mens billeddannelse, fremme mikrotubulus-vækst ved at hæve temperaturen op til ~ 30 ° C.
- live-Imaging
- For levende billeddannelse, der anvender software kontrol gør z -projections hver 2 min. for varigheden af 1-2 timer ved at reducere eksponeringstider til ~ 100 ms. (som beskrevet i 5.1.4) og øge z -interval til 2 um (som beskrevet i 5.1.3). Indstil tiden serien i de vigtigste 'kamera' panel, skal du klikke på 'repeat t ", og sat til 2 min. intervaller for en tid på 120 min.
- For levende assays, anvendes en PDMS kop i stedet for en regelmæssig strøm-celle for at sikre, at dråberne er så immobile som muligt.
- Kombineret Imaging af 2 Betingelser
- Fremstil dråber ved hjælp mikrofluidik og gemme på toppen af en PDMS-overtrukne objektglas på is. Dette forhindrer mikrotubulus nukleering indtil det andet sæt af dråber er blevet dannet. Før de producerer det andet sæt af dråber, skylles PEEK rør og mikrofluid chip medMRB80 og helt påfylde mikrofluid chip med lipid / olie-fase.
- Generere dråber med og uden fluorescerende dextran (eller under anvendelse af dextran med forskellige bølgelængde fluoroforer) for at diskriminere mellem dråber med forskellige farver. Efter at producere det andet parti af dråber, forsigtigt blande dråberne ved pipettering og indlæse i en enkelt flow-celle / PDMS-cup.
- Image Analysis.
- Analyser billeder ved hjælp af Fiji (open source software tilgængelig online) 34.
- For levende analyser, konvertere stakke i hyperstacks hjælp 'billede' - 'hyperstacks' - 'stak til hyperstack'. Indstil det korrekte antal z-skiver og tidsrammer.
- For at gøre z-prognoser, vælg 'billede' - 'stakke' - 'z-projekt ". Vælg 'max intensitet' projektion.
- For 3D-rekonstruktioner, først gå til 'billede' - ' "og indstil den korrekte pixel med, pixel højden, voxel dybde og frAME intervaller. Klik på 'OK'. Vælg 'billede' - 'stakke' - '3D projekt «, kontrollere' interpoleres" boksen og klik på 'OK'.
Representative Results
De metoder, der præsenteres i de foregående afsnit tillader rekonstituering af spindel-lignende strukturer med stigende kompleksitet ved anvendelse af geometriske indeslutning af vand-i-olie emulsion dråber. I dette afsnit beskrives repræsentative resultater, der kvalitativt demonstrerer evnen af disse assays.
Under mitose, når den bipolære spindel er samlet, celler runde op til dannelse af kugler med en diameter på omkring 15 um, som målt for humane celler. Denne egenskab mitotisk celleform giver en geometrisk grænse, der både begrænser og dirigerer spindel og -retning 35,36. Mikrofluide teknikker, giver et niveau af geometrisk indespærring, der præcist ligner situationen observeret i levende celler, og derfor tillader bottom-up rekonstruktion af mitosespindler in vitro.
(figur 4a, venstre panel). Efter omkring 20-30 minutter, de første mikrotubuli bliver synlige og centrosom diffusion bliver begrænset som mikrotubuli vokse mod cortex i alle retninger. Asters med mikrotubuli af mellemprodukt længde (ca. 50% af diameteren dråbe) kan (sterisk) frastøde hver anden, med mikrotubuli presser mod hinanden, de andre centrosomer og cortex. Dette resulterer i en typisk 'bipolar' spindel-arrangement med de to centrosomer modstående hinanden (figur 4a, midterste panel). Når mikrotubuli vokse længere end ~ 50% af dråben-diameter, får de centrosomer skubbet yderligere til modsatrettede grænser dråben, med mikrotubuli vokser langs dråbe cortex (figur 4a, højre panel). Det er vigtigt at bemærke, at mikrotubulus vækstrater i disse assays er meget følsomme over både temperatur og tubulin-koncentrationer. Disse parametre vil derfor påvirke det kraftigste det tidspunkt, hvor kimdannelse er først observeret, og når steady state aster positioner er nået.
I celler, der corticale trækkræfter genereres gennem dannelsen af bærende vedhæftninger mellem mikrotubulus plus-ender og cortex-associeret dynein. I dyreceller, denne forening afhænger af Gαi / LGN / NuMA kompleks, som er målrettet til plasmamembranen via N-terminale myristoylering af Gαi 1. I disse rekonstituering analyser, er kravet om Gαi / LGN / NuMA kompleks omgås ved direkte kobling dynein til biotinylerede lipider gennemdannelse af biotin-streptavidin-biotin-komplekser. Disse bindinger er relativt stabile (K D ~ 10 -14 M) 37 og dannes hurtigt (sædvanligvis inden for 10 min efter dannelse emulsionsdråbe, før mikrotubulus nukleering bliver tydelig) (figur 4b). Ved tilstedeværelse af kortikale dynein, centrosomer typisk bevare en mere central placering, i mangel af dynein er centrosomer skubbet til hver sin side af dråben cortex (figur 4c). Vi ræsonnere dette er resultatet af to effekter, som forhindrer og modvirker mikrotubuli skubbe kræfter. (1) dynein direkte fremmer mikrotubuli katastrofer og dermed begrænser mikrotubuli længde og forhindrer overdreven mikrotubuli foldning, og (2) kortikale trækkræfter føre til netto centrering kræfter på de enkelte asters 8, som modvirker de aster-aster frastødningskræfterne.
Den diffuserbar cross-linker Ase1 inducerer forces der har tendens til at øge det overlappende område af anti-parallelle mikrotubuli 29. I overensstemmelse hermed i nærvær af Ase1 (og fravær af dynein) centrosomer findes tæt sammen med Ase1 lokalisere at bundtet interpolar mikrotubuli (figur 4D). Medlemmer af kinesin-5 familien drev centrosom adskillelse ved tilvejebringelse skubbekræfter indefra spindlen (se indledningen). I nærværelse af Cut7 (S. pombe kinesin-5 ortolog), er centrosomer skubbet til modsatte sider af emulsionsdråberne, selv i nærvær af Ase1 (figur 4e). Ved at kombinere kortikale og inter-polære kraft generatorer, kan niveauet af kompleksitet øges yderligere i disse forsøg, i sidste ende fører til en bred forståelse af bipolar mitosespindelen forsamling. En detaljeret kvantitativ beskrivelse af disse resultater vil være tilgængelige i fremtiden (Roth et al., Manuskript under udarbejdelse).
(figur 5c). Dette letter undersøgelse af både steady-state adfærd og spindelenhed kinetik. Ved at kombinere dråber med forskelligt indhold i den samme prøve, er det for eksempel muligt direkte at sammenligne centrosom positionering og spindel samling kinetik i dråber med og uden corticale kraft generatorer (figur 5b).
Figur 1: kræfter, der påvirker mitosespindelen Adskillige kraftgenererende molekyler virker på mikrotubuli af mitosespindelen at fremme spindeldannelse og positionering.. Mikrotubuli, der vokser ind i cellen cortex generere en skubbekraft på centrosom. Kortikal dynein (lilla) fanger depolymerisering mikrotubuli og genererer en trækkraft på centrosomer. Inden spindlen, kinesin-5 / Cut7 motor proteiner giver en passiv glidende kraft den anti-parallelle mikrotubuli, mens krydsbindere af PRC1 / Ase1 familie generere en modstander udad glidende kraft. Klik her for at se en større version af dette tal .
Figur 2:. Mikrofluid Chip Design (A) Design af 4 inch fotomaske indeholdende 4 mikrofluide chips. (B) Detaljeret repræsentation af en enkelt chip. Chips indeholder en udgang kanal og tre indløbskanaler efterfulgt af en støv-filter. Indløbskanal 1 indeholder vandfasen, kan kanal 2 lipid / olie-fase og kanal 3 anvendes til at fortynde de dannede dråber med ekstra lipid / olie-fase. (C) Detaljeret repræsentation af krydset hvor lipid / olie-fase (kommer fra toppen og bunden) mødes med vandfasen (kommer fra venstre). I krydset, vil smådråber dannes og strømme mod udløbskanalen til højre. (D) Detaljeret repræsentation af en støv-filter med 2 um kanaler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Metode til vand-i-olie emulsion Droplet Formation (A) Mikrofluid chip og mikrofluidik slange på en lys-felt mikroskop. Både vand- og lipid / olie-fase rør er forbundet til chip indløb 1 og 2 henholdsvis. (B) Begrænsning af mikrofluidik chip, hvor vand- og lipid / olie-faser mødes. Ved at ændre trykkene, kan dråberne størrelse styres. (C) Design af PDMS-overtrukne flow-celler. Efter indlæsning dråberne ind i flow-cellen, er de åbne ender lukket med ekstra Valap. (D) Skematisk af dråbedannelse. Dråber anvendes til indkapsling centrosomer, tubulin og yderligere komponenter, der kræves for mitotisk spindel formation. (E) Skematisk af cortical-dynein målretning. Biotinyleret (Bio) dynein er målrettet til biotinylerede lipider gennem streptavidin (Strp). 
Figur 4:. Repræsentative resultater af Spindel-rekonstitutioner med stigende kompleksitet (A) Maksimal fremskrivninger af dråber, der indeholder to centrosomer viser eksempler på korte, mellemliggende, og lange mikrotubuli. Centrosomer og mikrotubuli visualiseres ved tilsætning af 10% HiLyte-488 mærket tubulin. Scale barer = 10 um. (B) Lokalisering af GFP-biotin-dynein-TMR i fravær (-, venstre) og nærvær (+, højre) af streptavidin (Strp). (C) på mikrotubulus aster positionering i fravær (-, venstre) eller tilstedeværelse (+, højre) af cortical GFP-biotin-dynein-TMR. (D) mikrotubulus aster (venstre panel, green) positionering i nærvær af Ase1 (midterste panel, rød). (E) på mikrotubulus aster (venstre panel, grøn) positionering under tilstedeværelse af Ase1 og Cut7 (kinesin-5) (midterste panel, rød). Klik her for at se en større version af dette tal. 
Figur 5: Imaging Aster Positioning Dynamics in vitro (A) Design af en PDMS bæger, der giver mulighed dråbe billeddannelse til op til flere timer.. (B) Generation, opbevaring og billedbehandling af dråber (transmitteret), der indeholder forskellige indhold, illustreret ved fravær (venstre) inklusion (til højre) af fluorescerende dextran (Alexa 647). (C) enkelt plan billeder af en 60 min time-lapse (2 minutters intervaller) taget fra en z-stabel (2 um afstande) med adroplet indeholder en enkelt centrosom. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Metoderne beskrevet her tilstedeværende seneste bestræbelser på at rekonstruere grundlæggende mitosespindler i vand-i-olie emulsion dråber. Studere spindel samling inden geometriske grænser giver mange fordele. findes vigtige feedback-mekanismer mellem mikrotubuli i mitotiske spindel og de geometriske begrænsninger, de er samlet. Mikrotubuli kan generere skubbe kræfter, når de vokser i geometriske grænser, hvilket kan resultere i mitosespindelen forskydning. Desuden kan udvikle sig til en fysisk barriere inducere mikrotubulus katastrofer. Desuden kan spindelenhed inden for en begrænset geometri føre til en gradvis udtømning af individuelle komponenter, såsom tubulin, hvilket igen påvirker direkte mikrotubulus vækstrate 36. Disse er alle vigtige faktorer, spindel samling, som kan studeres ved anvendelse af de beskrevne assays her.
De beskrevne analyser er meget følsomme over for små koncentration ForskelNCES af dråben komponenter. Dette er tilfældet for tubulin, hvor mindre koncentrationsforskelle kan resultere i enten for langsomt eller for hurtigt mikrotubulus vækst. I dette tilfælde mikrotubuli vækstrater kan ofte stadig korrigeres ved justering af temperaturen under den første ~ 30 min af eksperimentet. Mitosespindelen montering og positionering er også meget følsom over for variationer i koncentrationen af (cortical) kraft generatorer. Dette vil sandsynligvis afhænge af koncentration, renhed og aktivitet af de oprensede komponenter, og skal titreres omhyggeligt for hver nyligt oprenset protein.
Desuden kan visse afvejninger skal foretages i imaging indstillinger, afhængigt af arten af assayet. Oprindeligt høje niveauer af opløselige fluorescerende tubulindimerer gør det vanskeligt at billeddata individuelle mikrotubuli. Som mikrotubuli vokser længere og opløselig tubulin langsomt tømt, signal-til-støj-forholdet bliver gradvist højere og tillader billeddannelse af indival mikrotubuli. I modsætning til opstillinger med åbne systemer, den geometriske indespærring forhindrer udveksling af fluorescerende molekyler og oxygen scavenger systemkomponenter inden en bulk reservoir, hvilket resulterer i betydelig blegning. Især til overvågning spindel samling og positionering over tid, er det nødvendigt at billedet med lave lysintensiteter, selv i nærvær af en potent oxygen scavenger system.
Disse metoder gør det muligt for bottom-up rekonstituering af forenklede spindel-lignende strukturer in vitro. Ud over de komponenter, der er indført her, har mange andre faktorer blevet beskrevet at påvirke bipolar spindeldannelse, positionering, orientering, formning osv 3. Dette system kan udvides yderligere til at studere de enkelte og kombinerede effekter af ekstra kraft generatorer. Vigtige bidragsydere til spindeldannelse, der i øjeblikket fraværende fra dette system er de mitotiske kromosomer. Mitotisk chromatin har vist sig atdirekte spindel dannelse af (1) chromokinesins der kan generere såkaldte polar-ages styrkers 3, (2) dannelse af en RanGTP gradient af kromatin-bundne RanGEF RCC1 38, (3) kinetochores, der kan interagere med (depolymerisering ) mikrotubuli 39 og (4) kromatin selv, som kan fungere som en mekanisk fjeder imellem modstående mikrotubuli 40.
Endelig giver det beskrevne system i øjeblikket begrænset tidsmæssig og rumlig kontrol over aktivitet og lokalisering af indførte kraft-generatorer. I celler, mange spindel forsamling faktorer lokalisere til bestemte rum eller er aktive inden for et begrænset tid-vindue. Et slående eksempel er aktiviteten af dynein, som er specifikt beriget på den bageste side af C. elegans én-celle stadiet embryo at fremme asymmetrisk spindel positionering og celledeling. I dette system, er vi i øjeblikket undersøger muligheden for at efterligne en sådan temporal og asymmetriske aktivitet ved hjælp af metoder, lånt fra opto-genetiske teknikker. Derudover, som det er tilfældet for C. elegans embryo og celler med en stiv cellevæg, at mange celler ikke runde op i mitose. Formen af den geometriske indespærring vil have en afgørende indflydelse på de kræfter, der virker på spindlen 41. Det vil derfor være vigtigt at rekonstruere spindel samling og positionering i ikke-sfæriske dråber så godt, potentielt bruge mere komplekse mikrofluide systemer, der tillader at forme og opbevaring af emulsionsdråber 42,43. Endelig i væv, celle-celle og celle-substrat signalering og tilknytning give eksterne signaler, der kan oversættes til dirigeret spindel orientering, som det ofte observeret i epitelceller og stamceller. Alle disse specialiserede aspekter er ikke blevet taget i betragtning i denne aktuelle undersøgelse og kan give fremtidige udfordringer til at bygge i retning af flere in vivo-lignende rekonstitutioner af mitosespindelen assembly og positionering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Preparation of microfluidic chips | |||
| Photomask (Photomask on film substrate) | Selba S.A. Switzerland | ||
| SU-8 3025 | MicroChem | ||
| Silicon wafer (4 inch silicon wafer p/Boron <1-0-0>10-20 Ω-cm, 500-550 μm, SSP, with 2 flats) | WRS Materials | 4P0SSP-005 | |
| Spin coater | Polos | SPIN150I | |
| PDMS pre-polymer RVT615 A+B | Lubribond | 9481 | |
| Corona treater | Electro-technic products | BD-20ACV | |
| 2. Microfluidic setup | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine) | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
| Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl)) | Avanti Polar Lipids | 870285 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498 | |
| Glass pipets | |||
| Glass tubes | |||
| Vacuum pump | Laboport | KNF | |
| Vacuum chamber | Kartell | Polypropylene Vacuum Desiccator | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Surfactant (Span80) | Sigma-Aldrich | 85548 | |
| Sonicator | Branson | M2800H | |
| Coverslips | 24 mm x 60 mm, thickness 1.5 | ||
| Glass-slides | 26 mm x 76 mm | ||
| Puncher | Harris Uni-Core | 135840/135841/135843 | |
| Laboratory sealing film | Parafilm | ||
| Valap (Vaseline, lanolin, paraffin wax melted at equal concentrations) | Home made | ||
| Brightfield Microscope | Leica | PMIRB | Any inverted brightfield would suffice |
| Pressure controler | Fluigent | MFCS-FLEX-4C-1000 | |
| PEEK Tubing | Cluzeau Info. Labo, France | ||
| Microfluidics vials (Tubes Micrew 0.5 ml and 1 ml) | VWR, The Netherlands | ||
| 3. Reconstituting spindle formation and positioning | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran-647 nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10,000 MW, Anionic, Fixable) | Life Technologies | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | ||
| BSA - Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | ||
| Glucose (D-(+)-Glucose) | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Glucose-oxidase (Glucose oxidase from Aspergillus niger) | Sigma-Aldrich | G6125 | |
| DTT (DL-dithioltheitol) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| Catalase (Catalase form bovine liver) | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| Tubulin (Tubulin from bovine brain) | Cytoskeleton Inc. | ||
| Tubulin-488/561 (HiLyte-488/Rhodamine-labeled tubulin from porcine brain) | Cytoskeleton Inc. | ||
| GTP (Guanosine-'5-triphosphate, sodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | 51120 | |
| κ-casein (κ-casein from bovine serum milk) | Sigma-Aldrich | C0406 | |
| Airfuge (Air-driven ultracentrifuge) | Beckman-Coulter | CLS | |
| 4. Introducing spindle-assembly factors | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neutravidin | Sigma-Aldrich | A2666 | |
| ATP (Adenosine-'5-triphosphate, disodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monosodium salt hydrate ≥97% (enzymatic)) | Sigma-Aldrich | P0564 | |
| PK/LDH -(Pyruvate kinase/lactic dehydrogenase enzymes from rabbit muscle) | Sigma-Aldrich | P0294 |
References
- Kotak, S., Gonczy, P. Mechanisms of spindle positioning: cortical force generators in the limelight. Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 741-748 (2013).
- Williams, S. E., Fuchs, E. Oriented divisions, fate decisions. Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 749-758 (2013).
- Tanenbaum, M. E., Medema, R. H. Mechanisms of centrosome separation and bipolar spindle assembly. Dev Cell. 19, 797-806 (2010).
- Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. Mitotic force generators and chromosome segregation. Cell Mol Life Sci. 67 (13), 2231-2250 (2010).
- Faivre-Moskalenko, C., Dogterom, M. Dynamics of microtubule asters in microfabricated chambers: the role of catastrophes. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (26), 16788-16793 (2002).
- Janson, M. E., de Dood, M. E., Dogterom, M. Dynamic instability of microtubules is regulated by force. J Cell Biol. 161 (6), 1029-1034 (2003).
- Laan, L., Husson, J., Munteanu, E. L., Kerssemakers, J. W., Dogterom, M. Force-generation and dynamic instability of microtubule bundles. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8920-8925 (2008).
- Laan, L., et al. Cortical dynein controls microtubule dynamics to generate pulling forces that position microtubule asters. Cell. 148 (3), 502-514 (2012).
- Dogterom, M., Yurke, B. Measurement of the force-velocity relation for growing microtubules. Science. 278 (5339), 856-860 (1997).
- Cytrynbaum, E. N., Scholey, J. M., Mogilner, A. A force balance model of early spindle pole separation in Drosophila embryos. Biophys J. 84 (2 Pt 1), 757-769 (2003).
- Kozlowski, C., Srayko, M., Nedelec, F. Cortical microtubule contacts position the spindle in C. elegans embryos. Cell. 129 (3), 499-510 (2007).
- Carminati, J. L., Stearns, T. Microtubules orient the mitotic spindle in yeast through dynein-dependent interactions with the cell cortex. J Cell Biol. 138 (3), 629-641 (1997).
- Nguyen-Ngoc, T., Afshar, K., Gonczy, P. Coupling of cortical dynein and G alpha proteins mediates spindle positioning in Caenorhabditis elegans. Nat Cell Biol. 9 (11), 1294-1302 (2007).
- Moore, J. K., Cooper, J. A. Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex. Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).
- Grishchuk, E. L., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R. Force production by disassembling microtubules. Nature. 438 (7066), 384-388 (2005).
- Toba, S., Watanabe, T. M., Yamaguchi-Okimoto, L., Toyoshima, Y. Y., Higuchi, H. Overlapping hand-over-hand mechanism of single molecular motility of cytoplasmic dynein. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (15), 5741-5745 (2006).
- Ten Hoopen, R., et al. Mechanism for astral microtubule capture by cortical Bud6p priming spindle polarity in S. cerevisiae. Curr Biol. 22 (12), 1075-1083 (2012).
- Kapitein, L. C., et al. The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks. Nature. 435 (7038), 114-118 (2005).
- van den Wildenberg, S. M., et al. The homotetrameric kinesin-5 KLP61F preferentially crosslinks microtubules into antiparallel orientations. Curr Biol. 18 (23), 1860-1864 (2008).
- Kapitein, L. C., et al. Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5. J Cell Biol. 182 (3), 421-428 (2008).
- Ferenz, N. P., Gable, A., Wadsworth, P. Mitotic functions of kinesin-5. Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 255-259 (2010).
- Schuyler, S. C., Liu, J. Y., Pellman, D. The molecular function of Ase1p: evidence for a MAP-dependent midzone-specific spindle matrix. Microtubule-associated proteins. J Cell Biol. 160 (4), 517-528 (2003).
- Loiodice, I., et al. Ase1p organizes antiparallel microtubule arrays during interphase and mitosis in fission yeast. Mol Biol Cell. 16 (4), 1756-1768 (2005).
- Kapitein, L. C., et al. Microtubule-driven multimerization recruits ase1p onto overlapping microtubules. Curr Biol. 18 (21), 1713-1717 (2008).
- Janson, M. E., et al. Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast. Cell. 128 (2), 357-368 (2007).
- Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
- Mollinari, C., et al. PRC1 is a microtubule binding and bundling protein essential to maintain the mitotic spindle midzone. J Cell Biol. 157 (7), 1175-1186 (2002).
- Braun, M., et al. Adaptive braking by Ase1 prevents overlapping microtubules from sliding completely apart. Nat Cell Biol. 13 (10), 1259-1264 (2011).
- Lansky, Z., et al. Diffusible crosslinkers generate directed forces in microtubule networks. Cell. 160 (6), 1159-1168 (2015).
- Yamashita, A., Sato, M., Fujita, A., Yamamoto, M., Toda, T. The roles of fission yeast ase1 in mitotic cell division, meiotic nuclear oscillation, and cytokinesis checkpoint signaling. Mol Biol Cell. 16 (3), 1378-1395 (2005).
- Roth, S., Laan, L., Dogterom, M. Reconstitution of cortical Dynein function. Methods Enzymol. 540, 205-230 (2014).
- Moudjou, M., Bornens, M. Method of centrosome isolation from cultured animal cells. Cell Biology: A laboratory handbook. Celis, J. E. 2, 111-119 (1998).
- Reck-Peterson, S. L., et al. Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior. Cell. 126 (2), 335-348 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Lancaster, O. M., et al. Mitotic rounding alters cell geometry to ensure efficient bipolar spindle formation. Dev Cell. 25 (3), 270-283 (2013).
- Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis. Science. 342 (6160), 856-860 (2013).
- Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
- Moore, W., Zhang, C., Clarke, P. R. Targeting of RCC1 to chromosomes is required for proper mitotic spindle assembly in human cells. Curr Biol. 12 (16), 1442-1447 (2002).
- Akiyoshi, B., et al. Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments. Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).
- Lawrimore, J., et al. DNA loops generate intracentromere tension in mitosis. J Cell Biol. 210 (4), 553-564 (2015).
- Minc, N., Burgess, D., Chang, F. Influence of cell geometry on division-plane positioning. Cell. 144 (3), 414-426 (2011).
- Taberner, N., et al. In vitro systems for the study of microtubule-based cell polarity in fission yeast. Methods Cell Biol. 128, 1-22 (2015).
- Boukellal, H., Selimovic, S., Jia, Y., Cristobal, G., Fraden, S. Simple robust storage of drops and fluids in a microfluidic device. Lab Chip. 9 (2), 331-338 (2009).
