Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Høy throughput screening av karbohydrat-nedbrytende enzymer Bruke Novel Uløselig kromogen substratmetode Kits

doi: 10.3791/54286 Published: September 20, 2016
* These authors contributed equally

Protocol

1. kromogenanalyse med CPH Underlag i en 96-brønners plateformat

  1. Aktivering av analysesettet platen
    1. Aktiver 96-brønners filter (inneholdende blå CPH-xylan) analysesett plate (List of Materials) ved å tilsette 200 ul aktivering oppløsning (oppnådd med settet) i hver brønn, fulgt av 10 minutters inkubasjon ved værelsestemperatur uten omrøring.
    2. Anvend vakuum ved hjelp av en vakuum-manifold (med avstandsblokken innvendig og en hvilken som helst standard, gjennomsiktig 96-brønns plate som et samleplaten) for å fjerne bevart aktivering løsning. Det er også mulig å bruke en sentrifuge ved 2700 xg i 10 min for dette trinn i stedet for vakuummanifolden.
    3. Vask CPH substrater ved å tilsette 100 ul sterilt vann og anvend vakuum (eller sentrifugalkraft) for å fjerne stabilisatoren. Gjenta dette trinnet to ganger og platene er nå klar til bruk.
  2. enzymreaksjonen
    MERK: Du må alltid inkludere bufferalene som en negativ kontroll og om mulig tidligere karakteriserte enzymer som positive kontroller. Bruk et statistisk riktig antall replikater. De CPH substrater er stabil mellom pH 3,0 til 10,0, og det totale volum av buffer ende enzym-oppløsningen i hver brønn bør ikke overstige 180 ul. Planteekstrakt eller dyrkingsmedium kan også brukes i stedet for renset enzymoppløsning.
    1. Tilsett 150 ul 100 mM natrium-acetat-buffer, pH 4,5 og 5 pl endo -cellulase løsning (til en endelig konsentrasjon på 1 U / ml) til hver brønn av analysesettet plate.
    2. Sett produktet platen (en klar-brønns plate er kompatibel med den mikrotiter-plateavleseren) på undersiden av testsettet platen for å samle opp eventuell potensiell lekkasje fra reaksjonsplaten under risting.
    3. Inkuber analysesett plate ved 25 ° C i 30 minutter i en horisontal rystemaskin ved 150 rpm.
      MERK: Blanding reaksjonen i analysesettet platen under inkuberingen er avgjørende for å oppnå en konsistent og reproducible resultat. CPH substrater er stabil opp til 90 ° C. Inkubasjonstiden bør økes opp til 24 timer ved testing kulturbuljonger som inneholder ukjente enzymkonsentrasjoner med CPH underlag. Legg merke til at hensiktsmessige inkubasjonstider avhenge av aktiviteten av enzym (er), men generelt hvis det ikke er noen påvisbar aktivitet innen 24 timer, er det sannsynlig at enzymet ikke vil forringe testet substratet. Et aktivt enzym er å nedbryte de uløselige kromogene polysakkarider av den CPH substratet til løselige kromogene oligosakkarider, som er synlige som farget supernatant.
    4. Plasser rent produkt platen inne i vakuum manifold med avstandsblokken inne.
    5. Plasser analysesett plate på toppen og anvend vakuum (maksimalt undertrykk på -60 kPa). Det er også mulig å bruke en sentrifuge ved 2700 xg i 10 min.
      MERK: Filtratet inneholder fargede oligosakkarider som reaksjonsprodukt er nå i produktet plate for videre analyse 8
  3. Deteksjon og kvantifisering
    1. Sjekk at volumet av væsken i hver brønn av produktet platen er omtrent den samme ved visuell inspeksjon.
    2. Les absorbansen til samleplaten ved 595 nm for blått CPH-xylan ved anvendelse av en plateleser.
    3. Når gjør dataanalyse, subtrahere buffer eneste negative kontrollverdier fra verdiene fra de brønner hvor et enzym ble tilsatt. Beregn middelverdien og standardavvik av middel (SEM) fra replikate brønner 8.

2. kromogenanalyse med ICB Underlag i en 96-brønns format

  1. enzymreaksjonen
    1. Tilsett 150 ul 100 mM natrium-acetat-buffer, pH 4,5 og 5 pl 31 U / ml endo -xylanase løsning til hver brønn av analysesettet plate inneholdende rød ICB-hvetehalm (endelig enzymkonsentrasjon i brønnen: 1 U / ml) .
      MERK: assay kit plater (96-brønn filter plAtes inneholder ICB substrater) er produsert som beskrevet i litteraturen (se liste over materialer). ICB substrater er stabile i buffere med en pH-område mellom pH 3,0 til 10,0. Alltid inneholde buffer alene som en negativ kontroll, kommersielle enzymer som en positiv kontroll og bruke et statistisk passende antall kopier.
      1. Ikke aktiverer ICB underlag som den CPH substratet plate, men å fjerne stabilisatoren ved vasking tre ganger med 100 pl vann etterfulgt av vakuumfiltrering eller sentrifugering.
    2. Sett produktet plate under underlaget plate å samle eventuelle lekkasje fra underlaget plate under risting.
    3. Inkuber reaksjonsblandingen ved 25 ° C risting ved 150 rpm i 2 timer.
      MERK: En aktiv enzym er nedverdigende de uløselige kromogene polysakkarider i ICB underlaget til løselige oligosakkarider, som er synlig som farget supernatant. ICB substrater er stabil opp til 90 ° C. Inkubasjonstiden time bør økes opp til 24 timer hvis ikke-rensede enzymer slik som dyrkningsvæsker benyttes.
    4. Plasser produktet platen inne i vakuum manifold med avstandsblokken inne.
    5. Plasser analysesett plate på toppen og anvend vakuum (maksimalt undertrykk på -60 kPa) eller bruke en sentrifuge for å filtrere produktet fra analysesettet platen i brønnen av produktet platen.
      MERK: Filtratet inneholder fargede oligosakkarider som reaksjonsprodukt er nå i samlingen plate for videre analyse 8.
  2. Deteksjon og kvantifisering
    1. Sjekk at volumet av væsken i hver brønn av samleplaten er omtrent den samme ved visuell inspeksjon.
    2. Les absorbansen til samleplaten ved 517 nm for rød ICB-hvetehalm ved anvendelse av en plateleser.
    3. Når gjør dataanalyse - subtrahere buffer - kun negative kontrollverdier fra verdiene fra de brønner hvor et enzymble lagt til. Beregn middelverdien og standardavvik av middel (SEM) fra replikate brønner 8.
      MERK: Ved screening ukjente enzymer, foreslår vi å lage en fortynningsrekke for å få mer detaljerte data om det dynamiske området enzymets aktivitet.

Representative Results

Den høy gjennomstrømming og multipleksing kapasitet av denne analysen er basert på uoppløselig kromogent polymer (eller protein) hydrogel (CPH) substrater som er anordnet i 96-brønners filterplater. Enzymer så vel som negative kontroller tilsettes til testsettet platen (figur 1A) og enzymene nedbrytes det korresponderende substratet dannes et farget supernatant (figur 1B). Etter at reaksjonen er ferdig, blir supernatanten overført til en klar-brønns plate produkt og absorbansen kan måles direkte ved hjelp av et spektrofotometer som passer for 96-brønners plater (figur 1C).

Et eksempel på en dose-respons av CPH-arabinoxylan til xylanase ved forskjellige konsentrasjoner av enzymet (0,00 til 0,75 U / ml) er vist i figur 1D, hvor det avtagende enzymkonsentrasjon kan observeres visuelt. En mer detaljert spektrofotometrisk Quantreduser fuktighet kan brukes til å plotte absorbansen mot enzymkonsentrasjon (figur 1E). Signalintensiteten tilsvarer den enzymaktivitet. Reproduserbarheten av analysen er vist ved feilstolpene (standardavvik av middelverdi, SEM, av tre kopier). Mer detaljerte eksperimenter på reproduserbarheten av denne analysen er publisert andre steder åtte.

Figur 1
Figur 1. xylanase behandling av CPH-arabinoxylan. A) En ordningen av analysesettet plate med CPH substrat (f.eks CPH-arabinoxylan) lastet inn i 96-brønners filterplate brønnene like før tilsetningen av enzymene 1 og 2 og bufferen -bare kontroll (enzym 1 hadde endo -xylanase aktivitet), B) Nedbrytning av CPH-arabinoxylan av enzymet en produsert en farget supernatant, C) ved vakuum-assistert filtration av supernatantene i til produktet plate, blir absorbansen måles spektrofotometrisk; D) produkt plate inneholdende reaksjonsproduktene etter behandling av CPH-arabinoxylan i 4 forskjellige farger med forskjellige konsentrasjoner av endo -β-1,4-xylanase i 100 mM natriumacetatbuffer, pH 4,5 i 60 minutter ved romtemperatur;. E) Kvantifisering av reaksjonsproduktene fra D ved hjelp av spektrofotometri klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Det finnes ulike alternativer for bruk av denne analysen i enzymet screening. En mulighet er å bruke en 96-brønners plate inneholdende forskjellige polysakkarider for screening, f.eks, et lite antall (renset) endo -enzymes med ukjent aktivitet. I dette tilfellet vil resultatet vise hvilke polysakkaridene er degradstand av målenzymet. For å vise dette prinsippet, ble en endo -cellulase testet mot ulike CPH underlag ved 25 ° C. Tre forskjellige enzymkonsentrasjoner (0,5 U / ml, 1,0 U / ml og 5 U / ml) ble inkubert i 30 min. Resultatene er klart synlig i produktet platen (figur 2A). Produktark for endo -cellulase fra leverandøren angir side-aktivitet for xyloglucan (tamarind), bygg β-glukan, glucomannan, Birchwood xylan og lav side-aktivitet for galaktomannan. I samsvar med dette, aktivitet i tillegg til cellulaseblandingen ble funnet mot CPH-β-glukan (bygg), CPH-xyloglucan (tamarind), CPH-xylan (bøk) og lav aktivitet mot CPH-galaktomannankonsentrasjonen (figur 2B). Glucomannan er ikke testet. De samme CPH substrater ble spaltet med kommersielt tilgjengelige enzymer (tre forskjellige enzymkonsentrasjoner: 0,1 U / ml, 0,5 U / ml og 1,0 U / ml) anvendt som positive kontroller under de samme betingelser enn de foregåeksperiment. Alle substratene ble forringet av den positive kontrollen enzymet og signalintensiteten økte tilsvarende høyere enzymkonsentrasjon (figur 2C).

Figur 2
Figur 2. Åtte forskjellige CPH substrater ble inkubert under omrøring ved 25 ° C i 30 minutter. A) Produktet plate av forskjellige substrater CPH spaltet med en endo -cellulase, ved forskjellige konsentrasjoner. B) Kvantifisering av aktiviteten og en rekke side aktivitet av endo -cellulase. Feilstolpene representerer standardfeil av gjennomsnittet av tre kopier C) Aktivitet av forskjellige kommersielle enzymer til de tilsvarende CPH substratet (endo-cellulase og 2-HE-cellulose;. E-LAMSE og CPH-pachyman, CPH-curdlan, CPH- β-glukan (bygg), E-XYAN4 og CPH-xylan, E-XEGP og CPH-xyloglucan, E-BLAAM og CPH-amylose, E-BMACJ og CPH-galaktomannankonsentrasjonen; alle enzymer fra Megazyme). De feilfelt representerer standard feil av gjennomsnittet av to kopier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

De uoppløselige kromogen biomasse (ICB) substrater er et nyttig tillegg til det kromogene substrat repertoaret fordi de beholder delvis det naturlige arrangement av polysakkarider i plantecellevegger som er hovedbestanddelen av biomasse. CPH og ICB substrater anvendt i vårt eksempel for å analysere de utskilte enzymer fra Phanerochaete chrysosporium når dyrket i flytende medium. Platen oppsett av analysesettet plate er vist på figur 3A, med 19 CPH substrater og 5 ICB substrater (4 brønner for hvert substrat, figur 3B). P. chrysosporium var fresered i tre dager og deretter kultursupernatanten analysert. Derfor ble 125 pl 200 mM buffer overført til hver brønn og 25 ul kultursupernatant ble tilsatt. Tre forskjellige pH-betingelser er blitt testet ved hjelp av natriumacetat-buffer pH 4,0, natriumfosfatbuffer, pH 6,0 eller pH 8,0 (figur 3C). Platen ble inkubert risting (150 rpm) ved 25 ° C i 2 timer.

Reaksjonsproduktene ble overført til produktplaten (figur 3D) og analysert. P. chrysosporium produserte enzymer for nedbrytning av forskjellige glukaner, stivelse og xylans (figur 3E). Lavere signalene kunne påvises for de hemicelluloser arabinan (sukkerroer) og pektin galaktan, så vel som for RGI (soyabønner). De enzymer produsert var mer aktive i sure betingelser (pH 4,0) enn i nøytrale eller svakt basiske betingelser (pH 8,0). Lavere aktivitet mot ICB underlag (figur 3F)viser at når polysakkaridene er i en mer naturlig sammenheng, er effektiviteten av enzymet ikke det samme som med et rent polysakkarid, og det er derfor ICB substrater viser et mer realistisk bilde av enzym effektivitet, hvis den ble brukt til rå eller pre- behandlede plantemateriale.

Figur 3
Figur 3. Screening av en kultur supernatant fra en 3-dagers gammel væske kultur Phanerochaete chrysosporium bruke en multi substrat plate som inneholder 19 CPH og 5 ICB underlag. A) en ordning av platen oppsett med 4 brønner for hver enkelt substrat (grå bakgrunn = CPH underlag, oransje bakgrunn = ICB underlag). B) Bilde av analyseplaten inneholder underlaget. C) Scheme viser bufferbetingelsene som brukes i det eksperimentet (200 mM natriumacetat pH 4,0, natriumfosfat, pH 6,0 og natriumfosfat, pH 8,0). D) bilde av produktet platen etter 2 timer ved 25 ° C. E) absorbanser ble påvist ved 517 nm og plottet for hver enkelt CPH substrat og F ) ICB substrat resultater for de respektive enzymer. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

De kromogene substrater kan også brukes til å studere synergistisk effekt ved anvendelse av en blanding av forskjellige fargede CPH substrater i en brønn og analysering av reaksjons supernatanten etter behandling ved hjelp av enkle enzymer eller enzym-cocktailer.

I det følgende eksempel er vist i figur 4, ble rød CPH-cellulose og gule CPH-xylan substrater blandet sammen ved en tilnærmet ekvAl-forhold på 96-brønners filterplate brønnene. Figur 4A viser de fargede reaksjonsproduktene etter 1 time behandling ved værelsetemperatur uten enzym (kontroll), cellulose cel (2 U / ml), xylanase fortelle XYL (1 U / ml) og en blanding av de to enzymer (3 replikater for hver fremgangsmåte) i 100 mM natrium-acetat-buffer pH 4,5. For analyse ble reaksjonsproduktet kvantifisert spektrofotometrisk ved å skanne Absorpsjonsspekteret fra 350 nm til 700 nm (figur 4B). Ofte visuell inspeksjon alene kan gi en indikasjon på hvorvidt enzymet virker på ett eller flere substrater, men registreres absorbansen spektra som stammer fra forskjellige farvestoffer kan også løses ved hjelp av en enkel lineær regresjon 8 for å gi en mer nøyaktig indikasjon på graden av nedbrytning av hvert substrat fra blandingen.

Ved hjelp av CPH substrater som blandinger i hovedsaken bidrar til gjennomløpet for analysen, slik at screening mot opptil 4 forskjellige underlag i ett eksperiment (én brønn). I det viste eksempel er det fire forskjellige underlag som benyttes: blå CPH-β-glukan (bygg), gul CPH-xylan (bøk), grønn CPH-amylose og rød CPH-pektinstoffer galaktan (lupin). Utformingen av substratet plate er vist på figur 4C, og et bilde av analyseplaten i figur 4D. Reaksjonen ble utført i 100 mM natrium-acetat-buffer pH 4,5 i 30 minutter ved 25 ° C og 150 rpm. De første enkelt enzymer med økende enzymkonsentrasjon, ble testet mot den tilsvarende CPH substratet (figur 4E), og den fargede supernatanten ble mottatt som forventet i produktet platen (figur 4F, rad 1A - 12D). Rad E inneholdt to forskjellige CPH substrater gul CPH-xylan og blå CPH-β-glukan, som ble nedbrutt med forskjellige forhold mellom de tilsvarende enzymene endo -xylanase og endo -glucanase. Etter reaksjonen er resultatet visible i produktet plate: fargen av reaksjonsproduktet var mørkere grønn-blå, når mer endo -glucanase var til stede (figur 4F, 4E-6E) og omgjort til en lysere gul-grønn, når den endo -xylanase konsentrasjonen øket ( Figur 4F, 10-12E). Det samme er sett i rad F, der de to substrater rød CPH-pektin galaktan og gult CPH-Xylan ble degradert med endo -galactanase og endo -xylanase. Alle fire forskjellige fargede CPH substrat var til stede (figur 4F, 1G-12F) og enkelt enzymer degradert passende CPH underlaget og ved tilsetning av ytterligere enzymer en kombinasjon av de fargede reaksjonsproduktene ble mottatt.

Figur 4
Figur 4. En kombinasjon av to forskjellige CPH substrater, red CPH-cellulose og gul CPH-xylan, behandlet med forskjellige enzymer. EN) Reaksjons supernatanter etter behandling av to substrater med endo -cellulase (cel) eller endo -xylanase (fortelle XYL) eller begge enzymer. B) absorpsjonsspektrum av reaksjons supernatantene. En kombinasjon av fire forskjellige CPH substrater behandlet med forskjellige enzymer C) Scheme av substratet plate som inneholder de CPH substrater.: Blå CPH-β-glukan (bygg), gul CPH-xylan (bøk), grønn CPH-amylose og rød CPH- pektinstoffer galaktan (lupin) D) Bilde av analyseplaten inneholdende de forskjellige CPH substrater E) Reaksjonsskjema av produktet plate som viser forholdet mellom de tilsatte enzymer (nominelle konsentrasjoner (NC).:. Glu = 1 U / ml endo -glucanase, fortelle XYL = 1 U / ml endo -xylanase, amy = 5 U / ml endo-amylase og gal = 0,5 U / ml endo -galactanase). F) Bilde av produktet plate etter 30 minutters inkubering ved 25 ° C. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Underlag Kilde
CPH-to-hydroksyetylcellulose N / A
(CPH-to-HE-cellulose)
CPH-amylopektin potet
CPH-amylose potet
CPH-arabinan sukkerroer
CPH-arabinoxylan hvete
CPH-kasein bovin melk
CPH-kitosan animalsk opprinnelse
CPH-curdlan Alcaligenes faecalis
CPH-dekstran Leuconostoc spp.
CPH-galaktomannankonsentrasjonen carob
CPH-Laminarin Laminaria digitata
CPH-lichenan islandsk mose
CPH-metylcellulose N / A
CPH-pachyman Poria cocos
CPH-pektin Galaktan potet
CPH-pullulan Aureobasidium pullulans
CPH-rhamnogalakturonan I (RG I) potet
CPH-rhamnogalakturonan I (Gal) * potet
CPH-rhamnogalakturonan soyabønne
CPH-xylan Bøkeskogen
CPH-xyloglucan tamarind
CPH-β-glukan fra bygg bygg
CPH-β-glukan fra havre havre
CPH-β-glukan fra gjær gjær
ICB-Arabidopsis Rosette går fra Arabidopsis thaliana Col-0 (voksen plante)
ICB-Arabidopsis frø Arabidopsis thaliana
ICB-bagasse Saccharum officinarum (tørket voksen plante, stilk og blader)
ICB-krystallinsk cellulose (filterpapir) kommersiell Whatman 3MM Chr Kromatografi papir
ICB-bukkehornkløver frø Trigonella spp. Frø
ICB-hamp Cannabis spp. (Tørket voksen plante, stilk og blader)
ICB-lupiner Lupinus Angustifolius frø
ICB-pollen P. pratense Phleum pratense pollen
ICB-gran Picea spp. (Milled trestamme)
ICB-tobakk går fra Nicotiana benthamiana (ung plante)
ICB-hvete halm Triticum spp. (Tørket voksen plante, stilk og blader)
ICB-willow Salix spp. (Tørket voksen plante, malt trestamme)
ICB-Sorghum Sorghum spp. (Går fra voksen plante)
* (β-1,4-D-galaktan-sidekjeder fjernes med endo -β-1,4-D-galactanase)

Tabell 1. Liste over tilgjengelige kromogen Polymer hydrogel (CPH) og Uløselig kromogen Biomasse (ICB) underlag.

Discussion

Vi bruker en ny generasjon av flerfargede CPH og ICB underlag som er basert på klortriazin fargestoffer (full liste av underlag i tabell 1) arrangert i en spesialdesignet kommersiell analyse kit. Enzymoppløsning av substratene gir små, løselige, farget produkter som er påvisbare i analyseoppløsning og kan kvantifiseres ved anvendelse av en plateleser 9. Denne analysen er utformet for evaluering av endo -acting enzymer og sensitiviteten til analysen er lik den ved hjelp av en azurine tverrbundet (AZCL) substrater 10, mens andre fremgangsmåter er tilgjengelige for exo -acting enzymer 11,12. Begrensningen av denne analysen kit ligger i deteksjon av endo -enzyme aktivitet, CPH samt ICB underlag ikke er nedbrytbare ved exo -enzymes mest sannsynlig på grunn av sterisk hindring som følge av fargestoff og tverrbindingsmolekyler 8.

Analysen utføres i en 96-AGl format og individuelle reaksjoner finner sted i brønnene. Reaksjonen må blandes i platen for å få reproduserbare data. De resulterende supernatantene filtreres inn i et produkt plate hvor absorbansen til hver brønn kan kvantifiseres ved hjelp av absorbans-spektrometri. De grunnleggende prinsipper og utformingen av analysen er vist i figur 1. Analysen består av en analyseplate (en 96-brønns filterplate) med substratene, og etter inkubasjon med enzymer, blir supernatanten filtreres gjennom inn i en klar brønners plate og absorbansene leses å gi en semi-kvantitativ måling av enzym spesifisitet og aktivitet. Det har vist seg, at denne screening-analyse ved bruk av CPH substrater kan også brukes i en agarplate format, hvor de oppløselige reaksjonsprodukter lage en farget halogen etter inkubasjon over natten. 8

Analysesett kan brukes til å screene rensede enzymer og deres potensielle side aktivitet som demonstrert iFigur 2. Side-aktiviteter kan oppstå fra et enkelt enzym og dets promiskuøse spesifisitet, men også fra et faktum at prøven analyseres er en blanding av forskjellige enzymer og deres synergistisk effekt må studeres. I tillegg, som det har vært vist i tidligere studier, at enzym cocktails, tarmbakterieflora 13 og dyrkningsvæsker fra sopp 8 så vel som endogen plante-enzym og bakterier (upubliserte data) kan anvendes som en enzymkilde.

ICB underlag løse komplekse blandinger av celleveggkomponenter ofte oppstått i industrielle prosesser for nedbryting av biomasse. Disse underlag er utformet for å evaluere polysakkarid tilgjengelighet og gi informasjon om hvordan du effektivt optimalisere nedbrytnings cocktails for mer effektiv nedbrytning utgang. Som illustrert i figur 3 CPH og ICB underlag kan brukes i enzym screening ved siden av hverandre - å avsløre et vell av informasjon om enzymet spesifisitet end aktivitet både i sammenheng med den foretrukne substrat (CPH) og en mer naturlig kompleks som inneholder andre komponenter i tillegg til det foretrukne substratet nærmere å etterligne en makromolekylær sammenstilling som finnes i naturen (ICB). Bruk av flere farger muliggjør samtidig deteksjon av forskjellige enzymaktiviteter mot flere substrater som øker hurtig og multiplexity av analysen. Spektra for forskjellige fargestoffer kan løses ved enkel lineær regresjon, og i de fleste tilfeller flere substrat-aktivitet kan observeres ved visuell inspeksjon alene. En simulert eksempel på et slikt eksperiment, og resultatene er vist i figur 4.

Denne analysen verktøykasse og allsidigheten til sin søknad er svært godt egnet for første nivå screening av enzymer og kulturbuljonger med ukjente aktiviteter. De viktigste aspektene ved denne analysen er det høy gjennomstrømming natur, skreddersy, brukervennlighet og fleksibilitet. Med det i tankene, we tror at denne romanen sett med verktøy vil gi betraktelig bedre og raskere enzym screening prosesser i industriell samt akademiske programmer.

Disclosures

Det er to patentsøknader som involverer 96-brønns plate CPH substratmetode og 96-brønners-assay ICB substrat (WO2015036000 og Danmark PA 2 015 70 311).

Acknowledgments

Vi ønsker å takke professor J. Paul Knox (University of Leeds, UK), som ga tilgang til hans laboratorier for filming, og Susan E. Marcus for utmerket teknisk assistanse. JS erkjenner WallTraC prosjektet (European Commission syvende rammeprogram (tilskuddsavtalen. Nr: 263 916) og prosjektet biomasse for det 21. århundre (Innovasjon fundament Danmark, sak nr .: 103408) SKK takker den SET4Future prosjektet (Dansk Strategic Research Council), Bio-Value Strategisk grunnlagt av den danske Rådet for Strategic Research, den danske Rådet for teknologi og innovasjon (Grant sak nr .: 0603-00522B), og en biologi-drevet tilnærming for å forstå enzymatisk nedbrytning av Complex polysakkarid Systems (Grant Saksnr .:. 107 279) for finansiering Dette papiret reflekterer forfatternes syn bare den europeiske union er ikke ansvarlig for bruk som kan gjøres av informasjonen inneholde her..

Materials

Name Company Catalog Number Comments
assay kit plates Glycospot customized assay kit plates
activation solution Glycospot for activating CPH substrates
350 ml receiver plate spacer block for vacuum manifold Pall Corporation 5015 spacer block
96-well MultiScreen HV filter plate, 0.45 µm, clear, non-sterile Millipore MSHVN4510 assay plate
96-Well Microplates, Polypropylene Greiner Bio-One 651201 collection plate after washing the substrates
Nunc MicroWell 96-Well Microplates Thermo Scientific 269620 product plate
Diaphragm pump MZ 2 NT Vacuubrand 732000 vacuum pump used with the vacuum manifold
Infors HT Ecotron Infors HT 4950132 (Buch & Holm) horizontal shaker
SpectraMax M5 Molecular Devices 10067-750 (VWR) 96-well plate absorbance reader
Vacuum manifold Pall Corporation 5017 vacuum manifold
endo-cellulase (EGII) (Trichoderma longibrachiatum) Megazyme E-CELTR cellulase [cel]
endo-β-1,4-mannanase (Cellvibrio japonicus Megazyme E-BMACJ mannanase [man]
endo-β-1,3-glucanase (Trichoderma spp.) Megazyme E-LAMSE β-glucanase [glu]
endo-β-1,4-D-galactanase (Aspergillus niger Megazyme E-EGALN galactanase [gal]
endo-β-1,4-xylanase M4 (Aspergillus niger Megazyme E-XYAN4 xylanase [xyl]
endo-xyloglucanase (GH5) (Paenibacillus sp. Megazyme E-XEGP xyloglucanase [xg]
α-amylase (Bacillus licheniformis Megazyme E-BLAAM amylase [amy]

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lombard, V., Ramulu, H. G., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013. Nucleic Acids Res. 42, (Database issue), D490-D495 (2014).
  2. Cantarel, B. L., et al. The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics. Nucleic Acids Res. 37, D233-D238 (2009).
  3. Agblevor, F. A., Murden, A., Hames, B. R. Improved method of analysis of biomass sugars using high-performance liquid chromatography. Biotechnol. Lett. 26, (15), 1207-1211 (2004).
  4. Black, G. E., Fox, A. Recent progress in the analysis of sugar monomers from complex matrices using chromatography in conjunction with mass spectrometry or stand-alone tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 720, (1-2), 51-60 (1996).
  5. Miller, G. L. Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar. Anal. Chem. 31, 426-428 (1959).
  6. Somogyi, M. Notes on Sugar Determination. J. Biol. Chem. 195, (1), 19-23 (1952).
  7. Zantinge, J. L., Huang, H. C., Cheng, K. J. Microplate diffusion assay for screening of beta-glucanase-producing microorganisms. Biotechniques. 33, (4), 798 (2002).
  8. Kračun, S. K., et al. A new generation of versatile chromogenic substrates for high-throughput analysis of biomass-degrading enzymes. Biotechnol Biofuels. 8, (2015).
  9. Leemhuis, H., Kragh, K. M., Dijkstra, B. W., Dijkhuizen, L. Engineering cyclodextrin glycosyltransferase into a starch hydrolase with a high exo-specificity. J. Biotechnol. 103, (3), 203-212 (2003).
  10. Nyyssonen, M., et al. Coupled high-throughput functional screening and next generation sequencing for identification of plant polymer decomposing enzymes in metagenomic libraries. Front Microbiol. 4, 282 (2013).
  11. Sweeney, M. D., Xu, F. Biomass Converting Enzymes as Industrial Biocatalysts for Fuels and Chemicals: Recent Developments. Catalysts. 2, (2), 244-263 (2012).
  12. Biely, P., et al. Action of xylan deacetylating enzymes on monoacetyl derivatives of 4-nitrophenyl glycosides of beta-D-xylopyranose and alpha-L-arabinofuranose. J. Biotechnol. 151, (1), 137-142 (2011).
  13. Mackenzie, A. K., et al. A polysaccharide utilization locus from an uncultured bacteroidetes phylotype suggests ecological adaptation and substrate versatility. Appl Environ Microbiol. 81, (1), 187-195 (2015).
Høy throughput screening av karbohydrat-nedbrytende enzymer Bruke Novel Uløselig kromogen substratmetode Kits
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schückel, J., Kračun, S. K., Willats, W. G. T. High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits. J. Vis. Exp. (115), e54286, doi:10.3791/54286 (2016).More

Schückel, J., Kračun, S. K., Willats, W. G. T. High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits. J. Vis. Exp. (115), e54286, doi:10.3791/54286 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter