Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

High-throughput screening av kolhydratnedbrytande enzymer Använda Novel Olöslig kromogena substratmetod Kits

doi: 10.3791/54286 Published: September 20, 2016
* These authors contributed equally

Protocol

1. kromogenanalys med CPH Substrat i en 96-brunnars plattformat

  1. Aktivering av analyskitet plattan
    1. Aktivera 96-brunnsfilter (innehållande blå CPH-xylan) analyssats platta (Förteckning över material) genom att tillsätta 200 ^ aktiveringslösning (erhållen med kitet) i varje brunn, följt av 10 min inkubation vid rumstemperatur utan omrörning.
    2. Applicera vakuum med hjälp av en vakuumgrenrör (med distansblocket inuti och någon standard, transparent 96-brunnar som en samling platta) för att avlägsna bevarade aktivering lösning. Det är även möjligt att använda en centrifug vid 2700 xg under 10 min för detta steg i stället för vakuumgrenröret.
    3. Tvätta CPH substrat genom att tillsätta 100 ul sterilt vatten och tillämpa vakuum (eller centrifugalkraft) för att avlägsna stabilisatorn. Upprepa detta steg två gånger och plattorna är nu klar att användas.
  2. enzym~~POS=TRUNC reaktionen~~POS=HEADCOMP
    OBS: inkluderar alltid buffertensamt som en negativ kontroll och om möjligt tidigare karakteriserade enzymer som positiva kontroller. Använd ett statistiskt lämpligt antal replikat. CPH substrat är stabila mellan pH 3,0 till 10,0 och den totala volymen av buffertslutenzymlösning i varje brunn bör inte överstiga 180 l. Växtextrakt eller odlingsbuljongen kan också användas i stället för renad enzymlösning.
    1. Lägg 150 | il 100 mM natriumacetatbuffert, pH 4,5 och 5 | j, l endo -cellulase lösning (till en slutkoncentration av 1 U / ml) till varje brunn i analyskitet plattan.
    2. Placera produkten plattan (en tydlig brunnar kompatibel med mikrotiter-plattläsaren) under analyskitet plattan för att samla eventuella läckage från reaktionsplattan under skakning.
    3. Inkubera analyskitet plattan vid 25 ° C under 30 min i en horisontell skakanordning vid 150 rpm.
      OBS: Blandning reaktionen i analyskitet plattan under inkubationen är avgörande för att uppnå en konsekvent och reproskapas resultat. CPH substrat är stabila upp till 90 ° C. Inkubationstiden bör ökas med upp till 24 timmar vid provning odlingsbuljonger innehållande okända enzymkoncentrationer med CPH substrat. Notera att lämpliga inkubationstider beroende av aktiviteten av enzymet (s), men i allmänhet, om det inte finns någon detekterbar aktivitet inom 24 h, är det troligt att enzymet inte kommer att försämra den testade substratet. Ett aktivt enzym är förnedrande de olösliga kromogena polysackarider av den CPH substratet till lösliga kromogena oligosackarider, vilka är synliga som färgad supernatant.
    4. Placera rena produktplattan inuti vakuumgrenrör med distansblocket inuti.
    5. Placera analyskitet platta ovanpå och anbringa vakuum (maximal negativ tryck av -60 kPa). Det är även möjligt att använda en centrifug vid 2700 xg under 10 min.
      OBS: Filtratet innehållande de färgade oligosackarider som reaktionsprodukten är nu i produktplattan för vidare analys 8
  3. Detektion och kvantifiering
    1. Kontrollera att volymen av vätska i varje brunn av produkten plattan är ungefär densamma genom visuell inspektion.
    2. Läs av absorbansen av uppsamlingsplattan vid 595 nm för blått CPH-xylan med användning av en plattläsare.
    3. När du gör dataanalys, subtrahera buffert enbart negativa kontrollvärden från värdena från brunnar där ett enzym tillsattes. Beräkna medelvärdet och standardfelet av medel (SEM) från brunnar i replikat 8.

2. kromogenanalys med ICB Substrat i ett 96-brunnsformat

  1. enzym~~POS=TRUNC reaktionen~~POS=HEADCOMP
    1. Tillsätt 150 | il 100 mM natriumacetatbuffert, pH 4,5 och 5 | il 31 U / ml endo -xylanase lösning till varje brunn av analyskitet platta innehållande röda strå ICB-vete (slutlig enzymkoncentration i brunnen: 1 U / ml) .
      OBS: analyskitet plattor (96 brunnar filter plates innehåller ICB substrat) tillverkas som beskrivits i litteraturen (se lista över material). ICB substrat är stabila i buffertar med ett pH-intervall mellan pH 3,0 till 10,0. inkluderar alltid enbart buffert som en negativ kontroll, kommersiella enzymer som en positiv kontroll och använda ett statistiskt lämpligt antal kopior.
      1. Inte aktiverar de ICB substraten såsom CPH substratplattan, men ta bort stabilisatorn genom tvättning tre gånger med 100 | il vatten, följt av vakuumfiltrering eller centrifugering.
    2. Sätt produktplattan under substratplattan för att samla eventuella läckage från substratplattan under skakning.
    3. Inkubera reaktionen vid 25 ° C under skakning vid 150 varv per minut under 2 timmar.
      OBS: Ett aktivt enzym är förnedrande de olösliga kromogena polysackarider i ICB substratet i lösliga oligosackarider, som är synliga som färgad supernatant. ICB substrat är stabila upp till 90 ° C. Inkubationen time bör ökas upp till 24 tim, om icke-renade enzymer såsom odlingsbuljonger användes.
    4. Placera produkten plattan inuti vakuumgrenrör med distansblocket inuti.
    5. Placera analyskitet platta ovanpå och anbringa vakuum (maximal negativ tryck av -60 kPa) eller använda en centrifug för att filtrera produkten från analyskitet plattan in i brunnen av produkten plattan.
      OBS: Filtratet innehållande de färgade oligosackarider som reaktionsprodukten är nu i uppsamlingsplattan för vidare analys 8.
  2. Detektion och kvantifiering
    1. Kontrollera att volymen av vätska i varje brunn i uppsamlingsplattan är ungefär densamma genom visuell inspektion.
    2. Läs av absorbansen av uppsamlingsplattan vid 517 nm för röd ICB-vetehalm med användning av en plattläsare.
    3. När du gör dataanalys - subtrahera buffert - enda negativa kontrollvärden från värdena från brunnar där ett enzymlades till. Beräkna medelvärdet och standardfelet av medel (SEM) från brunnar i replikat 8.
      OBS: Vid screening okända enzymer, föreslår vi att göra en spädningsserie för att få mer detaljerade uppgifter om det dynamiska omfånget av enzymets aktivitet.

Representative Results

Hög genomströmning och multiplexering kapacitet på denna analys är baserad på olöslig kromogent polymer (eller protein) hydrogel (CPH) substrat arrangerade i 96-brunnars filterplattor. Enzymer såväl som negativa kontroller tillsätts till analyskitet plattan (Figur 1A) och enzymerna försämra motsvarande substrat som producerar en färgad supernatant (Figur 1B). Efter det att reaktionen är avslutad, supernatanten överfördes till en klar-well produktplatta och absorbansen kan mätas direkt med användning av en spektrofotometer som lämpar sig för 96-brunnsplattor (Figur 1C).

Ett exempel på en dos-respons av CPH-arabinoxylan till xylanas vid olika koncentrationer av enzymet (från 0,00 till 0,75 U / ml) visas i figur 1D där kan observeras den minskande enzymkoncentration visuellt. En mer detaljerad spektrofotometrisk quantförgasning kan användas för att plotta absorbansen kontra enzymkoncentrationen (figur 1E). Signalintensiteten motsvarar den enzymaktivitet. Reproducerbarheten av analysen visas genom felstaplar (medelvärdets medelfel, SEM, av tre repliker). Mer detaljerade experiment på reproducerbarheten för denna analys finns publicerade på annat håll 8.

Figur 1
Figur 1. xylanasbehandling av CPH-arabinoxylan. A) Ett system av analyskitet plattan med CPH substrat (t.ex. CPH-arabinoxylan) laddas i 96-brunnars filterplattbrunnar strax före tillsatsen av enzymerna 1 och 2 och bufferten -Endast kontroll (enzym 1 hade endo -xylanase aktivitet), B) Nedbrytning av CPH-arabinoxylan genom enzym en producerade en färgad supernatant, C) vid vakuumassisterad filtratjon av supernatanterna i till produktplåten, mäts absorbansen spektrofotometriskt; D) produkt platta innehållande reaktionsprodukterna efter behandling av CPH-arabinoxylan i 4 olika färger med olika koncentrationer av endo -β-1,4-xylanas i 100 mM natriumacetatbuffert, pH 4,5 under 60 minuter vid rumstemperatur;. E) Kvantifiering av reaktionsprodukterna från D med hjälp av spektrofotometri klicka här för att se en större version av denna siffra.

Det finns olika alternativ för att använda denna analys i enzym screening. Ett alternativ är att använda en 96-brunnar innehåller olika polysackarider för screening, t.ex. ett litet antal (renat) endo -enzymes med okänd aktivitet. I detta fall resultatet kommer att visa vilka polysackarider är Degradmöjlighet att med målenzymet. För att visa denna princip, var ett endo -cellulase testades mot olika CPH substrat vid 25 ° C. Tre olika enzymkoncentrationer (0,5 U / ml, 1,0 U / ml och 5 U / ml) inkuberades under 30 min. Resultatet är klart synlig i produkten plattan (Figur 2A). Produktblad för denna endo -cellulase tillhandahålls av leverantören anger sido aktivitet för xyloglukan (tamarind), korn β-glukan, glukomannan, björkträxylan och underkant-aktivitet för galaktomannan. I överensstämmelse med detta har verksamhet utöver cellulas dömt CPH-β-glukan (korn), CPH-xyloglukan (tamarind), CPH-xylan (bokträ) och låg aktivitet mot CPH-galaktomannan (Figur 2B). Glukomannan har inte testats. Samma CPH substrat digererades med kommersiellt tillgängliga enzymer (tre olika enzymkoncentrationer: 0,1 U / ml, 0,5 U / ml och 1,0 U / ml) användes som positiva kontroller under samma betingelser än den tidigareexperimentera. Alla substrat ned av den positiva kontrollen enzymet och signalintensiteten ökade motsvarande högre enzymkoncentration (figur 2C).

figur 2
Figur 2. Åtta olika CPH substrat inkuberades under omrörning vid 25 ° C under 30 minuter. A) Produkten platta olika CPH substrat rötas med ett endo -cellulase, vid olika koncentrationer. B) Kvantifiering av verksamheten och olika sido aktivitet endo -cellulase. Felgränserna representerar standardfelet av medelvärdet av tre kopior C) Aktivitet av olika kommersiella enzymer till motsvarande CPH substrat (endo-cellulas och 2-HE-cellulosa,. E-LAMSE och CPH-pachyman, CPH-kurdian, CPH- β-glukan (korn), E-XYAN4 och CPH-xylan, E-XEGP och CPH-xyloglukan, E-BLAAM och CPH-amylos, E-BMACJ och CPH-galaktomannan; alla enzymer från Megazyme). Felgränserna representerar standardfelet av medelvärdet av två kopior. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

De olösliga kromogent biomassa (ICB) substrat är ett bra komplement till det kromogena substratet repertoar eftersom de behåller delvis naturliga arrangemang av polysackarider i växtcellväggar som är huvudbeståndsdelen av biomassa. CPH och ICB substrat används i vårt exempel för att analysera de utsöndrade enzymer Phanerochaete chrysosporium när odlas i flytande medium. Plattan inställningen av analyskitet plattan visas i figur 3A, med 19 CPH substrat och 5 ICB substrat (4 brunnar för varje substrat, figur 3B). P. chrysosporium var cultivated i tre dagar och sedan odlingssupernatanten analyserades. Därför var 125 | j, l 200 mM buffert överfördes till varje brunn och 25 | j, l odlingssupernatant sattes. Tre olika pH-betingelser har testats med användning av natriumacetatbuffert, pH 4,0, natrium-fosfatbuffert pH 6,0 eller pH 8,0 (figur 3C). Plattan inkuberades skakning (150 rpm) vid 25 ° C under 2 h.

Reaktionsprodukterna överfördes till produktplattan (figur 3D) och analyserades. P. chrysosporium producerade enzymer för nedbrytning av olika glukaner, stärkelse och xylaner (figur 3E). Lägre signaler kunde detekteras för hemicellulosa arabinan (sockerbetor) och pektinämnen galaktan samt RGI (soja). De enzymer som produceras var mer aktiva i sura betingelser (pH 4,0) än i neutrala eller svagt basiska betingelser (pH 8,0). Lägre aktivitet mot ICB substrat (Figur 3F)visar att när polysackarider är i ett mer naturligt sammanhang, är inte samma sak som med en ren polysackarid effektiviteten av enzymet och det är därför ICB substrat visa en mer realistisk syn på enzym effektivitet, om det tillämpas på rå eller pre- behandlat växtmaterial.

Figur 3
Figur 3. Screening av en odlingssupernatant från en 3-dagars gamla vätskekultur av Phanerochaete Chrysosporium användning av en flersubstratplatta innehållande 19 CPH och 5 ICB substrat. A) ett system av plattan setup med 4 brunnar för varje enskild substrat (grå bakgrund = CPH substrat, orange bakgrund = ICB-substrat). B) Bild på analysplattan innehållande substratet. C) Scheme visar buffertbetingelser som används i detta experiment (200 mM natriumacetat, pH 4,0, natriumfosfat pH 6,0 och natriumfosfat pH 8,0). D) bild av produkten plattan efter 2 h vid 25 ° C. E) Absorbanser detekterades vid 517 nm och plottades för varje enskild CPH substrat och F ) ICB substrat resultat för respektive enzymer. klicka här för att se en större version av denna siffra.

De kromogena substrat kan också användas för att studera synergistiska effekter genom att använda en blandning av olika färgade CPH substrat i en brunn och analys av reaktionsvätskan efter behandling med användning av enstaka enzymer eller enzym cocktails.

I följande exempel som visas i fig 4, var röd CPH-cellulosa och gula CPH-xylan substrat blandas tillsammans vid en ungefär equal-förhållandet i 96-brunnars filterplattbrunnar. Figur 4A visar de färgade reaktionsprodukter efter 1 h behandling vid rumstemperatur med inget enzym (kontroll), cellulosa cel (2 U / ml), xylanas xyl (1 U / ml) och en blandning av båda enzymerna (3 replikat för varje metod) i 100 mM natriumacetatbuffert, pH 4,5. För analys befanns reaktionsprodukten kvantifieras spektrofotometriskt genom avläsning av absorbansen spektrum från 350 nm till 700 nm (Figur 4B). Ofta visuell inspektion ensam kan ge en indikation på om enzymet agerar på en eller flera substrat, men registreras absorbansspektra härrör från olika färgämnen kan också lösas med hjälp av enkel linjär regression 8 för att ge en mer korrekt bild av omfattningen av nedbrytningen av varje substrat från blandningen.

Med användning CPH substrat som blandningar väsentligen bidrar till genomströmningen av analysen, vilket möjliggör screening mot upp till 4 olika substrat i ett experiment (en brunn). I det visade exemplet finns fyra olika substrat som används: blått CPH-β-glukan (korn), gul CPH-xylan (bokträ), grön CPH-amylos och röd CPH-pektinsyra galaktan (lupin). Layouten på substratplattan visas i figur 4C och en bild av analysplattan i figur 4D. Reaktionen utfördes i 100 mM natriumacetatbuffert, pH 4,5 under 30 min vid 25 ° C och 150 rpm. Första singeln enzymer med ökande enzymkoncentration testades med motsvarande CPH substrat (Figur 4E) och den färgade supernatanten togs emot som förväntat i produktplåten (Figur 4F rad 1A - 12D). Raden E innehöll två olika CPH substrat gul CPH-xylan och blå CPH-β-glukan, som degraderades med olika förhållanden av de motsvarande enzymerna endo -xylanase och endo-glukanas. Efter reaktionen, är resultatet visible i produktplåten: färgen på reaktionsprodukten var mörkare grön-blå, när mer endo-glukanas var närvarande (figur 4F, 4E-6E) och förvandlas till en ljusare gul-grön, när Endo -xylanase koncentrationen ökat ( Figur 4F, 10-12E). Samma ses i rad F, där de två substraten röda CPH-pektinsyra galaktan och gult CPH-xylan degraderades med endo -galactanase och endo -xylanase. Alla fyra olika färgade CPH substrat var närvarande (figur 4F, 1G-12F) och enstaka enzymer försämras lämplig CPH substrat och genom att lägga till ytterligare enzymer en kombination av de färgade reaktionsprodukter mottogs.

figur 4
Figur 4. En kombination av två olika CPH substrat, röd CPH-cellulosa och gul CPH-xylan, behandlades med olika enzymer. en) Reaktions supernatanter efter behandling av två substrat med Endo -cellulase (cel) eller Endo -xylanase (Xyl) eller båda enzymerna. B) absorbansspektra av reaktions supernatanterna. En kombination av fyra olika CPH substrat som behandlats med olika enzymer C) Schema av substratplatta innehållande de CPH substrat:. Blå CPH-β-glukan (korn), gul CPH-xylan (bokträ), grön CPH-amylos och röd CPH- pektinämnen galaktan (lupin) D) Bild av analysplattan som innehåller de olika CPH substrat E) ​​Scheme of produktplattan som visar förhållandet mellan de tillsatta enzymerna (nominella koncentrationer (NC).. glu = 1 U / ml endo-glukanas, XYL = 1 U / ml endo -xylanase, amy = 5 U / ml endo-amylas och gal = 0,5 U / ml endo -galactanase). F) Bild på produkten plattan efter 30 min inkubation vid 25 ° C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Substrat Källa
CPH-2-hydroxietylcellulosa N / A
(CPH-2-HE-cellulosa)
CPH-amylopektin potatis
CPH-amylos potatis
CPH-arabinan sockerbeta
CPH-arabinoxylan vete
CPH-kasein bovin mjölk
CPH-kitosan animaliskt ursprung
CPH-kurdian Alcaligenes faecalis
CPH-dextran Leuconostoc spp.
CPH-galaktomannan carob
CPH-laminarin Laminaria digitata
CPH-lichenan isländsk mossa
CPH-metylcellulosa N / A
CPH-pachyman Poria cocos
CPH-pektinämnen galaktan potatis
CPH-pullulan Aureobasidium pullulans
CPH-ramnogalakturonan I (RG I) potatis
CPH-ramnogalakturonan I (-Gal) * potatis
CPH-ramnogalakturonan sojaböna
CPH-xylan bokträ
CPH-xyloglukan tamarind
CPH-β-glukan från korn korn
CPH-β-glukan från havre havre
CPH-β-glukan från jäst jäst
ICB-Arabidopsis Rosettblad från Arabidopsis thaliana Col-0 (vuxen växt)
ICB-Arabidopsis frön Arabidopsis thaliana
ICB-bagass Saccharum officinarum (torkad vuxen växt, stam och blad)
ICB-kristallin cellulosa (filterpapper) kommersiell Whatman 3MM Chr Chromatography papper
ICB-bockhornsklöverfrön Trigon spp. Utsäde
ICB-hampa Cannabis spp. (Torkade vuxen växt, stam och blad)
ICB-lupinfrön Blålupin frön
ICB-pollen P. pratense Phleum pratense pollen
ICB-gran Picea spp. (Mifylld trädstam)
ICB-tobak avgår från Nicotiana benthamiana (ung planta)
halm ICB-vete Triticum spp. (Torkade vuxen växt, stam och blad)
ICB-vide Salix spp. (Torkade vuxen växt, slipat trädstam)
ICB-Sorghum Sorghum spp. (Avgår från vuxen växt)
* (β-1,4-D-galaktan sidokedjor avlägsnas med endo -β-1,4-D-galaktanas)

Tabell 1. Förteckning över tillgängliga kromogena Polymer hydrogel (CPH) och olösliga Chromogenic biomassa (ICB) substrat.

Discussion

Vi använder en ny generation av flerfärgade CPH och ICB substrat som är baserade på Klortriazin färgämnen (fullständig förteckning över substrat i tabell 1) anordnade i en specialdesignad kommersiell analysutrustning. Enzymdigerering av substraten ger små, lösliga, färgade produkter som är detekterbara i analyslösningen och kan kvantifieras med användning av en plattläsare 9. Denna analys är utformad för utvärdering av endo-verkande enzymer och känsligheten hos analysen är liknande den som använder azurin tvärbunden (AZCL) substrat 10, under det att andra metoder finns tillgängliga för exo-verkande enzymer 11,12. Begränsningen av denna analyssats ligger i att detekteringen av endo -enzyme aktivitet, CPH liksom ICB substraten inte brytas ned genom exo -enzymes sannolikt på grund av steriskt hinder till följd av de färgämnes och tvärbindande molekyler 8.

Analysen utförs i en 96-well format och individuella reaktioner sker i brunnarna. Reaktionen måste blandas i plattan för att få reproducerbara data. De resulterande supernatanterna filtrerades in i en produktplatta där absorbansen hos varje brunn kan kvantifieras med användning av absorbans-spektrometri. De grundläggande principerna och layouten för analysen visas i figur 1. Analysen består av en analysplatta (en 96-brunnars filterplatta) med substraten, och efter inkubering med enzymer, supernatanten filtrerades genom till en klar brunnars platta och absorbanserna läses tillhandahålla en semi-kvantitativ mätning av enzymspecificitet och aktivitet. Det har visats, att denna screeningsanalys med användning av CPH substrat kan också användas i en agarplatta format, där de lösliga reaktionsprodukter skapar en färgad halo efter inkubation över natten. 8

De analyskit kan användas för att screena renade enzymer och deras potentiella sido aktiviteter såsom visas iFigur 2. Sido aktiviteter kan uppstå från en enda enzym och dess promiskuösa specificitet men också från ett faktum att det analyserade provet är en blandning av olika enzymer och deras synergistisk effekt behöver studeras. Dessutom, som det har visats i tidigare studier, att enzym cocktails, tarmfloran 13 och odlingsbuljonger från svampar 8 såväl som endogent växtenzymet och bakterier (opublicerade data) kan användas som en enzymkälla.

ICB substrat adress komplexa blandningar av cellväggskomponenter ofta påträffas i industriella processer uppdelning biomassa. Dessa substrat är utformade för att utvärdera polysackarid tillgänglighet och ge information om hur man effektivt optimera nedbrytnings cocktails för mer effektiv produktion nedbrytning. Som visas i figur 3 CPH och ICB substrat kan användas i enzym screening sida vid sida - att avslöja en mängd information om enzym specificitet end-aktivitet i både ramen för det föredragna substratet (CPH) och en mer naturlig komplex innehållande andra komponenter utöver det föredragna substratet närmare härma ett makromolekylärt aggregat finns i naturen (ICB). Användningen av flera färger möjliggör samtidig detektion av olika enzymaktiviteter mot flera substrat, vilka ökar med hög genomströmning och multiplexity av analysen. Spektra för olika färgämnen kan lösas genom enkel linjär regression och i de flesta fall flersubstrataktivitet kan observeras genom visuell inspektion ensam. Ett simulerat exempel på ett sådant experiment och dess resultat visas i fig 4.

Denna analys verktygslåda och mångsidigheten i sin ansökan är mycket väl lämpade för första nivån screening av enzymer och odlingsbuljonger med okända aktiviteter. De viktigaste aspekterna av denna analys är dess höga kapacitet natur, anpassningsförmåga, användarvänlighet och flexibilitet. Med detta i åtanke, we tror att denna nya uppsättning verktyg i hög grad kommer att förbättra och påskynda enzymkontrollprocesser inom industrin såväl som akademiska program.

Disclosures

Det finns två patentansökningar som lämnas in som omfattar 96-brunnar CPH substratanalys och 96-brunnars ICB substratmetoden (WO2015036000 och Danmark PA 2015 70311).

Acknowledgments

Vi vill tacka professor J. Paul Knox (University of Leeds, Storbritannien), som gav tillgång till sina laboratorier för filmning, och Susan E. Marcus för utmärkt tekniskt stöd. JS erkänner WallTraC projektet (European Commission sjunde ramprogram (bidragsavtal nr. 263.916) och projektet Biomassa för 21: a århundradet (Innovation Foundation Danmark, om ingen .: 103.408) SKK är tacka SET4Future projektet (danska Strategic Research Council), Bio-värde strategiska grundades av den danska rådet för strategisk forskning, det danska rådet för teknologi och innovationer (Grant Boett nr .: 0603-00522B), och A Biologi-strategi för att förstå enzymatiska nedbrytningen av komplexa polysackarid Systems (Grant Boett nr .:. 107.279) för finansiering Detta dokument visar författarnas synpunkter endast Europeiska unionen är inte ansvarig för någon användning som kan göras av informationen häri innehåller..

Materials

Name Company Catalog Number Comments
assay kit plates Glycospot customized assay kit plates
activation solution Glycospot for activating CPH substrates
350 ml receiver plate spacer block for vacuum manifold Pall Corporation 5015 spacer block
96-well MultiScreen HV filter plate, 0.45 µm, clear, non-sterile Millipore MSHVN4510 assay plate
96-Well Microplates, Polypropylene Greiner Bio-One 651201 collection plate after washing the substrates
Nunc MicroWell 96-Well Microplates Thermo Scientific 269620 product plate
Diaphragm pump MZ 2 NT Vacuubrand 732000 vacuum pump used with the vacuum manifold
Infors HT Ecotron Infors HT 4950132 (Buch & Holm) horizontal shaker
SpectraMax M5 Molecular Devices 10067-750 (VWR) 96-well plate absorbance reader
Vacuum manifold Pall Corporation 5017 vacuum manifold
endo-cellulase (EGII) (Trichoderma longibrachiatum) Megazyme E-CELTR cellulase [cel]
endo-β-1,4-mannanase (Cellvibrio japonicus Megazyme E-BMACJ mannanase [man]
endo-β-1,3-glucanase (Trichoderma spp.) Megazyme E-LAMSE β-glucanase [glu]
endo-β-1,4-D-galactanase (Aspergillus niger Megazyme E-EGALN galactanase [gal]
endo-β-1,4-xylanase M4 (Aspergillus niger Megazyme E-XYAN4 xylanase [xyl]
endo-xyloglucanase (GH5) (Paenibacillus sp. Megazyme E-XEGP xyloglucanase [xg]
α-amylase (Bacillus licheniformis Megazyme E-BLAAM amylase [amy]

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lombard, V., Ramulu, H. G., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013. Nucleic Acids Res. 42, (Database issue), D490-D495 (2014).
  2. Cantarel, B. L., et al. The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics. Nucleic Acids Res. 37, D233-D238 (2009).
  3. Agblevor, F. A., Murden, A., Hames, B. R. Improved method of analysis of biomass sugars using high-performance liquid chromatography. Biotechnol. Lett. 26, (15), 1207-1211 (2004).
  4. Black, G. E., Fox, A. Recent progress in the analysis of sugar monomers from complex matrices using chromatography in conjunction with mass spectrometry or stand-alone tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 720, (1-2), 51-60 (1996).
  5. Miller, G. L. Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar. Anal. Chem. 31, 426-428 (1959).
  6. Somogyi, M. Notes on Sugar Determination. J. Biol. Chem. 195, (1), 19-23 (1952).
  7. Zantinge, J. L., Huang, H. C., Cheng, K. J. Microplate diffusion assay for screening of beta-glucanase-producing microorganisms. Biotechniques. 33, (4), 798 (2002).
  8. Kračun, S. K., et al. A new generation of versatile chromogenic substrates for high-throughput analysis of biomass-degrading enzymes. Biotechnol Biofuels. 8, (2015).
  9. Leemhuis, H., Kragh, K. M., Dijkstra, B. W., Dijkhuizen, L. Engineering cyclodextrin glycosyltransferase into a starch hydrolase with a high exo-specificity. J. Biotechnol. 103, (3), 203-212 (2003).
  10. Nyyssonen, M., et al. Coupled high-throughput functional screening and next generation sequencing for identification of plant polymer decomposing enzymes in metagenomic libraries. Front Microbiol. 4, 282 (2013).
  11. Sweeney, M. D., Xu, F. Biomass Converting Enzymes as Industrial Biocatalysts for Fuels and Chemicals: Recent Developments. Catalysts. 2, (2), 244-263 (2012).
  12. Biely, P., et al. Action of xylan deacetylating enzymes on monoacetyl derivatives of 4-nitrophenyl glycosides of beta-D-xylopyranose and alpha-L-arabinofuranose. J. Biotechnol. 151, (1), 137-142 (2011).
  13. Mackenzie, A. K., et al. A polysaccharide utilization locus from an uncultured bacteroidetes phylotype suggests ecological adaptation and substrate versatility. Appl Environ Microbiol. 81, (1), 187-195 (2015).
High-throughput screening av kolhydratnedbrytande enzymer Använda Novel Olöslig kromogena substratmetod Kits
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schückel, J., Kračun, S. K., Willats, W. G. T. High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits. J. Vis. Exp. (115), e54286, doi:10.3791/54286 (2016).More

Schückel, J., Kračun, S. K., Willats, W. G. T. High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits. J. Vis. Exp. (115), e54286, doi:10.3791/54286 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter