Summary
हम यहाँ पूरे रक्त से एचआईवी proviral डीएनए के एक सरल और तेजी से कागज आधारित डीएनए निष्कर्षण विधि मात्रात्मक पीसीआर द्वारा पता लगाया वर्णन है। इस प्रोटोकॉल अन्य आनुवंशिक मार्करों का पता लगाने या वैकल्पिक तरीकों का उपयोग कर प्रवर्धन में उपयोग के लिए बढ़ाया जा सकता है।
Abstract
फिना, न्यूक्लिक एसिड की छानने का अलगाव, एक उपन्यास निष्कर्षण विधि है जो एक अलग झिल्ली और शोषक पैड के माध्यम से खड़ी छानने का इस्तेमाल कम से कम 2 मिनट में पूरे रक्त से सेलुलर डीएनए निकालने के लिए है। रक्त नमूना डिटर्जेंट, मिश्रित संक्षिप्त के साथ इलाज किया गया और जुदाई झिल्ली को pipet से लागू किया जाता है। lysate, केशिका क्रिया के कारण सोख्ता पैड में wicks जुदाई झिल्ली की सतह पर जीनोमिक डीएनए कब्जा। निकाले डीएनए एक सरल धोने कदम जिसमें पीसीआर अवरोधकों शोषक सोख्ता पैड में दुष्ट हैं दौरान झिल्ली पर बनाए रखा है। झिल्ली फँस डीएनए युक्त फिर आगे की शुद्धि के बिना पीसीआर प्रतिक्रिया में जोड़ा जाता है। इस सरल विधि प्रयोगशाला के उपकरण की आवश्यकता नहीं है और आसानी से सस्ती प्रयोगशाला की आपूर्ति के साथ लागू किया जा सकता है। यहाँ हम जल्दी में के लिए एक मॉडल के रूप में 100 μl पूरे रक्त से अत्यधिक संवेदनशील पता लगाने और एचआईवी -1 Proviral डीएनए के quantitation के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णनएचआईवी के fant निदान है कि आसानी से अन्य आनुवंशिक लक्ष्य के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Introduction
कई रिपोर्टों उत्तम संवेदनशीलता और आणविक निदान की विशिष्टता सभी के लिए उपलब्ध बनाने के उद्देश्य से बिंदु का ख्याल (पीओसी) उपकरणों 1-5 में उपयोग के लिए कागज या झिल्ली आधारित निकासी तरीकों के विकास पर चर्चा की है। विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) यौन संचारित रोग निदान की पहल अवधि आश्वासन दिया (सस्ती, संवेदनशील, विशिष्ट, उपयोगकर्ता के अनुकूल है, तेजी से और मजबूत, उपकरण मुक्त और जो लोग यह जरूरत के लिए दिया) का वर्णन करने के लिए आदर्श एक पीओसी की विशेषताओं गढ़ा परीक्षा 6। इन दिशा निर्देशों का, उपकरण मुक्त विशेषता विशेष रूप से आणविक निदान के लिए प्राप्त करने के लिए चुनौतीपूर्ण है। हालांकि, इस क्षेत्र में हर नवाचार सबसे अधिक जरूरत है उन लोगों तक पहुँचने के लक्ष्य अग्रिम जाएगा, और वहाँ मौजूदा प्रौद्योगिकी 7 आदत डाल द्वारा परीक्षण के प्रदर्शन में निकट अवधि के सुधार के लिए आशा है।
यहाँ हम पूरे रक्त से डीएनए निकालने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णनकि जटिल रसायन शास्त्र या प्रयोगशाला इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकता नहीं है। फिना (न्यूक्लिक एसिड की निस्पंदन अलगाव) नमूना तैयार विधि मूल के क्रम में एक नमूना जवाब बिंदु का ख्याल (पीओसी) के हिस्से के रूप में मात्रात्मक पीसीआर एचआईवी -1 provirus पता लगाने के लिए पूरे रक्त से ल्युकोसैट डीएनए निकालने के लिए विकसित किया गया था (qPCR) जल्दी शिशु नैदानिक (ईद) सीमित संसाधन सेटिंग 8-11 में उपयोग के लिए मंच। फिना निकासी जो सिलिका झिल्ली या सिलिका लेपित समचुंबक कणों का उपयोग reversibly chaotropic एजेंटों 12 की उपस्थिति में डीएनए के लिए बाध्य करने के लिए पारंपरिक तरीकों शुद्धि से अलग है। इसके बजाय, फिना एक जुदाई झिल्ली के माध्यम से खड़ी छानने का काम करता सीधे पूरे रक्त से सेलुलर डीएनए निकालने के लिए। झिल्ली फँस डीएनए युक्त सीधे एक पीसीआर ट्यूब में रखा जा सकता है और या तो तुरंत एक पीसीआर प्रतिक्रिया या हवा बाद में प्रवर्धन 9 के लिए सूखे में इस्तेमाल किया। कोई chaotropic एजेंटों, फिनोल, या एल्कोहल नमूना निष्कर्षण में किया जाता है, eliminaटिंग व्यापक धोने कदम शक्तिशाली qPCR अवरोधकों निकालने की प्रक्रिया 13,14 से निकाली गई हटाने की जरूरत है।
फिना झिल्ली या तो कोशिकाओं 9 या जीनोमिक डीएनए नमूना झिल्ली में जोड़ा जाता है से पहले सेल 11 से आजाद कब्जा कर सकते हैं। सेल पर कब्जा के लिए, पूरे रक्त झिल्ली को सीधे जोड़ा जाता है। कोशिकाओं बाद में 10 मिमी NaOH जोड़कर झिल्ली में lysed रहे हैं। लाभ इस विधि के लिए है कि यह केवल 3 कदम शामिल है: 1) नमूना अलावा; 2) सेल / धोने और qPCR ट्यूब में 3) फिल्टर डिस्क स्थान। इस विधि को दोष यह है कि झिल्ली केवल सीधे झिल्ली डिस्क के व्यास के लिए आनुपातिक कोशिकाओं का एक निर्धारित संख्या में पकड़ कर सकते हैं। ईद के लिए आवश्यक पता लगाने की सीमा तक पहुँचने के लिए, पूरे रक्त के 100 μl नमूना इनपुट जो एक फिल्टर है कि बहुत बड़ी एक qPCR ट्यूब में रखा जा रहा है पर जोर देता लिए आवश्यक है। संग्रह करने के लिए नमूना जोड़ने से पहले साबुन से रक्त कोशिकाओं lysingझिल्ली एक प्रसंस्करण कदम कहते हैं, लेकिन एक ही नमूना आकार के लिए एक छोटे फिल्टर का उपयोग की अनुमति देता है। हम उच्च reproducibility, एक प्रति का पता लगाने, और इस परीक्षण विन्यास 11 का उपयोग रक्त के 100 μl से एचआईवी -1 Proviral डीएनए की प्रतियां के रूप में छोटा रूप में 10 की मात्रा का ठहराव प्रदर्शन करने में सक्षम थे।
इस रिपोर्ट में, हम फिना प्रोटोकॉल मूल रूप से प्रयोगशाला उपयोग के लिए विकसित रूप का वर्णन है। झिल्ली / फिल्टर सैंडविच फिना नमूना तैयार मॉड्यूल के रूप में जाना जाता है बड़े समूहों में तैयार किया और बाद में उपयोग के लिए खरीदकर भंडार जा सकता है। निकाले जाने की जब नमूने हैं इस प्रक्रिया को 2 मिनट लगते हैं और आकार बैचों में अलग किया जा सकता है। qPCR तुरंत चलाया जा सकता है या जब तक यह qPCR प्रदर्शन करने के लिए सुविधाजनक है एम्बेडेड डीएनए युक्त फिल्टर संग्रहित किया जा सकता है। इस विधि दोनों कम और उच्च संसाधन सेटिंग में नमूनों की दिनचर्या विश्लेषण के लिए बहुत सुविधाजनक है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
आचार बयान: इस अध्ययन में इस्तेमाल पूरे रक्त नमूनों मानव विषयों को शामिल अनुसंधान नहीं माना जाता है। नमूनों नैदानिक नैदानिक प्रयोजनों के लिए, जो संतुष्ट थे प्राप्त किया गया है, और इन नमूनों के शेष भाग फिना अनुसंधान परख के लिए प्रदान किया गया। नमूनों ऐसी है कि जांचकर्ताओं को आसानी से व्यक्तियों की पहचान का पता लगाने में सक्षम नहीं थे कोडित रहे थे।
1. फिना नमूना तैयार मॉड्यूल की तैयारी
- एक 35 x 35 मिमी 2.6 मिमी 2 मोटी 100% कपास पैड काटने से पैड सोख्ता तैयार करें। नमूने के अनुसार एक पैड कट।
- आयल फिल्म का एक टुकड़ा काटने से एक कागज समर्थन टेप और फिर एक हथौड़ा संचालित छेद पंच का उपयोग टेप के केंद्र में एक 7.14 मिमी व्यास छेद छिद्रण (25 मिमी (एच) 50 मिमी (डब्ल्यू) द्वारा) के साथ प्लास्टिक आयल फिल्म तैयार करें। नमूने के अनुसार एक टेप तैयार करें।
- एक 8.35 मिमी व्यास चक्र छिद्रण द्वारा एक ही गिलास रक्त विभाजक झिल्ली (कब्जा झिल्ली) डिस्क तैयारएक हथौड़ा संचालित छेद पंच का उपयोग। नमूने के अनुसार एक डिस्क पंच। डिस्क 2.3 माइक्रोन का एक कण प्रतिधारण क्षमता है।
- संदंश का उपयोग सोख्ता पैड के केंद्र में कब्जा डिस्क रखकर फिना नमूना तैयार मॉड्यूल इकट्ठा करो। कब्जा डिस्क पर आयल फिल्म टेप इतनी जगह है कि आयल टेप के छेद पर कब्जा उजागर डिस्क के केन्द्र छोड़ देता है।
- पैराफिन टेप थोड़ा खींच सोख्ता पैड कवर करने के लिए और डिस्क के सभी किनारों के आसपास सोख्ता पैड के लिए यह छड़ी करने के लिए मजबूती से पैराफिन टेप दबाकर डिस्क और सोख्ता पैड के बीच अधिकतम संपर्क सुनिश्चित।
- के रूप में प्रयोग या भविष्य में उपयोग के लिए भंडार के लिए आवश्यक के रूप में कई मॉड्यूल बनाने।
2. qPCR ट्यूब की तैयारी
- एक 5.1 मिमी टेप डिस्क कि qPCR ट्यूब की ओर करने के लिए सेल पर कब्जा झिल्ली लंगर होगा डबल लेपित polye का एक चक्र छिद्रण द्वारा प्रतिदीप्ति का पता लगाने अवरुद्ध से झिल्ली को रोकने के लिए तैयारटेप की एक चादर से एक हथौड़ा संचालित पंच के साथ नैदानिक टेप Ster। नमूने के अनुसार एक टेप डिस्क तैयार करें।
- टेप के स्टीकर लाइनर के एक तरफ निकालें। टेप एक 200 μl पीसीआर ट्यूब में रखें, एक पक्ष पर और ट्यूब के नीचे की ओर यह चिपके हुए। दूसरी स्टीकर लाइनर निकालें। ट्यूब अब तैयार डिस्क प्राप्त करने के लिए तैयार है।
- के रूप में प्रयोग या भविष्य में उपयोग के लिए भंडार के लिए आवश्यक के रूप में कई ट्यूबों का उत्पादन।
3. ईजाद रक्त नमूना
नोट: एक वास्तविक परीक्षण नमूना तैयार किया जा रहा है, तो चरण 4 पर आगे बढ़ें।
- पिघलना 8e5-लव कोशिकाओं 15 विषाणु विज्ञान गुणवत्ता आश्वासन प्रयोगशाला से प्राप्त एचआईवी -1 provirus की एक प्रति को शरण (VQA; रश प्रेस्बिटेरियन / सेंट ल्यूक के मेडिकल सेंटर, शिकागो, आईएल।)।
नोट: वे 4000 कोशिकाओं / μl की एकाग्रता में जमे हुए सेल छर्रों के रूप में जमा हो जाती है। कोशिकाओं की संख्या के रूप में पहले 9 वर्णित सत्यापित किया गया था। - सेवा को तैयारमध्यम (90% भ्रूण गोजातीय सीरम, 10% डाइमिथाइल sulfoxide) सांद्रता के लिए / μl 1 से 400 कोशिकाओं से लेकर ठंड में ial कमजोर पड़ने।
- एक microcentrifuge ट्यूब में धारावाहिक dilutions में से प्रत्येक से pipet 10 μl कोशिकाओं। 8e5-लव प्रतिलिपि संख्या 10-4,000 का एक मानक वक्र बनाने के लिए प्रत्येक ट्यूब ताजा एचआईवी -1 नकारात्मक EDTA में इलाज पूरे रक्त नमूने के 100 μl जोड़ें। धीरे ट्यूब का 5 गुना नीचे flicking द्वारा मिक्स।
4. फिना निष्कर्षण प्रदर्शन
- 1% (11 μl 10% ट्राइटन-X100 के अंतिम एकाग्रता के 110 μl पूरे रक्त और 3.3 कदम से कोशिकाओं) को ट्राइटन-X100) जोड़कर Lyse रक्त कोशिकाओं।
- धीरे ट्यूब का 5 गुना नीचे flicking द्वारा मिक्स। रक्त पारदर्शी लाल बारी चाहिए।
- Pipet कब्जा डिस्क पर रक्त नमूना के सभी।
नोट: पैराफिन टेप और कब्जा झिल्ली के बीच एक पानी तंग सील सुनिश्चित करता है कि रक्त झिल्ली के माध्यम से बहती है, और कब्जा मीटर के बीच अच्छे संपर्कembrane और सोख्ता पैड विधानसभा तेजी नमूना बाती सुनिश्चित करता है। - नमूना फिल्टर के माध्यम से सोख करने की अनुमति दें।
नोट: केशिका क्रिया के कारण सोख्ता पैड में रक्त lysate wicks, कब्जा डिस्क की सतह पर जीनोमिक डीएनए कब्जा। जब यह मैट प्रकट होता है lysate डिस्क में भिगो गया है। - कब्जा डिस्क पर 600-1,000 μl 10 मिमी NaOH बूंद के लिहाज से जोड़ें।
नोट: धो बफर भी 600 μl के एक थोक अतिरिक्त के रूप में जोड़ा जा सकता है। बफर हाइड्रोफोबिक आयल टेप पर एक छोटी बूंद के रूप में और लगभग 20 सेकंड में डिस्क के लिए छेद के माध्यम से बाती जाएगा। फिल्टर लाल से हीमोग्लोबिन का सफेद का संकेत निकासी के लिए बदल जाएगा। - संदंश के साथ सोख्ता पैड से डिस्क को अलग करें और तैयार पीसीआर ट्यूब में टेप करने के लिए डिस्क लागू होते हैं। अगर कोई लाल रंग फिल्टर पर छोड़ दिया है ट्यूब में रखने से पहले फ़िल्टर को खाली करने के लिए धोने बफर के 50-100 μl जोड़ें।
नोट: कभी कभी, अतिरिक्त दबाव की तैयारी के दौरान लागू कियाफिना मॉड्यूल सोख्ता पैड से अलग होने के दौरान झिल्ली परतों के विभाजन में परिणाम है। इन डिस्क त्यागें और एक ताजा नमूना तैयार करते हैं। - बाद फिल्टर पीसीआर ट्यूब में रखा गया है, नमूने सही दूर का विश्लेषण। वैकल्पिक रूप से, एक बॉक्स युक्त कैल्शियम सल्फेट अवशोषक में सूखी रातोंरात, तो विश्लेषण के लिए तैयार है जब तक टोपी और सिलिका अवशोषक और दुकान के साथ एक पन्नी थैली में जगह है।
5. qPCR रिएक्शन
- के रूप में पहले 9,11 वर्णित एचआईवी विशिष्ट प्राइमरों और जांच का उपयोग प्रतिक्रिया प्रति 100 μl qPCR मास्टर मिश्रण तैयार करें। एक आंतरिक प्रवर्धन नियंत्रण प्रवर्धन अवरोधकों की उपस्थिति के लिए नजर रखने के लिए और सत्यापित करने के लिए एक नकारात्मक नमूना एक सच्चे नकारात्मक है शामिल हैं। सुनिश्चित करें कि फिल्टर पूरी तरह से मास्टर मिश्रण के साथ और फिल्टर प्रतिक्रिया भर ट्यूब की ओर से तय रहता है कि कवर किया जाता है हो सकता है।
- एक वास्तविक समय पीसीआर डिवाइस का उपयोग कर के रूप में पहले 9 वर्णित प्रवर्धन प्रदर्शन करना।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
पूरे रक्त 8e5-लव कोशिकाओं के साथ नुकीला से proviral डीएनए निकालने के लिए कार्यप्रवाह चित्र 1 में दिखाया गया है। चित्रा 2 फिना नमूना मॉड्यूल पता चलता है और qPCR ट्यूब तैयार किया। के रूप में काल्पनिक नमूनों (चित्रा 3) के मानक की अवस्था में दिखाया गया है इस विधि, विभिन्न प्रतिलिपि संख्या में 8e5-लव कोशिकाओं से एचआईवी -1 provirus के कुशल प्रवर्धन के लिए अनुमति देता है। पीसीआर 103% की दक्षता क्षमता = -1 + 10 (-1 / ढलान) से गणना के रूप में था। लाइन के समीकरण R² = 0.996 के एक संबंध के साथ y = -3.25x + 27.95 था। एचआईवी proviral डीएनए मानक वक्र, प्रतिकृति के रूप में 1 टेबल में सबूत भी अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रवर्धन की है। इसके अतिरिक्त 500 प्रतियों की एक आंतरिक नियंत्रण Hydroxypyruvate रिडक्टेस कोई पीसीआर निषेध फिना के साथ खून निकालने से उत्पन्न संख्या की स्वतंत्र नहीं है कि दिखाने के लिए मौजूद है एचआईवी -1 वर्तमान provirus की प्रतियां (चित्रा 4)। आईसी प्रवर्धन कुशलता, परीक्षण सभी 18 नमूनों में प्राप्त हुई थी 21.92 ± 0.25 की औसत Cq और 1% की एक CV के साथ।
चित्रा 1: पूरे रक्त से proviral डीएनए का पता लगाने के लिए कार्यप्रवाह qPCR को 8e5-लव कोशिकाओं के साथ नुकीला। (ए) से खून के बाद कब्जा झिल्ली के लिए और बाद में धो बफर जोड़ा गया है जोड़ा जाता है, तैयार फिना मॉड्यूल सही करने के लिए छोड़ दिया है। QPCR मास्टर मिश्रण के साथ डबल लेपित टेप करने के लिए अटक कब्जा डिस्क के साथ (बी) qPCR ट्यूबों के लिए कहा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: फिना घर में मॉड्यूल और qPCR ट्यूब तैयारी। (ए) एक 8.35 एमएम व्यास कब्जा झिल्ली डिस्क एक वर्ग 707 सोख्ता पैड और आयल केंद्र में एक 7.14 एमएम व्यास छेद युक्त टेप की एक पतली चादर के बीच बैठा था कि इस तरह के पैराफिन टेप के छेद पर केंद्रित था pipet द्वारा lysed रक्त के सीधे आवेदन के लिए कब्जा डिस्क। (बी) एक 5.1 मिमी डबल लेपित पॉलिएस्टर नैदानिक टेप 200 μl qPCR ट्यूब के किनारे पर अटक गई है। टेप के दूसरे लाइनर जब तैयार कब्जा डिस्क को लागू करने के लिए चिपचिपा सतह को बेनकाब करने के लिए निकाल दिया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3:। एचआईवी -1 Proviral डीएनए नमूनों की काल्पनिक मानक वक्र (ए) प्रवर्धन भूखंडों 4 के 100 μl से प्राप्त प्रतिकृति एचआईवी -1 neपूरे रक्त 500 प्रतियां / आंतरिक नियंत्रण ठोस लाइनों = प्रवर्धन भूखंडों की प्रतिक्रिया के साथ 4,000, 400, 40 और 10 8e5-लव कोशिकाओं के साथ नुकीला gative; बिंदीदार रेखा दहलीज =। वाई अक्ष प्रतिदीप्ति यूनिट है और एक्स-अक्ष qPCR चक्र संख्या है। (बी) Cq मूल्यों के मानक घटता बनाम प्रति 100 μl पूरे रक्त 8e5-लव कोशिकाओं की लॉग प्रतिलिपि संख्या प्रवर्धन साजिश से गणना की थी। रेखा का समीकरण: y = -3.25x + 27.95; R² = 0.996; पीसीआर दक्षता = 103.23% दक्षता के माध्यम से गणना = -1 + 10 (-1 / ढलान) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4:। आंतरिक नियंत्रण कोई qPCR निषेध 500 प्रतियां Hydroxypyruvate रिडक्टेस प्रवर्धन नियंत्रण प्लाज्मिड प्रतिक्रिया प्रति जोड़ा इंगित करता है। ठोसलाइनों = प्रवर्धन भूखंडों; बिंदीदार रेखा दहलीज =। आईसी की औसत Cq = 21.92 ± 0.25। CQS 21.21 से 22.32 तक बताया गया। भिन्नता (सीवी%) के गुणांक 1% =; एन = 18. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| 8e5-लव कोशिकाओं / | |||
| 100 μl पश्चिम बंगाल | एवे सीक्यू | एसडी | सीवी (%) |
| 4000 | 16.27 | 0.14 | 1 |
| 400 | 19.54 | 0.15 | 1 |
| 40 | 22.56 | 0.3 | 1 |
| 10 | 24.83 | 0.15 | 1 |
तालिका 1: औसत सीक्यू, मानक विचलन (एसडी) और विभिन्नता का गुणांक (सीवी%) 4,000 के, 400, 40 और फिना निष्कर्षण और एचआईवी -1 विशिष्ट प्राइमरों और साथ 8e5-लव मानक वक्र की 10 प्रतियां जांच के। एन = 4. पश्चिम बंगाल = पूरे रक्त।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
तेजी से इलाज के लिए उपयोग करने के लिए जोड़ा ईआईडी एचआईवी संक्रमण के कारण 16 शिशु मृत्यु दर को कम करने के लिए प्रदर्शन किया गया है। एक शिशु के रक्त में मातृ एंटीबॉडी के हठ की वजह से, तेजी से एचआईवी एंटीबॉडी परीक्षण एचआईवी उजागर शिशुओं की स्थिति का निर्धारण करने में उपयोगिता सीमित है। डब्ल्यूएचओ की सिफारिश की गई है कि एचआईवी -1 सकारात्मक माताओं को जन्म सभी शिशुओं, उम्र के 4-6 सप्ताह में परीक्षण किया जाना चाहिए एक विषाणुजनित परीक्षा 17 का उपयोग कर। हम पूरे रक्त नमूनों में पता लगाने और एचआईवी -1 Proviral डीएनए के quantitation कि प्रदर्शन 100% संवेदनशीलता और 61 दक्षिण अफ्रीका के शिशुओं को 11 के एक छोटे से क्षेत्र के मूल्यांकन में विशिष्टता के साथ एक प्रति का पता लगाने में सक्षम है के लिए एक परख के विकास को सूचित किया है। एक सौ microliters या पूरे रक्त के अधिक उंगली या एड़ी छड़ी के माध्यम से एकत्र की है और फिना मॉड्यूल 18,19 के माध्यम से कार्रवाई की जा सकती। ये रक्त के नमूने फिर से पहले प्रवर्धन इस विधि आईडीई बनाने में कम से कम एक महीने के लिए भंडारित किया जा सकता हैशिशुओं कि प्रयोगशालाओं से दूर कर रहे हैं परीक्षण के लिए अल।
चित्रा 3, एचआईवी -1 नकारात्मक पूरे रक्त से काल्पनिक नमूनों में से एक मानक वक्र में प्रस्तुत अध्ययन में thawed कोशिकाओं एचआईवी -1 Proviral डीएनए को शरण देने में दर्शाया गया है साथ नुकीला। इस अध्ययन के लिए एक चेतावनी है कि कोशिकाओं के नमूने के लिए जोड़ा से कुछ पहले ही फ्रीज / पिघलना, जो संभावित लक्ष्य का पता लगाने के स्तर में सुधार हो सकता है के कारण lysed कर सकता है। एक और अधिक कठोर प्रयोगात्मक डिजाइन हौसले से संवर्धित कोशिकाओं जो अधिक सही पूरे रक्त का मजाक उड़ाया है | का उपयोग नमूना काल्पनिक के लिए हो गया होता।
फिना नमूना प्रस्तुत करने का विधि सीमित संसाधन सेटिंग 8 में इस्तेमाल के लिए एक ईआईडी पीओसी qPCR डिवाइस में समावेश (विकास) के तहत के लिए डिजाइन किया गया था; हालांकि, मैनुअल यहाँ वर्णित प्रारूप भी एक प्रयोगशाला का नमूना प्रस्तुत करने का पोर्टफोलियो के लिए एक उपयोगी इसके अतिरिक्त हो सकता है। फिना बाँध का उपयोग नहीं करता, धोने और डीआरआई में इस्तेमाल किया रणनीति eluteएड खून के धब्बे और अन्य कागज आधारित निकासी प्रणाली है कि निकाले न्यूक्लिक एसिड dilutes, संभवतः उप इष्टतम संवेदनशीलता का पता लगाने 5 के लिए अग्रणी। फिना प्रणाली अत्यंत लचीला है और आसानी इसके अलावा proviral एचआईवी डीएनए का पता लगाने अन्य आनुवंशिक परीक्षण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। रक्त या अन्य जैविक नमूनों की कम मात्रा कम प्रचुर मात्रा में लोगों के लिए प्रचुर मात्रा में लक्ष्य और अधिक मात्रा के लिए कार्रवाई की जा सकती है। फिना प्रणाली के बारे में हमारी मूल अवतार में, हम एक रक्त जुदाई झिल्ली का उपयोग कर पूरे रक्त से कोशिकाओं पर कब्जा और फिर 10 मिमी NaOH 9 के अलावा द्वारा उन्हें lyse। इस संस्करण में एक कम उपयोगकर्ता कदम का लाभ दिया है, लेकिन सेल नंबर / रक्त की मात्रा है कि कार्रवाई की जा सकती छोटा होता है। इस रिपोर्ट में प्रयुक्त बाध्य कांच झिल्ली के अलावा, अन्य रक्त जुदाई या रक्त संग्रह फिल्टर कागजात इस विधि के साथ सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है, और कई अलग अलग मात्रात्मक पीसीआर के साधन भी च में एम्बेडेड टेम्पलेट बढ़ाना दिखाया गया हैİlter डिस्क 9। शर्त सिर्फ यह है कि फिल्टर वास्तविक समय पीसीआर साधन की प्रतिदीप्ति पढ़ने ब्लॉक नहीं करता है।
फिना निकासी का एक महत्वपूर्ण सीमा पर कब्जा झिल्ली के व्यास पर एक आकार बाधा यह है कि वहाँ है। एक झिल्ली 9 मिमी की तुलना में बड़ा के साथ एक डिस्क ट्यूब जो सतह प्रतिक्रिया मिश्रण के संपर्क में क्षेत्र की सीमा में झिल्ली ओवरलैपिंग के बिना एक 200 μl qPCR ट्यूब में नहीं रखा जा सकता। इसके अतिरिक्त, बड़े डिस्क व्यास, अधिक qPCR प्रतिक्रिया मात्रा फिल्टर है जो लागत बढ़ जाती है को कवर किया और बारी के आसपास समय परख के लिए आवश्यक है। फिल्टर बहुत छोटा है कुशलता से नमूने में डीएनए पर कब्जा करने के लिए यह काफी कुशल धोने को रोकने रोकना सकता है।
बाध्य कांच कब्जा झिल्ली का प्रयोग, हम पूरे रक्त के नमूनों से ही एचआईवी -1 Proviral डीएनए और आरएनए नहीं वायरल कब्जा करने में सक्षम थे (डेटा) नहीं दिखाया। हम वैकल्पिक झिल्ली या बफ़र्स टी इस्तेमाल किया जा सकता है अगर पता नहीं हैओ के बजाय या डीएनए के अलावा शाही सेना के अलगाव को बढ़ावा देने के। इस प्रोटोकॉल पाठक ही नमूना से डीएनए को अलग करना चाहते है तो कुछ प्रोटोकॉल के साथ आवश्यक आरएनए के enzymatic हटाने की आवश्यकता नहीं है। नैदानिक नमूनों में पता लगाने के लिए दोनों एचआईवी -1 आरएनए और डीएनए ईद के प्रति संवेदनशीलता और आरएनए का पता लगाने की इस कमी में सुधार होगा हमारे नैदानिक परीक्षण की एक सीमा है।
एक नए परख करने के लिए फिना प्रक्रिया अनुकूल ढालने में सबसे महत्वपूर्ण कदम फिल्टर के आकार को मान्य करने के लिए डीएनए, यानी, कोशिकाओं की संख्या की राशि को समायोजित करने के लिए, नमूना में परीक्षण किया जा रहा है। तो यह है कि छोटे कब्जा डिस्क इस्तेमाल किया जा सकता सामान्य फिना निष्कर्षण में कोशिकाओं की छोटी संख्या के साथ नमूनों के साथ सबसे अच्छा काम करता है। फिल्टर के बंधन क्षमता का निर्धारण करने के लिए, बस नीचे दिए गए संग्रह झिल्ली खड़ी फिना मॉड्यूल के लिए एक दूसरा फिल्टर डिस्क जोड़ें। नमूना जोड़ें और कदम 4.1-4.5 में के रूप में झिल्ली धो लें। डीएनए कब्जा डिस्क की एक अलग qPCR ट्यूब और amp में रखेंlify। एक मानक वक्र का प्रयोग, इनपुट डीएनए प्रत्येक फिल्टर पर कब्जा कर लिया प्रतिशत का निर्धारण। फिल्टर का आकार परख की जरूरतों के लिए अनुकूलित किया जा सकता। यहाँ वर्णित फिना proviral डीएनए परख के लिए, मानव जीनोमिक डीएनए के 99% से अधिक है जब सेल lysate फिल्टर (अप्रकाशित टिप्पणियों) बेहतर पहचान क्षमता को सक्रिय करने के लिए जोड़ा गया है पर कब्जा कर लिया है।
ईआईडी के अलावा, फिना के भविष्य के अनुप्रयोगों का पता लगाने और रोगियों को जो एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी के कारण वायरल दमन हासिल किया है के साथ एचआईवी -1 रोग निगरानी के लिए एक बायोमार्कर के रूप में proviral डीएनए के quantitation शामिल हो सकते हैं। एचआईवी उन्मूलन के उद्देश्य से उपचार निगरानी एचआईवी -1 से संक्रमित कोशिकाओं के जलाशयों के लिए परिधीय रक्त के अलावा अन्य सामग्री स्क्रीनिंग द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है। एचआईवी परीक्षण proviral भी सच संक्रमण के लिए टीका परीक्षण विषयों स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। रक्त के नमूने फिना मॉड्यूल पर भंडारण के दौरान स्थिर हैं और सीई करने के लिए बाद में लदान के लिए क्षेत्र की स्थिति के तहत एकत्र किया जा सकतापीसीआर विश्लेषण महामारी विज्ञान के अध्ययन के लिए इस विधि आदर्श बनाने के लिए ntral प्रयोगशालाओं। एचआईवी -1 का पता लगाने के अलावा, इस अत्यधिक लचीला विधि को भी इस तरह के फार्माकोजेनेटिक्स स्क्रीनिंग या अन्य एसएनपी का पता लगाने के रूप में या पशु मॉडल का तेजी से जीनोटाइपिंग के लिए जैविक नमूनों में पाया सटीक दवा लक्ष्यों को बढ़ाना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ऐसे helicase निर्भर प्रवर्धन (HDA) या पाश की मध्यस्थता इज़ोटेर्माल प्रवर्धन (दीपक) के रूप में इज़ोटेर्माल प्रवर्धन तरीकों में भी फिना के साथ प्रयोग किया जा सकता है टेम्पलेट निकाले या डीएनए एम्बेडेड फिल्टर पर पारंपरिक पीसीआर प्रवर्धन के लिए टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fusion 5 | GE Healthcare Life Sciences | 8151-9915 | |
| 707 blotting pad | VWR International | 28298-014 | |
| PARAFILM M | VWR International | 52858-000 | |
| 3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape | 3M Medical Specialties | 9965 | |
| 200 µl qPCR strip tubes | Agilent | 401428 | |
| optical strip caps | Agilent | 401425 | |
| Mx3005p qPCR System | Agilent | 401456 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | A.C.S. Reagent |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | BioXtra |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | for molecular biology |
| fetal bovine serum, certified, U.S. origin | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Hammer driven small hole punch 3/16" hole diameter (5.1 mm) | McMaster Carr | 3424A16 | |
| Hammer driven small hole punch 1/4" hole diameter (7.14 mm) | McMaster Carr | 3424A19 | |
| Hammer driven small hole punch 5/16" hole diameter (8.35 mm) | McMaster Carr | 3424A23 |
References
- Byrnes, S. A., et al. One-step purification and concentration of DNA in porous membranes for point-of-care applications. Lab Chip. 15 (12), 2647-2659 (2015).
- Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. "Paper Machine" for Molecular Diagnostics. Anal Chem. 87 (15), 7595-7601 (2015).
- Govindarajan, A. V., Ramachandran, S., Vigil, G. D., Yager, P., Bohringer, K. F. A low cost point-of-care viscous sample preparation device for molecular diagnosis in the developing world; an example of microfluidic origami. Lab Chip. 12 (1), 174-181 (2012).
- Linnes, J. C., et al. Paper-based molecular diagnostic for. RSC Adv. 4 (80), 42245-42251 (2014).
- Rodriguez, N. M., et al. Paper-Based RNA Extraction, in Situ Isothermal Amplification, and Lateral Flow Detection for Low-Cost, Rapid Diagnosis of Influenza A (H1N1) from Clinical Specimens. Anal Chem. 87 (15), 7872-7879 (2015).
- Peeling, R. W., Holmes, K. K., Mabey, D., Ronald, A. Rapid tests for sexually transmitted infections (STIs): the way forward. Sex Transm Infect. 82, Suppl 5 1-6 (2006).
- Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. Diagnostics for the developing world. Nat Rev Microbiol. 2 (3), 231-240 (2004).
- Jangam, S. R., Agarwal, A. K., Sur, K., Kelso, D. M. A point-of-care PCR test for HIV-1 detection in resource-limited settings. Biosens Bioelectron. 42, 69-75 (2013).
- Jangam, S. R., Yamada, D. H., McFall, S. M., Kelso, D. M. Rapid point-of-care extraction of human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA from whole blood for detection by real-time PCR. J Clin Microbiol. 47 (8), 2363-2368 (2009).
- Kelso, D. M., Jangam, S., Yamada, D., McFall, S. Google Patents. , (2012).
- McFall, S. M., et al. A Simple and Rapid DNA Extraction Method from Whole Blood for Highly Sensitive Detection and Quantitation of HIV-1 Proviral DNA by Real-Time PCR. Journal of Virological Methods. 214, 37-42 (2015).
- Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).
- Radstrom, P., Knutsson, R., Wolffs, P., Lovenklev, M., Lofstrom, C. Pre-PCR processing: strategies to generate PCR-compatible samples. Mol Biotechnol. 26 (2), 133-146 (2004).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).
- Folks, T. M., Powell, D. M., Martin, M. A. Google Patents. , (1991).
- Violari, A., et al. Early Antiretroviral Therapy and Mortality among HIV-Infected Infants. N Engl J Med. 359 (21), 2233-2244 (2008).
- World Health Organization. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2010).
- Gruner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. Dried blood spots--preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques. J Vis Exp. (97), (2015).
- Maiers, T. J., et al. An investigation of fingerstick blood collection for point-of-care HIV-1 viral load monitoring in South Africa. S Afr Med J. 105 (3), 228-231 (2015).
